釀酒酵母PDC5基因的缺失對2-苯乙醇合成的影響及相關代謝改造

朱靈桓，徐沙，李由然，張梁，石貴陽*

1(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)2(糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)3(河北科技大學 食品與生物學院，河北 石家莊，050018)

2-苯乙醇(2-phenylethanol,2-PE)具有令人愉悅的玫瑰花香氣，其物化性質穩定，天然存在于植物的花葉或其萃取的精油中，在食品、日化用品甚至醫藥等領域都具有廣泛應用[1]。相比化學合成法產品質量差、植物提取法成本高，微生物發酵法原料廉價易得，反應條件溫和，對環境友好，其產品相當于物理提取法產品的天然質量，又具備化學合成法成本低廉的應用潛力，因此逐步成為國內外2-PE生產研究的熱點[2]。很多微生物天然具有合成2-PE的能力，如解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)[3]、馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)[4]、畢赤酵母(Pichiapastoris)[5]、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)[6]等。其中，釀酒酵母作為遺傳背景清晰的模式菌株，具有較強的產醇能力，在發酵過程中對環境的脅迫因素耐受性較高，因此研究基礎廣泛，合成2-PE的主要途徑與調控機制更為明確[7]。釀酒酵母合成2-PE的主要途徑是以L-苯丙氨酸為底物，通過芳香族氨基酸的轉氨作用，生成苯丙酮酸，或在(苯)丙酮酸脫羧酶的作用下生成苯乙醛，進而脫羧生成2-PE或脫氫生成苯乙酸，即埃里希途徑(Ehrlich pathway)，又稱艾氏途徑[1, 8]，如圖1所示。

圖1 釀酒酵母中艾氏途徑示意圖Fig.1 Schematic diagram of Ehrlich pathway in Saccharomyces cerevisiae

在釀酒酵母的艾氏途徑中，苯丙氨酸轉氨酶是可逆酶，分別由基因ARO8和ARO9編碼[9]。當培養基中氮源為芳香族氨基酸時，Aro8p起主要催化作用，并且具有廣泛的底物選擇性[10]。Aro9p是一種誘導酶，在細胞生長時的合成代謝中通常不表達，但是在aro8△突變株中可以催化L-苯丙氨酸和L-酪氨酸的生物合成，其轉錄水平受芳香族氨基酸的誘導[9, 11]，以及上游激活序列的激活[12-13]。釀酒酵母中已知存在5種具有催化苯丙酮酸生成苯乙醛的酶，分別為Aro10p、Pdc1p、Pdc5p、Pdc6p和Thi3p，它們之間存在著激活、抑制協同等復雜的相互調控作用[14-15]。其中，Aro10p是起主要作用的苯丙酮酸脫羧酶，PDC5基因編碼釀酒酵母中的丙酮酸脫羧酶，能夠催化丙酮酸脫羧生成乙醛，同時也具有苯丙酮酸脫羧酶活性[16-18]。在本實驗室的研究中發現，缺失PDC5基因的釀酒酵母菌株合成2-PE能力有所提高，這在以往的研究中未見報道。基于此，本研究初步探索了編碼丙酮酸脫羧酶的基因PDC5的缺失對釀酒酵母產2-PE的影響，并通過基于艾氏途徑的代謝改造策略進一步提高2-PE的產量。

1 材料與方法

1.1 菌株與質粒

本研究所用的菌株和質粒如表1所示，S.cerevisiaeCICC 31906是本實驗室篩選出的用作代謝工程改造的出發菌株，EscherichiacoliJM109用作增殖構建質粒宿主。

