冬夏季節對豬皮制備的明膠凝膠特性和溯源性的影響

沙小梅，王光耀，胡姿姿，胡文蕓，涂宗財,2*

1(江西師范大學 國家淡水魚加工技術研發專業中心和江西省淡水魚高值化利用工程技術研究中心，江西 南昌，330022)2(食品科學與技術國家重點實驗室(南昌大學)，江西 南昌，330047)

明膠是由膠原蛋白經適度水解后得到的一類高分子蛋白質，主要從動物的皮膚、骨等結締組織進行提取[1],其具有凝膠性、發泡和乳化特性等多種功能特性，因而在食品、醫藥、化妝品和其他行業有廣泛的應用[2-3]。目前，約有95%的食用明膠來自哺乳動物，主要為豬和牛[4]。豬明膠是市場上使用最廣泛的明膠，但因手足口病的爆發，使其安全性受到消費者的質疑；其次受宗教信仰和素食主義的影響，使得對豬明膠進行溯源而備受關注[5]。目前，食用明膠的溯源常見的方法主要有PCR，酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，電泳技術和傅里葉變換紅外光譜法(Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR)等[6-9]。但由于食用明膠尤其是哺乳動物明膠的序列同源性非常高，其前體膠原蛋白的氨基酸序列相似度高達95%，且不同哺乳動物明膠之間的差異僅存在于一級結構的部分氨基酸序列中，給溯源帶來很大困難，導致上述溯源方法難以確認溯源效果，同時以上方法僅能用于純明膠的溯源，不適用于明膠混合物。

近年來，質譜技術逐漸代替傳統方法成為溯源蛋白質的新方法，其原理是依據膠原蛋白氨基酸序列之間的細微差異搜索不同來源的特征多肽，從而準確追溯明膠來源。質譜溯源因其快速、準確的特點而被廣泛關注，如WARD等[10]成功地借助生物質譜技術鑒定出源于豬、牛、魚和雞的4種明膠；在工業明膠的鑒定中，KUMAZAWA等[11-12]利用LC-MS成功鑒別出來源于豬、馬、牛、山羊和綿羊的不同明膠；GRUNDY等[13]用質譜技術追溯食品和藥品中明膠的來源，其結果比使用ELISA和PCR方法的效果更好。目前，食用明膠的研究大多數都集中在明膠混合物和食品體系中明膠來源的鑒定，而原料對于豬皮明膠溯源性影響的研究較少[14]。

食用明膠的原料主要為豬皮、牛皮和驢皮，其中豬皮占主導地位。皮膚為動物感知外界環境的感受器，其對于外界環境變化十分敏感，尤其是溫度。此前，相關研究證明不同季節肌內膠原蛋白的結構有所差異[15-16]，繼而推測不同季節的豬皮膠原蛋白也具有類似的差異。通過文獻查詢發現，夏季和冬季的魚皮明膠在凝膠特性方面有所差異[17]，但不同季節對豬皮明膠凝膠特性和溯源影響的相關研究尚未見報道，因此值得深入探究。在4個季節中，冬季和夏季的溫度差異最大，故選擇冬季和夏季宰殺之后得到的豬皮為原料提取明膠，應用剪切應力流變儀和質構分析儀對豬皮明膠的凝膠特性(如凝膠強度，膠融溫度和膠凝溫度)進行分析，探究冬季和夏季的豬皮原料是否會對提取明膠的凝膠特性產生影響；同時，應用線性離子阱高分辨率質譜技術(linear ion trap/orbitrap high-resolution mass spectrometry，LTQ/Orbitrap MS/MS)研究冬夏季節豬皮明膠的溯源性差異。本研究通過探究冬夏季節豬皮明膠凝膠性能的差異以及尋找不隨季節變化的豬皮明膠特征多肽，為豬皮明膠的溯源數據庫提供一定的數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

豬皮，正邦集團(江西南昌)，品種均為三元豬(即長白豬和大白豬雜交得到二元母豬，二元母豬與杜洛克公豬雜交得到三元豬)：年齡為6～7月，性別為母豬或閹割后公豬，室內飼養溫度為16～18 ℃，濕度為55%～65%，體重約為110 kg。宰殺時間分別為8月份(室外平均溫度28～35 ℃)和12月份(室外平均溫度5～12 ℃)。每個季節選擇3頭豬的豬皮。

