牡蠣過敏原肌漿鈣結合蛋白的分離純化和鑒定

程青麗，李國明，趙曉涵，馮曉文，盧知浩，谷瑞增，魯軍，劉文穎

(中國食品發酵工業研究院，北京市蛋白功能肽工程技術研究中心，北京，100015)

水產品是蛋白質、無機鹽和維生素的良好來源，尤其是蛋白質含量豐富，是人類攝取動物性蛋白的重要食品來源之一，一直被世界各國公認為營養、美味的放心食品。隨著經濟全球化不斷加深，會有越來越多的消費者對水產品產生習慣性消費。

然而水產品帶來的過敏問題也是層出不窮，大多數的過敏反應屬于Ⅰ型免疫球蛋白E(immunoglobulin E, IgE)介導的過敏反應。IgE介導的食物過敏反應程度可從輕微的局部癥狀發展到嚴重的全身性反應，臨床表現為蕁麻疹、呼吸困難、嘔吐、腹痛、心血管衰竭等[1]，食物過敏已然逐漸成為全球化共性的人類健康問題。2008年國外流行病學調查表明，20%～30%世界人口受食品過敏的影響，水產品過敏尤其嚴重[2-3]，這一數據在近幾年仍在持續增長。然而國內還沒有類似的系統調查，但有關食用蝦、魚、蟹等水產品引起過敏的報道很多，有5%的兒童和2%的成年人會對某些水產品產生過敏。臨床研究表明，在我國食物過敏患者中，海蝦、河蝦、海蟹的過敏率分別高達40.3%、39.0%和37.8%[4-5]。呂相征等[6]研究發現，對魚和海鮮類過敏者最多,共占36%；貝類和牛奶次之,分別占13.0%和 12.2%。中國預防醫學科學院食品營養與安全中心的調查也表明，水產品是我國食品中最主要的過敏原，并且其所占過敏原比例逐年增加。

水產品中魚類和甲殼類動物過敏原研究已經較為深入，而對軟體動物過敏的研究很少，一項有8 600名參與者的問卷調查的顯示，1%的過敏癥狀與軟體動物有關[7]。也有研究發現甲殼類動物(蝦、龍蝦和螃蟹)和軟體動物(鮑魚、貽貝、扇貝和牡蠣)之間也有交叉反應[8]。因此，很有必要對軟體動物過敏原開展深層次研究。

目前已鑒定出6種貝類過敏原，包括肌球蛋白(tropomyosin, TM)[9]、精氨酸激酶(arginine kinase, AK)[10]、肌球蛋白輕鏈[11]、三糖磷酸異構酶[12]、和肌漿鈣結合蛋白(sarcoplasmic calcium-binding protein, SCP)[13]。貝類過敏原在臨床上缺乏研究，而TM是太平洋牡蠣中唯一公認的過敏原[14]。

SCP是具有高親和力性的EF手形Ca2+緩沖液，在骨骼肌中表達量最高[15]。SCP主要存在于無脊椎動物中，其致敏性與對蝦的臨床反應性有關[16]，在各種甲殼類動物中構成過敏原[13，17-18]，作用類似于脊椎動物體內的小白蛋白，這2種蛋白都在快速抽搐骨骼肌中高水平表達。在黑虎蝦中，SCP被鑒定為對蝦過敏原[13]，在凡納濱對蝦中其IgE結合活性在分子水平上得到了證實[18]。YANG等[19]通過研究發現，SCP在甲殼類水產中已經鑒定出其線性表位和構象表位，在軟體類水產中則只做到了基本理化性質和特異性IgE結合分析。重組蛋白比天然蛋白易獲取、純度和穩定性更高，在使用重組過敏原的體內診斷過敏方面也取得了實質性進展[20-22]。本文從分子質量、二級結構方面對天然SCP和重組SCP進行一致性比對，旨在獲取與天然蛋白過敏原本質無差別甚至致敏性更強的替代重組體，對牡蠣中重組SCP的鑒定對未來全面研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

太平洋牡蠣，山東威海；硫酸銨、碳酸氫鈉、過硫酸銨、二硫蘇糖醇(DL-dithiothreitol, DTT)，北京化工廠；EDTA，中國Biotopped公司；Tris(超純級)、考馬斯亮藍R-250(超高純)，美國Amresco公司；低分子質量蛋白Marker，碧云天公司；卡那霉素和異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside, IPTG)，美國VWR公司；PAS染色試劑盒，北京Solarbio公司。

