基于細胞膜脂肪酸調控提高乳桿菌凍干存活率

錢志浩，崔樹茂，唐鑫，毛丙永，趙建新，陳衛

(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)

乳桿菌是益生菌的重要組成部分，常見的乳桿菌有植物乳桿菌、干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、羅伊氏乳桿菌[1]等。它是一類優良的益生菌，具有維持腸道菌群穩態、緩解便秘與腹瀉、提高免疫力、拮抗病菌、治療炎癥等益生功能[2]，與人類的健康息息相關[3]，越來越多的被應用于食品、藥品、飼料等領域。

乳桿菌在體內產生益生作用需要達到較高的活菌數[4]，所以微生態制劑一般采用冷凍干燥的生產工藝制備成菌粉來保證益生效果。提高乳桿菌的凍干存活率主要有兩類方法[5-6]，一是優化凍干保護劑及凍干工藝參數[7]；二是調整菌株的生理狀態使其更容易在冷凍干燥的過程中存活下來。

與微生物凍干存活率相關的生理狀態主要有形態大小、莢膜多糖、胞內相容性物質及細胞膜組成等幾個方面。在乳桿菌冷凍干燥條件下，這些因素均會對最終的存活率造成影響。一般認為細菌的凍干存活率與形態大小存在聯系，單個細胞體積小、接近球型形態的細菌凍干存活率高；而單個細胞體積大，呈不規則形態的細菌存活率較低[8]。胞外多糖的產生被認為是有利于提高凍干存活率的因素[9]，胞內相容性物質的積累能提高凍干存活率[10]，細胞膜脂肪酸組成的復雜變化被認為與凍干存活率密切相關。大量研究表明，細菌能夠通過細胞膜成分的改變有效提高在冷凍干燥及其他不良環境中的存活率[11]。但是什么樣的細胞膜組成更有利于乳桿菌的凍干存活、通過什么手段可以改變乳桿菌的細胞膜脂肪酸組成從而提高菌的凍干存活率，目前缺乏系統的研究。

本研究旨在通過分析乳桿菌細胞膜組成差異以及其與凍干存活率的聯系，得到凍干存活率較高的乳桿菌的細胞膜組成特征。并研究和比較幾種調控細胞膜脂肪酸組成的有效方法，為提高乳桿菌凍干菌粉的質量提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

1.1.1 菌株

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)CCFM259、干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)15m11、短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)173-1-2、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)FAHHBO1、FJND，江南大學食品生物技術中心菌種保藏中心。

1.1.2 試劑

蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、無水葡萄糖、無水乙酸鈉、七水合硫酸鎂、一水合硫酸錳、檸檬酸氫二鈉、無水磷酸氫二鉀、吐溫20、吐溫80、濃硫酸、蒽酮、甲醇鈉甲醇溶液、正己烷，國藥集團化學試劑有限公司；低聚異麥芽糖，上海博飛美科有限公司；食品級膠原蛋白，河北潤盈生物科技有限公司；谷胱甘肽，上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

高速冷凍離心機，Eppendorf公司；GRP-9080型隔水式恒溫培養箱，上海森信實驗儀器有限公司；FE20型pH計、EL3002型電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；MS 3 basic型渦旋振蕩器，德國IKA公司；MLS-3750型高溫高壓滅菌鍋，日本SANYO公司；ZHJH-C1115B型超凈工作臺，上海智誠分析儀器制造有限公司；Freeze-dryer Lyobeta 5PS雙腔體凍干機，西班牙Telstar公司；KA92 NV02TI低溫冰箱，日本西門子；UV-2450紫外分光光度計、GCMS-QP2010 Ultra單四級桿氣相色譜質譜聯用儀，日本島津公司；JY92-IIDN超聲波儀，寧波新芝；BA410E正置生物顯微鏡，香港麥克奧迪有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 乳桿菌的活化和培養

從-80 ℃冰箱中取出保菌管、在mMRS固體平板上劃線，37 ℃培養48 h后長出較大的菌落。使用接種環挑取較大的單菌落至5 mL液體mMRS試管活化2代，每代培養12～14 h，獲得較強活力的種子液。