胰蛋白酶(酶活力：16 376 U/mg)，美國Promega公司；異丙醇、NaOH(均為分析純)，西隴科學股份有限公司。

1.1.2 儀器設備

FA1104 N型電子分析天平，上海丙林電子科技有限公司；DHG-9023A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；LGJ-1D-80型冷凍干燥機，北京亞泰科隆儀器技術有限公司；TA-XT plus質構分析儀，英國Stable Micro System公司；Paar-Physica MCR 302型剪切應力控制流變儀，德國Anton Paar公司；Q-Exactive 質譜儀、EASY-nLCTM1000色譜系統，美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的制備

采用本課題組前期的制備方法[18]，將豬皮切成1 cm×1 cm的方形，清洗干凈后加入異丙醇浸泡脫脂過夜。再按照料液比為1∶10(g∶mL)向豬皮中加入0.1 mol/L NaOH溶液，在15～20 ℃條件下攪拌反應2 h，每40 min更換1次NaOH溶液。然后將豬皮洗凈至pH 7.0，按照料液比為1∶10(g∶mL)再加入0.2 mol/L HCl溶液，在15～20 ℃條件下攪拌反應4 h，每隔1 h更換1次HCl溶液。最后將豬皮洗凈至pH 7.0。豬皮明膠的制備工藝為豬皮與超純水的料液比為1∶3(g∶mL)，加熱溫度為55 ℃，提取時間為6 h。過濾除去豬皮殘渣，將濾液凍干得到豬皮明膠，冷藏備用。

1.2.2 凝膠強度測試

使用TA-XT plus質構分析儀測定豬皮明膠的凝膠強度。將凍干后的明膠配制成質量濃度為6.67 mg/mL的明膠溶液，量取15 mL配制好的明膠溶液，置于4 ℃冷藏16～17 h至完全凝膠。用P/0.5R 探頭測定冷藏后膠體的凝膠強度，探頭測試速度為1 mm/s，將探頭下壓至膠體內部4 mm處時施加的力定義為膠體的凝膠強度[19]。

1.2.3 流變學測試

采用HUANG等[20]的方法，使用剪切應力流變儀的CC27轉子測量明膠的流變特性(溫度掃描、頻率掃描)。

溫度掃描：移取19 mL 6.67 mg/mL豬皮明膠溶液置于圓筒(CC27，MCR302)中，溶液先從40 ℃降溫至5 ℃，再從5 ℃升溫至40 ℃，速率均為0.5 ℃/min，應變力為0.5%, 頻率為1 Hz。

頻率掃描：對凝膠后的膠體進行頻率測試，溫度為5 ℃，應變力為0.5%，頻率在0.01～10 Hz的線性黏彈范圍內進行掃描。

1.2.4 樣品酶解

將凍干后的樣品溶解于SDT緩沖液(4 mg/mL十二烷基磺酸鈉、100 mmol/L二硫蘇糖醇、150 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl溶液)配制成1 μg/μL溶液，于沸水中加熱3 min，室溫冷卻后加入200 μL 8 mol/L尿素裂解液并轉入10 kDa超濾管，14 000×g離心30 min，棄下層濾液；再加入100 μL 100 mmol/L的碘乙酰胺溶液(含尿素裂解液)混勻1 min后放至暗處，靜置20 min 后14 000×g離心15 min，接著再加入100 μL 8 mol/L尿素裂解液，繼續14 000×g離心15 min，重復3次后棄下層濾液；向濃縮液中加入100 μL 100 mmol/L NH4HCO3溶液后14 000×g離心30 min，此步驟重復3次；而后更換2 mL離心管。加入50 μL 100 mmol/L NH4HCO3溶液以及2 μg胰蛋白酶混勻1 min，37 ℃下反應20 h，反應完后離心收集濾液，即可得到酶解產物。

1.2.5 HPLC-LTQ/Orbitrap MS/MS

采用HPLC-LTQ/Orbitrap MS/MS對酶解后產物進行分析。先使用納升流速液相系統HPLC-EASY-nLC 1000 對其進行分離。流動相：A液[V(乙晴)∶V(甲酸)∶V(水)=2∶0.1∶97.9]，B液[V(乙晴)∶V(甲酸)∶V(水)=84∶0.1∶15.9]。色譜柱Thermo EASY column SC200 150 μm×100 mm (RP-C18)以100%的A液平衡。樣品由自動進樣器上樣，再經色譜柱分離，流速為0.3 μL/min。流動相梯度如下表1所示，酶解產物經高效液相色譜分離后用Q-Exactive質譜儀進行質譜分析。分析時長：60 min，母離子掃描范圍(m/z)：300～1 800，多肽和多肽的碎片的質荷比按照下列方法采集：MS在m/z200時分辨率為70 000，動態排除時間：40.0 s；每次全掃描后采集20個碎片圖譜，MS/MS 在m/z200時分辨率為17 500，裂解類型：HCD，歸一化碰撞能量：30 eV，底部填充率：0.1%。