振蕩培養箱，太倉華美公司；多通道超聲破碎儀，寧波新芝；冷凍離心機，美國Sigma公司；雙穩定時電泳儀，美國BioRad公司；KTA蛋白純化儀，美國GE Healtheare公司；圓二色(cireular dichroism, CD)光譜儀，英國應用光物理公司；基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)儀，德國Ultraflextreme公司；UV-1780紫外可見分光光度計，日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 天然SCP的提取純化

蛋白純化流程主要參考沈苑[23]的方法，并作適當修改。取牡蠣閉殼肌，切碎，溶于10倍體積預冷的緩沖液A(50 mmol/L NaCl，2 mmol/L NaHCO3，10 mmol/L EDTA)中，用高速勻漿機勻漿，離心(10 500×g，20 min，4 ℃)取上清液；進行75%～90%硫酸銨鹽析，離心(10 500×g，40 min，4 ℃)取沉淀。將沉淀溶于少量緩沖液B(10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L DTT，0.1 mmol/L EDTA，pH 8.0)中，并于透析液(10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，4 ℃)中透析16 h；最后上樣于已用緩沖液B平衡好的HiTrap-Q柱。用緩沖液B洗脫未吸附部分，再用1 mol/L NaCl線性洗脫2 h，流速為0.5 mL/min，收集洗脫部分于-80 ℃凍存，隨后與重組蛋白樣品同步進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)分析。

1.2.2 重組SCP的誘導表達

登錄Uniprot數據庫網站查找太平洋牡蠣SCP氨基酸序列(登錄號：CGI_10004435)并設計完整的基因序列，將其復制到大腸桿菌表達的目標載體上，本實驗以pET-30a(+)質粒構建重組載體克隆方案為NdeI-ATG-Sarcoplasmic calcium-binding protein-His tag-Stop codon--HindIII。從超低溫冰箱中取出 BL21(DE3)感受態細胞，置于冰上融化，加入重組質粒(100 ng)，輕輕吹吸充分混勻，冰上放置30 min，水浴鍋42 ℃熱激90 s，冰上放置3 min加入100 μL室溫LB液體培養基，在搖床中37 ℃，200 r/min振蕩培養60 min，將菌液混勻后涂至卡那霉素抗性平板上。分別挑取3個單克隆，分別接種到4 mL含有50 μg/mL卡那霉素的LB 試管中，在搖床中37 ℃，200 r/min振蕩培養，當OD600值達到0.6～0.8時，向2個試管中分別加入0.5 mmol/L IPTG，15 ℃培養16 h和37 ℃培養4 h，最后一支試管為陰性參照。

1.2.3 樣品準備

取450 μL培養基離心后的沉淀，重懸于300 μL裂解緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl, 150 mmol/L NaCl，5%(質量分數)甘油，pH 8.0)，用超聲破碎儀裂解10 min。

全菌樣品：取100 μL裂解液，與50 μL 5×上樣緩沖液(30%甘油，10%(質量分數)SDS，300 mmol/L Tris，250 mmol/L DTT)混合均勻，100 ℃加熱10 min，15 000 r/min離心5 min。

細胞裂解物的上清液和沉淀樣品:取剩余200 μL裂解液，15 000 r/min離心10 min，分別收集細胞裂解液的上清液和細胞沉淀。混合90 μL 5×上樣緩沖液到180 μL上清液中，做為上清樣品。用150 μL 5×上樣緩沖液重懸沉淀，做為沉淀樣品。100 ℃加熱10 min后，15 000 r/min離心5 min，待上樣。

1.2.4 SDS-PAGE分析

使用SDS-PAGE探究重組蛋白在不同溫度和誘導時間以及BL21(DE3)菌的上清液和沉淀中的表達情況。SDS-PAGE：配制5%(聚丙烯酰胺體積分數)濃縮凝膠和15%(聚丙烯酰胺體積分數)分離凝膠進行電泳。將重組SCP蛋白樣品溶液(20 μL)與 5 μL上樣緩沖液混合，并在95 ℃加熱5 min后進行電泳。通過比較低分子質量標記蛋白的電泳遷移率來確定分子質量。使用蛋白質印跡法(Western blot，WB)鑒定組氨酸(His)標簽標記的目標蛋白，抗His抗體能夠和帶有His標簽的蛋白質特異性結合。確定重組SCP最佳表達條件后，取天然SCP和重組SCP蛋白樣品各20 μL 直接與5 μL上樣緩沖液混合，后續操作相同。