高活力乳桿菌種子液以1%的接種量接種至mMRS液體培養基中，37 ℃恒溫培養12 h至穩定期收菌。保證接種量、培養時間、培養狀態一致。

mMRS液體培養基[12](g/L)：蛋白胨10.0，牛肉膏10.0，葡萄糖20.0，酵母粉5.0，乙酸鈉2.0，無水磷酸氫二鉀2.0，檸檬酸氫二胺2.0，硫酸鎂0.1，硫酸錳0.05，pH(6.2±0.2)。

1.3.2 乳桿菌形態大小的測定

取培養時間一致的乳酸菌，進行革蘭氏染色，在裝配DFC425C攝像頭的萊卡顯微鏡下鏡檢。隨機取形態大小具有代表性的，視野中央的100個菌體用顯微鏡自帶的Leica Qwin V3測定長度和寬度，計算其平均值作為該菌株的長和寬。將乳桿菌看成兩端是相等的均勻半球，中間是標準圓柱體，估算其面積用于表示乳桿菌大小,如公式(1)所示:

S=4 πr2+2 πrl2

(1)

式中：S，單個乳桿菌菌體表面積，μm2；r，乳酸菌桿的半徑，μm；l，乳桿菌的高度，μm。

1.3.3 乳桿菌的凍干工藝和凍干保護劑

收取培養至穩定期的乳桿菌液體培養基，培養時間與測定形態大小的收菌時間一致，8 000×g(15 min)離心，去上清液收獲菌泥。將菌泥與凍干保護劑溶液按1∶1(g∶mL)混勻后調pH值至6.4左右，振蕩至充分均勻后取1 mL分裝至西林瓶。凍干保護劑配方與凍干工藝參照譚莎莎等[13]的方法。

凍干保護劑(g/100mL)：低聚異麥芽糖21.49，膠原蛋白7.16，硫酸鎂0.6，谷胱甘肽0.45，硫酸錳0.3。

凍干工藝：板層預冷，放入裝有乳桿菌的西林瓶，降溫至-50 ℃，預凍保持4 h；一次干燥，控制層板溫度-30 ℃、真空度200 μbar，保持24 h；二次干燥，控制層板溫度25 ℃、真空度5 μbar，保持18 h。

1.3.4 乳桿菌的凍干存活率計算

平板菌落計數法：取0.5 mL菌液以生理鹽水10倍依次梯度稀釋至3個合適稀釋度，各取1 mL稀釋液注入無菌培養皿，將已融化并冷卻至45 ℃左右的培養基傾注15 mL至培養皿中，立即放在桌上手動搖晃混勻，每個稀釋度做3個平行，凝固后倒置于37 ℃培養箱，培養完成后挑選菌落數在30～300 CFU/mL的平板進行活菌計數如公式(2)所示:

(2)

1.3.5 乳桿菌的莢膜多糖的檢測

硫酸蒽酮法測量菌株莢膜多糖含量，0.2 g蒽酮溶于100 mL濃硫酸混勻冷卻。用100 μg/mL葡萄糖標準溶液配制0、10、20、30、40、60、80 μg/mL的葡萄糖溶液，取不同濃度葡萄糖溶液各1 mL加4 mL硫酸蒽酮，一起沸水浴10 min后冷卻在620 nm處測定吸光值。以葡萄糖含量(μg)作為橫坐標、吸光度作為縱坐標做標準曲線。

乳桿菌以1%的接種量接至mMRS液體培養基中，37 ℃恒溫培養12 h后8 000×g(10 min)離心，去上清液。稱取1 g菌泥，生理鹽水洗滌后再以8 000×g(10 min)離心，去掉上清液。菌泥用生理鹽水溶解，冰水浴下低功率81 W超聲3 min輔助剝除莢膜[14]，12 000×g、4 ℃、10 min離心收集上清液。上清液1 mL+4 mL硫酸蒽酮一起沸水浴10 min后冷卻，在620 nm處測定吸光值。吸光值對應標準曲線計算單位菌體莢膜多糖含量,如公式(3)所示：

單位菌體莢膜多糖含量/(mg·CFU-1)=

(3)