表1 本文中涉及的菌株和質粒Table 1 The main strains and plasmids used in this study

1.2 培養基與培養條件

1.2.1 培養基成分

SOB培養基(g/L)：酵母粉5，蛋白胨20，NaCl 0.5，KCl 0.186，MgCl20.95，配制固體培養基時加入瓊脂粉15，115 ℃滅菌20 min。YEPD培養基(g/L)：酵母粉10，蛋白胨20，葡萄糖20，配制固體培養基時加入瓊脂粉15，115 ℃滅菌20 min。發酵培養基(g/L)：葡萄糖20，L-苯丙氨酸 6.7，酵母粉 4，KH2PO43，MgSO4·7H2O 0.5，微量元素濃縮液1 mL，用KOH調節pH至6.0，115 ℃滅菌20 min。微量元素濃縮液(g/L)：CuSO4·5H2O 0.05，FeSO4·7H2O 2，MnCl2·4H2O 0.2，CaCl2·2H2O 2，ZnCl20.5，用2 mol/L HCl溶液溶解并定容至1 L，4 ℃保存。

大腸桿菌的培養：必要時加入氨芐青霉素(Ampicillin, Amp)或卡那霉素(Kanamycin, Kan)，用于轉化子篩選或質粒保持，其在培養基的工作質量濃度為100、30 μg/mL。培養溫度為37 ℃，培養條件為200 r/min過夜。酵母菌的培養：基因敲除過程中，必要時加入硫酸諾爾斯菌素(Nourseothricin, NTC)或潮霉素(Hygromycin B, Hyg)，用于基因缺失的轉化子篩選，其在培養基的工作質量濃度分別為100、200 μg/mL。基因過表達菌株構建過程中，必要時加入博萊霉素(Zeocin, Zeo)用于轉化子的篩選，其在培養基的工作質量濃度為50 μg/mL。培養溫度為30 ℃，培養條件為200 r/min。

1.2.2 培養條件

從保藏于-80 ℃的甘油管里取0.1 mL菌液，接種至固體培養基，活化24 h后轉接至YPD種子培養基，培養至對數生長中后期至OD值為8.0后，洗滌菌體并以體積分數為5%的接種量接種發酵培養基，發酵過程中分別在0、24、48、72、96、120 h測定生物量及相關代謝物的濃度。

1.3 釀酒酵母中的基因敲除方法

對釀酒酵母相關基因的敲除采用CRISPR-Cas9雙質粒敲除方法。首先將pH-Cas9-Nours質粒轉入釀酒酵母CICC31906中，硫酸諾爾斯菌素抗性平板篩選陽性轉化子，得到CICC31906/pH-Cas9-Nours菌株。在網站(http://chopchop.cbu.uib.no/)上設計出待敲除基因的靶序列，由上海生工生物公司合成相應引物(表2)后利用重疊PCR方法連接到質粒pYES2-Hyg上，構建相應基因的敲除質粒。利用醋酸鋰轉化法，將構建好的質粒pYES2-Hyg與敲除基因所對應的寡義核苷酸鏈(homo)共轉化菌株CICC31906/pH-Cas9-Nours后，利用諾爾斯菌素與潮霉素的雙抗平板篩選轉化子。在30 ℃培養2 d后挑取單菌落進行菌落PCR，并測序驗證。

表2 本研究中所用引物Table 2 Primers used in this study

1.4 質粒的構建

1.4.1 單基因過表達質粒的構建

提取釀酒酵母染色體作為模板，分別通過引物對ARO8-BamH I-f/ARO8-SalI-r、ARO9-BamH I-f/ARO9-SalI-r和ARO10-BamH I-f/ARO10-MluI-r擴增出帶有相應酶切位點的ARO8、ARO9和ARO10基因片段，雙酶切后與同樣黏性末端的質粒pYX212-zeo連接，得到質粒pYX-ARO8、pYX-ARO9和pYX-ARO10。

1.4.2 苯丙氨酸轉氨酶與苯丙酮酸脫羧酶共表達質粒的構建

以質粒pYX-ARO10為模板，通過引物對TPI-BspT I-f/TT-BspT I-r擴增出帶有BspT I酶切位點的PTPI-ARO10-TTT基因片段，BspT I單酶切后與帶有同樣黏性末端的質粒pYX-ARO8連接，構建得到雙基因共表達質粒pYX-ARO8-ARO10。

1.5 分析方法

1.5.1 干重測定方法

發酵液中的菌體濃度以分光光度計測量600 nm處吸光值(OD600)表示。根據測定的釀酒酵母菌體干重(dry cell weight,DCW)(g/L)經驗公式換算可得：DCW=OD600×0.301 2+0.001 6。