表1 液相梯度設置Table 1 Liquid gradient settings

1.3 數據分析

使用MASCOT 2.2針對豬膠原蛋白檢索MS/MS質譜。檢索參數：固定修飾為半胱氨酸碘乙酰胺化；可變修飾：氧化(P，K和M)；最大未酶切位點為2；一級質譜錯誤率為±20 ppm；二級質譜錯誤率為±0.1 Da；當Mascot分數>40時，多肽峰被認定為陽性鑒定或準確度極高(P<0.05)[21]。

2 結果與分析

2.1 凝膠強度

凝膠強度是評價明膠質量的重要指標之一，冬夏兩季豬皮明膠的凝膠強度如表2所示。隨著季節平均溫度的升高，明膠的凝膠強度由(811.0±0.6) g增加到(877.1±0.6) g，說明不同季節對豬皮明膠凝膠強度有著顯著影響。這與段蕊等[22]的結果類似，原因在于明膠分子鏈越長，網格結構越緊密，凝膠強度越大，且冬季的膠原蛋白穩定性低于夏季，在明膠提取過程中，冬季膠原蛋白較夏季更易斷裂成小分子鏈，易導致冬季明膠的凝膠網格結構松散，呈現較低的凝膠強度。

表2 冬夏豬皮明膠凝膠強度Table 2 Gel strength of winter and summer pigskin gelatin

2.2 流變學分析

2.2.1 溫度掃描

當材料形變時，由彈性形變而存儲在材料中的能量指標稱為G′，而損失的能量指標稱為G″[5]。在加熱和冷卻期間，在不同季節提取的豬皮明膠中G′和G″的變化如圖1所示。冬夏季節豬皮明膠的凝膠和融膠過程中G′和G″的變化趨勢基本相同，均是隨著溫度降低而升高，隨著溫度升高而降低。當溫度逐漸升高時，豬皮明膠逐漸變為液態，此時豬皮明膠的G′低于其G″，表明豬明膠分子是單鏈狀態。當隨著溫度降低，G′和G″曲線變得更陡峭，尤其G′迅速增加，是由于在離子相互作用、氫鍵、范德華力、疏水作用等非共價鍵作用下明膠分子鏈發生從單鏈到三重螺旋的自組裝轉變的過程[19]。

在冷卻和加熱期間，G′和G″存在一個交點，并在該點處于平衡狀態。此外，在冷卻和加熱曲線上的G′和G″的交叉點被定義為膠凝點和膠融點，此時對應的溫度分別為膠凝溫度和膠融溫度。由表2可知，冬季和夏季明膠膠融溫度分別為(26.7±0.7)、(27.9±0.6) ℃，膠凝溫度分別為(18.3±0.0)、(19.6±1.2) ℃。明膠的膠融溫度和膠凝溫度均隨著季節溫度的升高而升高，這可能是由于季節溫度的升高增加了膠原蛋白的穩定性，從而影響了明膠的凝膠特性[23]。

2.2.2 頻率掃描

在凝膠上施加擺動力矩會導致膠體分子在該時刻移動。當擺動力矩的頻率從低到高變化時，分子鏈的運動也相應地變化，并且可以測量其黏彈性能。G′反映了外力變化時系統分子形變的能量，G″則反映了分子鏈內或分子之間的外力引起的系統分子力變化所產生的能量損失。明膠的頻率掃描可以表征其凝膠強度，如圖1-e所示，冬夏兩季豬皮明膠的G′隨頻率增加而增加，說明凝膠化仍在進行中。冬季豬皮提取的明膠顯示出更低的G′，這與2.1中的凝膠強度結果相一致。原因可能是較低的環境溫度降低了膠原蛋白的穩定性，導致明膠分子質量降低，從而使得內部的凝膠網絡交聯減少[23]。

tanδ值(G″/G′)可以進一步證實這一結果，tanδ值越低表明凝膠體系受外力影響時的能量損失越低，即tanδ值較低時，其凝膠會形成更牢固的凝膠網絡。如圖1-f所示，夏季豬皮明膠的tanδ均低于冬季豬皮明膠，表明夏季豬皮明膠能形成更穩定的凝膠結構。此外，冬夏兩季豬皮明膠的tanδ均呈現先降低后升高的趨勢，且tanδ值均小于0.1，說明2種明膠均能獲得了良好的凝膠網絡或更接近固體的性質。但隨著頻率的逐漸增大，tanδ值逐漸增加，表明高頻率掃描會逐漸破壞膠體的內部網絡結構[24]。

a-降溫過程中豬皮明膠G′；b-降溫過程中豬皮明膠G″；c-升溫過程中豬皮明膠G′；d-升溫過程中豬皮明膠G″；e-頻率掃描過程中豬皮明膠G′；f-頻率掃描過程中豬皮明膠的tanδ值圖1 冬夏季節豬皮明膠的流變學特性Fig.1 The rheological properties of pigskin gelatin in winter and summer