1.3.6 乳桿菌的細胞膜脂肪酸的檢測

細胞膜脂肪酸的提取：乳桿菌以1%的接種量接至mMRS液體培養基中，37 ℃恒溫培養12 h后8 000×g(10 min)離心，去上清液。用8.5 g/L無菌生理鹽水洗滌離心(6 000×g、4 ℃、15 min)3次，棄掉上清液，稱取菌泥0.5 g。然后向得到的菌泥中加入1.5 mL濃度為1 mol/L甲醇鈉的甲醇溶液劇烈振蕩1.5 min，置于4 ℃靜置10 min。加入1 mL的正己烷溶液，振蕩1 min，靜置5 min，在6 000×g離心5 min后，吸取上清液，用有機系濾頭過濾，制得的樣品置于氣相瓶內然后進行脂肪酸含量的測定[15]。

氣相條件：用GC-MS分析細胞膜脂肪酸的組成與含量，毛細管柱0.25 mm×30 m×0.25 μm，載氣為高純氦氣，進樣量為1 μL，不分流進樣。進樣口溫度240 ℃，柱流速1 mL/min，柱起始溫度為160 ℃，以5 ℃/min升溫至190 ℃保持5 min，再以2 ℃/min升溫至220 ℃，保持5 min。

1.3.7 乳桿菌的胞內甜菜堿的檢測

甜菜堿提取[16]：按1.3.1的方法培養乳桿菌12 h至穩定期，8 000×g(10 min)離心得菌泥，取1 g濕菌泥用生理鹽水洗滌2遍。加10%(體積分數)高氯酸振蕩10 min，KOH調至pH值為7。12 000 ×g離心20 min取上清液，用0.22 μm無機濾膜過濾后定容至20 mL后檢測。

液相色譜條件：色譜柱:X Bridge Amide(4.6 mm×250 mm，3.5 μm)；流動相∶V(乙腈)∶V(水)=85∶15；檢測波長:195 nm；流速:1.0 mL/min;柱溫:30 ℃；進樣量:10 μL，14 min左右出峰,甜菜堿含量計算如公式(4)所示：

(4)

式中：m，單位菌體的胞內甜菜堿含量，mg；c，甜菜堿質量濃度，μg/mL；N，菌體的活菌數，CFU/mL。

1.3.8 調控乳桿菌細胞膜脂肪酸組成的培養方式

本實驗采用4種不同的培養方式(酸脅迫、冷脅迫、添加吐溫80、添加吐溫20)，從而探究不同的培養方式對細胞膜脂肪酸組成的影響以及細胞膜脂肪酸組成與凍干存活率的聯系。

酸脅迫實驗[17]：活化過的乳桿菌按1%的接種量在mMRS培養基中培養12 h至穩定期，8 000×g(15 min)離心收集菌泥重懸于pH 3.5的mMRS培養基中酸應激4 h，得到的菌體進行后續的冷凍干燥和細胞膜脂肪酸組成分析。

冷脅迫實驗[18]：活化過的乳桿菌按1%的接種量在mMRS培養基中培養12 h至穩定期，置于4 ℃條件下冷應激2 h，得到的菌體進行后續的冷凍干燥和細胞膜脂肪酸組成分析。

添加吐溫80培養[19]：在mMRS液體培養基中添加2 mL/L的吐溫80，活化過的乳桿菌按1%的接種量在含過量吐溫80的液體培養基中培養12 h至穩定期，得到的菌體進行后續的冷凍干燥和細胞膜脂肪酸組成分析。

添加吐溫20培養：在mMRS液體培養基中添加2 mL/L的吐溫20，活化過的乳桿菌按1%的接種量在含過量吐溫20的液體培養基中培養12 h至穩定期，得到的菌體進行后續的冷凍干燥和細胞膜脂肪酸組成分析。

1.4 數據統計與分析

試驗中每個實驗值均是3次平行實驗的平均值。不同組之間的顯著性差異采用IBM SPSS Statistics 22.0軟件進行ANOVA分析(DUNCAN檢驗)，P<0.05 則認為差異顯著；采用Graphpad 8.01進行生長曲線和柱形圖的繪制。