1.2.5 MALDI-TOF-MS分析

利用MALDI-TOF-MS，進一步分析重組SCP蛋白的準確性。質譜鑒定的操作：切下通過SDS-PAGE獲得的目標蛋白，蛋白樣品經DTT還原和碘代乙酰胺烷基化處理后，用胰蛋白酶進行凝膠消化。酶解后得到的肽段再經C18ZipTip脫鹽后，與基質α-氰基-4-羥基肉桂酸混合點板。最后用MALDI-TOF-MS儀進行分析，波長337 nm；加速電壓25 kV；采用正離子模式，自動獲得數據。最后使用Mascot搜索工具將目標蛋白酶解后所產生的得到的肽片段的質量圖譜與NCBIprot數據庫中的指紋進行比較分析。

1.2.4 CD光譜分析

利用CD光譜測定蛋白質二級結構，準備0.3 mg/mL的天然SCP和重組SCP樣品，用CD光譜儀分析其CD光譜，并將測得的3個光譜平均值作為最終數據。對于波長分析，以0.5 nm的步長和2.0 nm的帶寬掃描樣品，光譜范圍為190～260 nm，掃描速度為200 nm/min。

1.2.5 過碘酸雪夫染色法(periodic acid-schiff stain，PAS)和碳水化合物-肽連鎖特征

食物過敏原大多數是具有酸性等電點的糖蛋白，且分子質量一般在10～80 kDa[24]。用PAS染色法確定天然SCP是否屬于糖蛋白，取經過SDS-PAGE分析的純蛋白條帶，按照試劑盒說明進行實驗，牛血清白蛋白(bovine albumin，BSA)作為陰性對照。用β消除法繼續驗證SCP上的多糖是否有O-糖苷鍵，根據CHEN等[25]的實驗稍作修改，取0.25 mg/mL的天然SCP蛋白樣品90 μL與0.5 mol/L的NaOH溶液10 μL混合均勻，于37 ℃靜置孵育15 h，測量其在230～300 nm處的紫外吸光值，以10 μL的純水混合孵育作為對照組。

1.2.6 蛋白多糖含量測定

用苯酚硫酸法測定天然SCP中多糖的含量，以鐘巖等[26]和佟海菊等[27]的實驗作為參考，取5 g重蒸酚定容于100 mL水中預先配制5%(體積分數)的苯酚溶液，外包錫箔紙放4 ℃備用；準確稱取105 ℃干燥恒重的1 g葡萄糖定容于100 mL水中，再取上述溶液1 mL定容于100 mL水中，得到0.1 mg/mL的標準葡萄糖溶液，取10支試管分別加入0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL標準葡萄糖溶液，均補加蒸餾水至2 mL；取天然SCP蛋白溶液，蛋白質量濃度為0.620 9 mg/mL，各0.2 mL于3支試管中，補加蒸餾水至2 mL。以上13支試管先加入5%(體積分數)苯酚溶液搖勻，迅速各加入濃硫酸5 mL，搖2 min，靜置10 min，再于100 ℃水浴加熱20 min，于避光處冷至室溫，在490 nm處測其紫外吸光值，樣品3次測量值取平均值作最終數據，以空白試劑作為參比。

1.2.7 氨基酸組成成分分析

Uniprot數據庫顯示太平洋牡蠣SCP共含有179個氨基酸，SCP的氨基酸組成已經很清楚，本文將SCP的氨基酸組成進行了簡單統計。

2 結果與分析

2.1 重組SCP最佳表達條件確定

將含有目的基因的重組質粒pET-30a(+)導入到大腸桿菌BL21(DE3)中，分別在15 ℃誘導16 h和37 ℃ 誘導4 h。用SDS-PAGE和WB檢測全菌、上清液、包涵體樣品，結果如圖1-A所示，由圖1-A可以看出無論是15 ℃誘導16 h，還是37 ℃誘導4 h的細胞裂解物的上清液和沉淀中，在22 kDa處均有明顯條帶，而在沒有加入IPTG誘導表達的細胞裂解物中沒有條帶顯示。圖1-A表明15 ℃誘導16 h比37 ℃ 誘導4 h蛋白表達量高，且從裂解上清液條帶可以看出前者可溶性蛋白含量也高于后者。圖1-B表明重組的SCP蛋白中含有His標簽，也為下一步的Ni-柱親和層析純化做好基礎。實驗測得最佳表達條件15 ℃誘導16 h蛋白表達水平為25 mg/L，可溶性為70%。