1.5.2 高效液相色譜測定方法

液相色譜樣品前處理方法如下：取發酵液1 mL，常溫12 000 r/min，離心2 min，取上清液沸水浴20 min后12 000 r/min離心20 min取上清液過濾，即可進行液相檢測。

L-苯丙氨酸、苯丙酮酸、苯乙酸和2-PE均使用HPLC C18色譜柱(ODS 5 μm，250 mm×4.6 mm，美國Waters公司)進行分離，紫外檢測器在波長210 nm處檢測，分離條件為：柱溫40 ℃，流動相A液為水，B液為乙腈，B液體積分數為30%，流速為0.5 mL/min，苯乙酸、L-苯丙氨酸與2-PE的出峰時間分別為3.4、5.1和13.6 min。

甘油、乙酸、葡萄糖和乙醇均使用Aminex 251 HPX-87H色譜柱(ODS 9 μm，300 mm×7.8 mm，美國Bio-Rad公司)進行分離，示差檢測器檢測，分離條件為：柱溫50 ℃，流動相為5 mmol/L稀硫酸，流速為0.8 mL/min，葡萄糖、甘油、乙酸與乙醇的出峰時間分別為9.6、12.9、14和17.9 min。

1.5.3 統計學分析方法

本研究所使用的統計學分析方法為t檢驗方法(單尾，雙樣本異方差分析)，使用SPSS 20.0(美國IBM公司)進行計算。

2 結果與分析

2.1 重組菌株的構建

本文通過實驗室改良的CRISPR/Cas9方法(即pYES2-Hyg與pH-Cas9-Nours雙質粒敲除方法，流程圖2-A)，構建了基因敲除的釀酒酵母突變株RM22(pdc5△)、RM8(aro8△)和RM9(aro9△)。以PDC5基因的敲除為例，首先，以質粒pYES2-Hyg為模板，利用引物對471-f/gRNA-302-5-r和gRNA-149-9-f/471-r進行PCR擴增，得到片段Pro-Target和片段Target-Ter，大小分別為302、149 bp，后經過進一步的重疊PCR擴增，得到片段Pro-Target-Ter，大小為471 bp。利用BamH I和BcuI對其雙酶切，與帶有同樣黏性末端的pYES2-Hyg質粒連接，構建質粒pYES2-PDC5-Hyg并轉化E.coliJM109，用引物對605-f/605-r進行菌落PCR，得到大小為605 bp的條帶(圖2-B)，證明質粒pYES2-PDC5-Hyg構建成功。用同樣的方法依次構建了質粒pYES2-ARO8-Hyg和pYES2-ARO9-Hyg，驗證均正確。將質粒pYES2-PDC5-Hyg與寡義核苷酸鏈PDC5-homo一同轉化到含有質粒pH-Cas9-Nours的釀酒酵母細胞中，涂布潮霉素和諾爾斯菌素雙抗YEPD平板，用引物對PDC5-certi-f/PDC5-certi-r進行單菌落PCR驗證，如圖2-C所示。挑取單菌落進行搖瓶培養，提取酵母細胞染色體后測序驗證正確，說明基因PDC5被成功敲除，構建得到突變株RM22。然后用同樣的方法分別構建了突變株RM8和RM9，菌落PCR驗證如圖2-D所示。

本文中使用博來霉素抗性的帶有強啟動子TPI的質粒pYX212作為基因過表達質粒，相關質粒圖譜與酶切驗證如圖2-E～圖2-G所示。重組質粒pYX-ARO8經BamH I和SalI雙酶切后得到的2條條帶大小分別為1 513、8 902 bp，重組質粒pYX-ARO9經BamH I和SalI雙酶切后得到的2條條帶大小分別為1 552、8 902 bp，重組質粒pYX-ARO10經BamH I和MluI雙酶切后得到的2條條帶大小分別為1 943、8 906 bp，重組質粒pYX-ARO8-ARO10經BspT I單酶切后得到的2條條帶大小分別為2 742、10 759 bp，核酸電泳驗證以及測序均正確，證明重組質粒構建成功。