2 結果與分析

2.1 形態統一的乳桿菌表面物質和相容性物質檢測

乳桿菌的凍干存活率受到多個因素的影響，主要包括形態大小、胞外表面物質的產生、胞內相容性物質的積累以及細胞膜脂肪酸的組成等[20]。為了重點研究細胞膜脂肪酸對乳桿菌凍干存活率產生的影響，首先系統分析了江南大學食品生物技術中心菌種保藏中心不同乳桿菌的形態大小、胞外多糖及胞內相容性溶質，然后從中篩選這些條件一致的乳桿菌進一步研究乳桿菌細胞膜脂肪酸組成特征對乳桿菌凍干存活率的影響及細胞膜脂肪酸組成的調控方法。

通過篩選得到5株形態一致的不同種屬的乳桿菌，如表1所示。5株乳桿菌形態大小相近，長寬比為3左右，呈典型的桿菌形態。單個桿菌表面積在3 μm2左右，差異較小，不會因形態大小對凍干存活率造成較大差異。

表1 實驗中乳桿菌的形態大小、莢膜多糖、胞內甜菜堿濃度Table 1 The morphology，capsular polysaccharide and the glycine betaine of the selected Lactobacillus

前期研究表明，乳桿菌表面物質的產生過量時，會降低凍干保護劑對乳桿菌的保護效率，導致菌體凍干存活率降低；乳桿菌胞外多糖含量<10-11mg/CFU這個水平時，不會影響菌的凍干存活率[17]。本研究篩選出的5株乳桿菌莢膜多糖產量均<10-12mg/CFU，不會對乳桿菌凍干存活率造成明顯影響。

選擇最具代表性的相容性溶質甘氨酸甜菜堿表示胞內相容性溶質含量，相容性溶質的積累差異一般在高滲有外源物質補充的環境下發生[21]，實驗中的乳桿菌在mMRS培養基培養條件下胞內相容性溶質甘氨酸甜菜堿含量很低，遠達不到影響凍干存活率的程度。

綜上，經篩選所得5株乳桿菌：干酪乳桿菌15m11、植物乳桿菌CCFM259、鼠李糖乳桿菌FJND、鼠李糖乳桿菌FAHHBO1、短乳桿菌173-1-2形態大小差異較小、胞外多糖及相容性溶質不足以影響凍干存活率，通過這5株乳桿菌進行后續的細胞膜脂肪酸研究。

2.2 不同乳桿菌的細胞膜脂肪酸組成

在相同的培養條件下培養5株乳桿菌，利用GC-MS分析了乳桿菌細胞膜脂肪酸的具體組成(表2)。并根據乳桿菌的組成比例(圖1)及平均鏈長等特征對5株乳桿菌的細胞膜脂肪酸組成進行比較分析。

表2 實驗乳桿菌菌株的細胞膜脂肪酸組成及相對含量 單位：%

由表2可知，乳桿菌脂肪酸組成的主要成分為飽和脂肪酸十六烷酸(C16∶0)、不飽和脂肪酸十八烯酸(C18∶1)和環丙烷脂肪酸(cycC19∶0)，3種主要的成分占總脂肪酸的80%以上，十六烯酸(C16∶1)和十八烷酸(C18∶0)含量較低不超過10%。不同乳桿菌細胞膜脂肪酸的組成有較大差異，鼠李糖乳桿菌FJND的不飽和度最低為(54.01±0.10)%，平均鏈長最長達到17.39±0.01。干酪乳桿菌15m11和短乳桿菌173-1-2的不飽和度較高，分別為(63.25±0.12)%以及(64.14±0.13)%，平均鏈長分別為17.21±0.01 和17.30±0.01。細胞膜的不飽和度及鏈長會影響細胞膜在冷凍干燥這個不良環境中的流動性，從而影響凍干存活率，一般認為高不飽和度低鏈長的脂肪酸組成具有較高的膜流動性[22]，細菌有利用脂肪酸組成改變細胞膜以應對環境壓力，確保細胞膜保持最佳的狀態和持續的功能。極地環境中的嗜冷微生物的不飽和度往往可以達到95%以上[23]，從而在低溫下能存活繁殖。乳桿菌在37 ℃正常培養條件下不飽和度被調控為約55%～65%，通過環境的擾動及添加過量的脂肪酸可以使正常的細胞膜受到擾動，令細胞膜脂肪酸組成發生改變來適應環境的變化。