2.2 SDS-PAGE 分析

對牡蠣粗提物進行SDS-PAGE分析，如圖2所示。牡蠣粗提物主要含有相對分子質量為20、35和40 kDa 的蛋白條帶，經過75%～90%硫酸銨鹽析等后續操作上樣于HiTrap-Q柱，接收第2個洗脫峰的洗脫部分與重組SCP樣品一起電泳。純化后得到的天然SCP蛋白條帶在20 kDa左右，天然提取的牡蠣蛋白除了目的蛋白SCP外，還有較多的雜蛋白，通過純化也很難得到特別高的純度，而重組SCP蛋白條帶在22 kDa左右，其相對分子質量略大于天然SCP相對分子質量，這主要是由于重組SCP添加組氨酸標簽使得蛋白相對分子質量變大，重組SCP蛋白在經過Ni-柱親和層析后可以得到比較純的目的條帶。

A-SDS-PAGE；B-Western blot圖1 太平洋牡蠣SCP(～21.5 kDa)在BL21(DE3)表達的SDS-PAGE和Western blot分析Fig.1 SDS-PAGE and Western blot analysis of human heavy chain ferritin (～21.5 kDa) expression in BL21 (DE3)注：M1-分子質量標記，kDa；M2-WB分子質量標記，kDa；PC1-牛血清白蛋白(1 μg)；PC2-牛血清白蛋白(2 μg)；NC-未誘導的全細胞；1-15 ℃誘導16 h的全細胞；2-37 ℃誘導4 h的全細胞；NC1-未誘導的細胞裂解上清；3-15 ℃誘導16 h的細胞裂解上清；4-37 ℃ 誘導4 h的細胞裂解上清；NC2-未誘導的細胞裂解沉淀；5-15 ℃誘導16 h的細胞裂解沉淀；6-37 ℃ 誘導4 h的細胞裂解沉淀；用于WB的抗體為anti-His抗體(GenScript，Cat.No A00186)

M-分子質量標記，kDa；1-牡蠣粗提液；2-HiTrap-Q柱洗脫后的純化天然SCP；3-純化的重組SCP圖2 太平洋牡蠣天然SCP與重組SCP SDS-PAGE分析圖Fig.2 SDS-PAGE analysis of natural SCP and recombinant SCP of Pacific oyster

2.3 MALDI-TOF-MS分析多肽

采用質譜法鑒定22 kDa蛋白。用MALDI-TOF分析純化蛋白經胰蛋白酶消化后產生的肽段。如圖3所示，純化蛋白的質譜顯示多個峰，從800～4 000 Da不等，最高峰為2 377 Da。將2 377 Da處的信號與NCBI 數據庫進行比較，使用Mascot工具搜索并觀察Mowse值，肽段序列匹配的最高得分是太平洋牡蠣SCP(登錄號：XP_011436345.1)，匹配值為24，評分為212。質譜鑒定的數據表明22 kDa蛋白質是牡蠣SCP。

圖3 太平洋牡蠣重組SCP質譜圖Fig.3 Mass spectrometry of recombinant SCP of Pacific oyster

2.4 CD光譜分析

通過上述一系列的實驗的分析，已經可以證明重組的SCP是正確的，為了更進一步探究重組SCP與天然SCP是否具有相同的二級結構，進行了CD光譜實驗。CD光譜在遠紫外區域具有肽鍵吸收信號，并能反映蛋白質特征二級結構的含量。由圖4可以看出，天然SCP信號在198 nm處具有1個正峰值，并且在208和222 nm處具有2個負峰值，此外，摩爾橢圓率θ222/θ208>1，這些信號可以有力地證明它是典型的α-螺旋蛋白質。重組SCP蛋白的CD光譜信號幾乎與天然SCP的信號相重疊，可能是由于天然牡蠣SCP純度不夠，而重組的SCP純度更高，使得在2個負峰處的值稍有偏差，且經蛋白擬合軟件CDNN計算得到蛋白二級結構各組成含量如表1所示，2種蛋白各組成含量基本相同，但這足以證明重組SCP與天然的SCP具有近乎相同的空間結構。