2.2 釀酒酵母產醇條件的確定

釀酒酵母在不同培養條件下合成2-PE的產量不同，因此，基于釀酒酵母發酵的常規特性、文獻查閱和實驗室條件摸索，首先確定了釀酒酵母的產醇條件。文獻報道，以L-苯丙氨酸為唯一氮源的培養條件下，酵母主要通過艾氏途徑合成2-PE。但芳香族氨基酸本身并不是易于釀酒酵母利用的高效氮源，如圖3-A所示，培養基中只添加L-苯丙氨酸作為氮源時，酵母細胞生長緩慢，每24 h補糖(20 g/L)條件下發酵120 h，菌體干重最高僅為3 g/L；由于2-PE為生長偶聯型產物，其合成也受到較大限制，僅為2.29 g/L。在發酵培養中發現，酵母粉的適量添加能夠使酵母在發酵初期更多地積累菌體，有利于酵母細胞合成2-PE。如圖3-B、圖3-C所示，培養基中添加酵母粉4 g/L時，最利于酵母合成2-PE，其菌體干重達到7.2 g/L，2-PE的產量最高達到2.8 g/L。發酵至120 h，培養基中仍然殘留3.76 g/LL-苯丙氨酸未被消耗。為了減少釀酒酵母發酵過程中乙醇、甘油等副產物的生成，采用初始葡萄糖質量濃度為20 g/L。由圖3-D可知，每12 h補糖(20 g/L)與每24 h補糖(20 g/L)相比并不能顯著提高酵母合成2-PE的產量(P>0.05)，葡萄糖可能被用于呼吸作用或合成其他副產物。

A-CRISPR/Cas9方法敲除基因流程圖；B-質粒pYES2-PDC5-Hyg驗證圖(泳道M為DL 2 000 Marker，泳道1為片段Pro-Target，泳道2為片段Target-Ter，泳道3為片段Pro-Target-Ter，泳道4為轉入質粒pYES2-PDC5-Hyg的突變菌株的菌落PCR驗證)；C-菌株RM22中基因PDC5敲除驗證圖(泳道M為DL 5 000 Marker，泳道1為基因PDC5敲除前PCR驗證，泳道2為基因PDC5敲除后PCR驗證)；D-菌株RM9中基因ARO9敲除驗證圖(泳道M為DL 5 000 Marker，泳道1為基因ARO9敲除前PCR驗證，泳道2為基因ARO9敲除后PCR驗證)；E-重組質粒pYX-ARO8-ARO10譜圖；F-過表達質粒的酶切驗證圖(泳道M為DL 15 000 Marker，泳道1為質粒pYX-ARO8的BamH I和Sal I雙酶切驗證圖，泳道2為質粒pYX-ARO9的BamH I和Sal I雙酶切驗證圖,泳道3為質粒pYX-ARO10的BamH I和Mlu I雙酶切驗證圖)；G-重組質粒pYX-ARO8-ARO10的酶切驗證圖(泳道M為DL 15 000 Marker，泳道1為質粒pYX-ARO8-ARO10的BspT I單酶切驗證圖)圖2 基因敲除突變株與重組質粒的構建Fig.2 The construction of gene-deleted mutant strains and plasmids

2.3 丙酮酸脫羧酶Pdc5p的缺失對釀酒酵母合成2-PE的影響

在釀酒酵母中，2-PE主要通過艾氏途徑合成，其中苯丙酮酸脫羧酶催化苯丙酮酸生成苯乙醛，與其相關的基因包括PDC1、PDC5、PDC6、ARO10和THI3。然而，經過搖瓶發酵及產物測定，發現釀酒酵母PDC5基因的敲除對合成2-PE具有顯著促進作用。如圖4所示，在優化的培養基中，突變株RM22較對照株JM00而言，在細胞生長方面的變化不顯著(P>0.05)，說明基因PDC5的缺失并未對酵母細胞的生長造成明顯影響。突變株RM22的2-PE產量最高可達3.23 g/L，是對照菌株的1.12倍。這說明在釀酒酵母中敲除編碼丙酮酸脫羧酶的基因PDC5，不但不能阻斷苯丙酮酸合成苯乙醛，反而會加大支路途徑末端產物2-PE的胞外積累。