2.3 細胞膜脂肪酸組成對凍干存活率的影響

5株乳桿菌凍干存活率見表3，在完全相同凍干工藝下5株乳桿菌的凍干存活率有較大差異，由于整個培養以及凍干保護劑都保持一致，形態、胞內外物質的干擾也較小，存活率的差異很大程度上來自于細胞膜脂肪酸的差異。一般而言，較長的鏈長增加了雙分子層間酰基鏈的相互作用，促進了更緊密的結構，較短的鏈跨越的疏水雙層結構域較少，受鏈間力的限制也較少，有助于更流動的結構。不飽和脂肪酸中的雙鍵通過增加鏈的體積和旋轉自由度來減少鏈的相互作用[24]，酰基鏈長和飽和度共同影響細胞膜的流動性，而流動性會影響冷凍干燥過程中膜相變的發生和膜損傷的程度[25]。根據實驗中乳桿菌細胞膜脂肪酸組成分析可知，鼠李糖乳桿菌FJND細胞膜不飽和度最低，鏈長最長，結果其凍干存活率表現較差。干酪乳桿菌15m11和鼠李糖乳桿菌FAHHBO1不飽和度較高，鏈長較短，表現出了較理想的凍干存活率，這與普遍認為的高不飽和度低鏈長的脂肪酸組成有利于細胞膜維持流動性相符。乳桿菌細胞膜脂肪酸不飽和度>60%、平均鏈長<17.30時,乳桿菌存活率較高，推測是由于這個范圍內的乳桿菌細胞膜流動性較好，在冷凍干燥過程中受到較小的損傷。實驗中短乳桿菌173-1-2的不飽和度為(64.14±0.13)%，平均鏈長17.31，但存活率較低，僅有(41.87±1.44)%，可能在沒有分析到的應激蛋白表達、DNA分子受損修復上存在問題，本文將繼續研究通過提高不飽和脂肪酸的含量是否可以提高其凍干存活率。

表3 實驗乳桿菌菌株的凍干存活率 單位：%

a-乳桿菌細胞膜脂肪酸組成比例；b-乳桿菌細胞膜脂肪酸平均鏈長圖1 實驗中乳桿菌脂肪酸組成比例和細胞膜脂肪酸平均鏈長Fig.1 The composition of cell membrane fatty acid and average chain length of Lactobacillus注：組間不同字母表示具有顯著性差異(P<0.05)(下同)

2.4 細胞膜脂肪酸調控及其對乳桿菌凍干存活率的影響

經過上述的細胞膜脂肪酸組成以及凍干存活率的分析，結果表明乳桿菌細胞膜的組成會影響最終的凍干存活率。對乳桿菌來說，高不飽和度和低鏈長的細胞膜脂肪酸組成有利于最終的凍干存活。鼠李糖乳桿菌FJND和短乳桿菌173-1-2的凍干存活率較低，考慮是否可以通過環境營養、環境應激手段調節細胞膜脂肪酸組成從而提高乳桿菌凍干存活率。有研究表明，很多因素都能改變脂質組成進而影響細胞膜流動性；包括溫度、化學物質、離子、壓力、營養物和微生物培養物的生長階段[26]。吐溫20是外源月桂酸(C12∶0)補充劑，吐溫80是外源油酸(C18∶1)補充劑，被報道可以改變細胞膜脂肪酸組成[27]。酸應激、冷應激[28]也均有報道能提高乳桿菌不飽和度，改變細胞膜流動性。然而通過這些因素調節細胞膜脂肪酸組成的效果如何，哪種調節細胞膜脂肪酸的手段最適合用在乳桿菌凍干工藝中應用還沒有具體的比較總結。本實驗選擇了較溫和并且破壞性較小的調控手段，研究環境應激以及外源脂肪酸添加分別對細胞膜脂肪酸組成和存活率的影響。