nSCP-天然SCP；rSCP-重組SCP圖4 CD光譜Fig.4 CD spectrum

表1 二級結構各組成含量測定Table 1 Determination of components in secondary structure

2.5 PAS染色和碳水化合物-肽連鎖特征

PAS染色用于鑒定牡蠣天然SCP是否是糖蛋白，如圖5-A所示，陰性對照BSA經PAS染色未出現顏色變化，而SCP蛋白條帶經染色出現預期的紫紅色，證實SCP確為糖蛋白。如圖5-B所示，SCP經NaOH處理后，在230～300 nm處的紫外吸光值明顯增加，尤其在244 nm處增加值最大。這一結果表明，SCP的結構中存在1個或多個O-糖苷鍵[28]。O-糖苷鍵與多肽鏈上的絲氨酸或蘇氨酸的羥基相連，在堿的作用下，發生β消除反應，分子內脫去1個水分子生成不飽和鍵，在244 nm處產生了紫外吸收。上述2個實驗共同驗證SCP是O-糖苷鍵型的糖蛋白，而研究表明糖蛋白與IgE結合能力有關，即糖蛋白與抗原致敏性存在關聯。

2.6 SCP多糖含量

根據梯度葡萄糖濃度在490 nm處測得的吸光值繪制葡萄糖標準曲線，得到標準方程y=9.463 6x-0.000 4，R2=0.986 2，樣品吸光值平均值為0.046，則稀釋10倍前的多糖質量濃度為0.049 0 mg/mL，而蛋白質量濃度為0.620 9 mg/mL，即求得蛋白中糖含量為7.89%。

圖6 葡萄糖標準曲線Fig.6 Glucose standard curve

2.7 氨基酸組成

SCP氨基酸組成如圖7所示。由圖7可以清楚地看出SCP蛋白含有19種氨基酸，其含有非常豐富的天冬氨酸(D)和賴氨酸(K)，其次是丙氨酸(A)、蛋氨酸(M)和苯丙氨酸(F)，包含人體的8種必需氨基酸，可見氨基酸組成很全面。另外，SCP含有半胱氨酸(C)，半胱氨酸與二硫鍵的形成有關，有利于形成穩定的蛋白質高級結構，這可能與蛋白的過敏性不易消除存在一定的聯系。

圖7 SCP氨基酸組成Fig.7 Amino acid composition of SCP注：*-表示人體必需氨基酸；D-天冬氨酸；K-賴氨酸；A-丙氨酸；M-蛋氨酸；F-苯丙氨酸；E-谷氨酸；Q-谷氨酰胺；I-異亮氨酸；G-甘氨酸；V-纈氨酸；T-蘇氨酸；S-絲氨酸；L-亮氨酸；W-色氨酸；N-天冬酰胺；R-精氨酸；Y-酪氨酸；P-脯氨酸；C-半胱氨酸

3 結論

本研究以太平洋牡蠣為對象，采用飽和硫酸銨鹽析及陰離子交換等方法分離純化天然SCP，進行MALDI-TOF-MS以證實該蛋白為牡蠣中提取的天然SCP。通過基因工程重組表達并采用鎳柱親和層析分離純化重組SCP，進行Western blot證實研究成功利用重組大腸桿菌表達出牡蠣重組SCP。對重組SCP和天然SCP進行SDS-PAGE、CD光譜分析證明了利用重組大腸桿菌表達出的SCP與天然SCP除了分子質量稍有差別，空間結構近乎相同，而重組蛋白相對天然蛋白性質更加穩定便宜獲取，為后期利用重組SCP替代天然SCP進行相關實驗提供理論支撐。實驗利用PAS染色法鑒定牡蠣天然SCP為糖蛋白，利用苯酚硫酸法測定其蛋白中多糖的含量，采用β消化法鑒定此糖蛋白為O-糖苷鍵型的糖蛋白，另外，也對SCP氨基酸組成成分進行簡要分析，這一系列實驗旨在證明SCP確為牡蠣中的潛在過敏原。牡蠣營養豐富，蛋白質種類較全，非常適合作為人體營養補充食品，但牡蠣中除原TM和AK 2種重要過敏原，SCP作為新型過敏原也應被研究重視。