基于基因PDC5的缺失對釀酒酵母的2-PE合成表現出促進作用，我們檢測了pdc5△突變株中艾氏途徑相關酶的轉錄水平變化，發現在含有不同濃度梯度的L-苯丙氨酸培養基中，艾氏途徑關鍵酶的表達水平均有不同程度的變化(未發表內容)。

2.4 苯丙氨酸轉氨酶Aro8p的表達對釀酒酵母合成2-PE的影響

在釀酒酵母中，催化L-苯丙氨酸與苯丙酮酸之間轉氨作用的是可逆的Aro8p和Aro9p。考慮到目的產物合成的方向和傾向性，需要篩選出更偏好L-苯丙氨酸轉氨合成苯丙酮酸方向的突變株，以促進2-PE的合成。首先探究了不同苯丙氨酸轉氨酶對釀酒酵母合成2-PE的影響，我們構建了RM9 (WT-Aaro9△)、RM8 (WT-Aaro8△)、RM28(WT-A pYX-ARO8)、RM29(WT-A pYX-ARO9)、RM9-8(WT-Aaro9△ pYX-ARO8)和RM8-9(WT-Aaro8△ pYX-ARO9)，分析釀酒酵母苯丙氨酸轉氨酶Aro8p和Aro9p的分別缺失與表達對酵母合成2-PE的影響。

A-菌株JM00以L-苯丙氨酸為唯一氮源的培養條件下發酵參數變化曲線；B-培養基中酵母粉添加量分別為2、4、10、20 g/L時菌株JM00的細胞干重增長與葡萄糖消耗曲線；C-培養基中酵母粉添加量分別為2、4、10、20 g/L時菌株JM00的L-苯丙氨酸消耗與2-PE合成變化曲線；D-菌株JM00培養過程中每12 h添加葡萄糖(20 g/L)的各發酵參數變化曲線圖3 釀酒酵母合成2-PE條件的確定Fig.3 Fermentation condition of the synthesis of 2-phenylethanol in S.cerevisiae

A-菌株JM00的發酵參數變化曲線；B-菌株RM22的發酵參數變化曲線圖4 菌株 RM22的發酵結果Fig.4 Fermentation performance of strain RM22

由圖5-A可知，菌株RM8與RM9發酵過程中最大細胞干重均僅為0.6 g/L，說明苯丙氨酸轉氨酶I和II的缺失均會嚴重阻礙釀酒酵母CICC 31906的細胞生長；而菌株RM28與RM29生長狀況良好，細胞干重與出發菌株JM00相比沒有顯著差異。在產物2-PE的合成方面(圖5-B)，菌株RM8與RM9的發酵液上清液中未檢測到2-PE，菌株RM28和菌株RM29發酵120 h時合成2-PE質量濃度分別為2.97和2.32 g/L。菌株RM9-8和RM8-9的發酵結果如圖5-C和圖5-D所示，發酵96 h后干重分別達到6和3.5 g/L，較對照菌株JM00明顯下降；發酵96 h時菌株RM9-8能夠合成2-PE 3.13 g/L，比JM00增加了0.25 g/L；而菌株RM8-9最高僅能合成1 g/L 2-PE。考慮到生長情況的差異，菌株JM00、RM9-8、RM8-9合成2-PE的濃度分別為0.37、0.53和0.28 g/g DCW。相應地，發酵過程中3株菌對培養基中L-苯丙氨酸的消耗情況也有差異，如圖5-D所示。由上述結果可知，基因ARO8編碼的苯丙氨酸轉氨酶I在2-PE的合成代謝中發揮重要作用。

A-菌株RM8、RM9、RM28和RM29的細胞生長和葡萄糖消耗曲線；B-菌株RM8、RM9、RM28和RM29的2-PE合成與L-苯丙氨酸消耗曲線；C-菌株JM00、RM9-8和RM8-9的細胞生長和葡萄糖消耗曲線；D-菌株JM00、RM9-8和RM8-9的2-PE合成與L-苯丙氨酸消耗曲線圖5 不同苯丙氨酸轉氨酶對釀酒酵母產2-PE的影響Fig.5 Influence on 2-phenylethanol production by different phenylalanine transaminase-expressing in S.cerevisiae