2.4.1 環境應激對細胞膜脂肪酸組成的改變

乳桿菌通過冷應激和酸應激處理后，細胞膜脂肪酸會有小幅度的改變，冷應激能略微提高乳桿菌的不飽和度，酸應激對細胞膜脂肪酸組成影響很小。2種應激處理均沒有很明顯的凍干存活率的提升，其中鼠李糖乳桿菌FJND經過冷應激和酸應激處理后凍干存活率從(45.22±1.54)%分別提高到(45.84±4.11)%和(50.52±1.24)%，短乳桿菌173-1-2經過冷應激與酸應激處理后凍干存活率還發生了下降，這與預期的實驗結果有所差別，猜測是應激雖然略微提高了細胞膜脂肪酸不飽和度但是乳桿菌在應激過程中產生了不可逆的損傷，最終的存活率發生下降。

如圖2所示，冷應激、酸應激造成的細胞膜飽和度改變很小，鏈長基本不會發生改變，這是由于環境應激對細胞膜產生擾動后，細胞膜開始改變脂肪酸合成朝著更適合應激環境的方向改變[29]，由于環境中沒有充足的現成脂肪酸，乳桿菌需要通過延長酶及去飽和酶從頭合成或者改變脂肪酸的結構，這個過程通常是比較緩慢的，因此通過冷應激、酸應激處理的乳桿菌飽和度及鏈長并沒有很大的改變，凍干存活率也無顯著提高。

2.4.2 添加外源脂肪酸對細胞膜脂肪酸組成的改變

由表4可知，過量添加富含月桂酸的吐溫20之后細胞膜組成中出現了本不存在的月桂酸，過量添加富含油酸的吐溫80細胞膜脂肪酸中油酸的比例大大提高，說明乳桿菌可以利用環境中現成的脂肪酸調節自身脂肪酸組成。2種脂肪酸的添加均提高了乳桿菌的凍干存活率，月桂酸的添加造成了不飽和度的降低，但是同時造成了平均鏈長顯著的降低，最終凍干存活率有較小幅度的提升。由圖3可知，外源油酸的添加極大的提高了不飽和度，平均鏈長稍有增加，最終的凍干存活率提升較大，鼠李糖乳桿菌FJND的凍干存活率從(45.22±1.54)%提升至(59.63±1.55)%，而短乳桿菌173-1-2凍干存活率從(41.87±1.44)%提升至(60.72±1.15)%。

圖3 不同處理后乳桿菌凍干存活率變化Fig.3 Changes of survival rate of lyophilized Lactobacillus after different treatments

表4 營養和應激對鼠李糖乳桿菌FJND和短乳桿菌173-1-2細胞膜脂肪酸組成影響 單位：%

通過過量添加外源脂肪酸的方法培養，乳桿菌的飽和度范圍、鏈長范圍會發生很大的改變，而冷應激、酸應激造成的細胞膜飽和度改變很小，鏈長基本不會發生改變。因此，通過調控細胞膜脂肪酸組成提高乳桿菌的凍干存活率，采取添加外源脂肪酸的方法能比應激處理獲得更加理想的效果。

a-總不飽和脂肪酸變化；b-鏈長變化圖2 乳桿菌總不飽和脂肪酸及鏈長的變化Fig.2 Changes of total unsaturated fatty acids and chain length in Lactobacillus

3 結論

不同乳桿菌的細胞膜脂肪酸不飽和度與鏈長具有差異，且會影響菌體的凍干存活率。高不飽和度、低平均鏈長的脂肪酸組成更有利于乳桿菌在冷凍干燥的環境下存活。添加外源脂肪酸或環境應激后，乳桿菌細胞膜脂肪酸組成會產生改變，細胞膜脂肪酸組成的改變可以顯著提升乳桿菌的凍干存活率。低溫、酸等應激對乳桿菌細胞膜脂肪酸影響較小，通過應激處理乳桿菌凍干存活率的變化不顯著。而通過添加外源脂肪酸的方式會使乳桿菌飽和度和鏈長均發生較大的改變，存活率會產生較明顯的提升。添加2 mL/L的吐溫80后，乳桿菌不飽和度明顯提高，平均鏈長略微提高，凍干存活率顯著提高；添加2 mL/L的吐溫20后，乳桿菌不飽和度和平均鏈長均顯著下降，凍干存活率略微提升。