2.5 釀酒酵母高產2-PE平臺菌株JM59-810的建立與策略分析

為了進一步促進釀酒酵母合成2-PE，在重組菌中過量表達苯丙酮酸脫羧酶Aro10p，構建了重組菌JM59-810(pdc5△aro9△PTPI-ARO8-TTTPTPI-ARO10-TTT)，并進行搖瓶發酵，出發菌株JM00和重組菌JM59-810的發酵情況如圖6所示。經過120 h搖瓶發酵，菌株JM00和JM59-810的菌體干重分別達到7.8和7.65 g/L，差異不顯著(P>0.05)，說明重組菌JM59-810的生長狀況良好，上述代謝改造手段未對酵母的生長產生明顯負擔。重組菌JM59-810的發酵副產物甘油最高產量為4.40 g/L，與菌株JM00相比提高了0.66倍；而乙酸最高產量為0.72 g/L，是菌株JM00的0.67倍。這是由于酵母突變株中丙酮酸脫羧酶Pdc5p的缺失削弱了下游產物乙酸的合成，同時促進了競爭途徑中甘油的合成。菌株JM00和JM59-810的乙醇產量最高為3.31和3.24 g/L，沒有顯著差異(P>0.05)。如圖6-B和圖6-D所示，重組菌的2-PE最高產量為3.85 g/L，是出發菌株JM00(2.88 g/L)的1.33倍，說明敲除PDC5和ARO9并過表達ARO8和ARO10的改造策略能夠有效提高酵母細胞合成2-PE的能力。

A-出發菌株JM00的葡萄糖消耗和乙醇、乙酸、甘油生成曲線；B-出發菌株JM00的細胞生長、2-PE、苯乙酸、苯丙酮酸合成與L-苯丙氨酸消耗曲線；C-重組菌JM59-810的葡萄糖消耗和乙醇、乙酸、甘油生成曲線；D-重組菌JM59-810的細胞生長、2-PE、苯乙酸、苯丙酮酸合成與L-苯丙氨酸消耗曲線圖6 出發菌株JM00和重組菌JM59-810的發酵情況Fig.6 Fermentation performance of strain JM00 and the metabolic strain JM59-810

3 結論與討論

利用釀酒酵母的艾氏途徑合成2-PE已得到廣泛的研究，包括提高酶活性與表達水平[6,19]、啟動子替換[11,20]及產物原位分離[21-22]等代謝改造策略均能有效提高2-PE的產量。釀酒酵母的艾氏途徑中，苯丙酮酸脫羧形成苯乙醛的反應主要由苯丙酮酸脫羧酶Aro10p催化，丙酮酸脫羧酶Pdc1、Pdc5、Pdc6因其較為廣泛的底物譜，也能夠對此反應起到一定的催化作用[17,23]。有研究指出，敲除基因PDC1能夠激活PDC5的轉錄水平，表現出對PDC1缺失的代償作用[14, 24]；基因THI3也在酶反應的過程中發揮著重要的調節作用[16]。因此，PDC5表現出苯丙酮酸脫羧酶催化活性的同時，同樣可能具備調控功能，并且可能以多種方式在2-PE的合成中發揮積極作用。釀酒酵母CICC31906的PDC5△突變株中艾氏途徑相關酶的表達水平不同程度地提高，尤其是編碼芳香族氨基酸轉氨酶基因ARO8轉錄水平穩定上調，導致其合成2-PE的能力顯著提高，這在以往的研究中未見報道。有別于直接過量表達合成途徑中相關酶的策略，本文提供了一種利用釀酒酵母合成2-PE的新思路，即通過敲除酵母PDC5基因的間接調控作用，實現相關酶的過表達，以促進2-PE合成。然而，目前關于PDC5的研究還停留在酶活性、轉錄水平的方面，可供參考的晶體結構、作用機制和調控功能等研究還有待深入發掘。