2.3 質譜鑒定特征多肽

2.3.1 豬明膠理論特征多肽

本課題組前期通過比對豬牛明膠序列，建立了豬、牛明膠理論特征多肽數據庫[25]，通過數據庫查詢可知，豬明膠具有69種理論上的特征性多肽，其中包含27條源自α1鏈的特征多肽和42條源自α2鏈的特征多肽。因此可通過這些特征多肽序列溯源豬明膠。

2.3.2 冬夏兩季豬皮明膠的特征多肽總體分析

本研究利用HPLC-LTQ/Orbitrap MS/MS鑒定不同季節豬皮明膠的特征多肽。質譜數據分析的結果表明，夏季豬皮明膠包含80條特征多肽，冬季豬皮明膠包含66條特征多肽。夏季豬皮明膠特征多肽數量明顯高于冬季豬皮明膠，這可能是由于夏季豬皮膠原蛋白結構穩定性強，其多肽序列在提取過程中能夠更好地被保留，具有更多的酶切位點，被胰蛋白酶酶切之后釋放出更多的特征多肽。將冬夏季豬皮明膠特征多肽進行對比，發現夏季豬皮明膠含有36條特有的特征多肽，冬季豬皮明膠含有22條，同時有44條特征多肽不會隨季節變化而改變。為了進一步比較不同季節對明膠序列斷裂位置的影響，不考慮修飾情況，以斷裂位點為橫坐標，比較冬夏季節特征多肽的分布情況。由圖2可知，夏季明膠較冬季明膠添加了4個序列段，α1鏈和α2鏈各2個，亦說明夏季膠原蛋白有著更好的穩定性，在提取過程中保存更多的多肽序列，對明膠的溯源有一定幫助。

a-豬明膠α1鏈；b-豬明膠α2鏈圖2 冬夏豬皮明膠特征多肽序列的分布Fig.2 Distribution of characteristic peptide sequences of winter and summer pigskin gelatin

2.3.2.1 冬夏兩季豬皮明膠的非共有特征多肽

為說明不同季節對豬皮明膠特征多肽的影響，將來自不同季節豬皮的2個明膠樣品中相同的特征多肽定義為共有特征多肽，將2個明膠樣品中不同的特征多肽定義為非共有特征多肽。利用HPLC-LTQ/Orbitrap MS/MS分別對冬夏季節豬皮中提取的豬皮明膠進行檢測。結果如表3和表4所示，冬夏季豬皮明膠非共有特征多肽數分別為22和36，其中未修飾特征多肽數分別為2和3。冬夏季節豬皮明膠的2種未修飾的非共有特征多肽的串聯質譜圖如圖3所示，冬季豬皮明膠中鑒定出m/z為1 037.011 62+的920GSPGADGPAGAPGTPGPQGIAGQR943(圖3-a)及夏季豬皮明膠中鑒定出的m/z為486.231 42+的942QGPSGPSGER951(圖3-b)的峰。2種特征多肽的質量與理論質量非常匹配，MS/MS產生的一系列y和b離子都顯示這2種特征性胰蛋白酶肽的序列的準確性。不論是否帶有修飾，這些非共有特征多肽只能在冬季或夏季豬皮明膠中單獨被找到，即隨著季節變化而改變，因此不能作為豬皮明膠溯源的特征多肽。

表3 冬季豬皮明膠非共有特征多肽Table 3 Non-common characteristic peptides of winter pigskin gelatin

表4 夏季豬皮明膠非共有特征多肽Table 4 Non-common characteristic peptides of summer pigskin gelatin

續表4

a-豬皮明膠α1鏈920GSPGADGPAGAPGTPGPQGIAGQR943；b-豬皮明膠α1鏈942QGPSGPSGER951圖3 串聯質譜鑒定的豬皮明膠特征多肽Fig.3 Porcine skin gelatin characteristic peptides identified by tandem mass spectrometry

2.3.2.2 冬夏兩季豬皮明膠的共有特征多肽

2種豬皮明膠中的44條共有特征多肽(9條源自α1鏈和35條源自α2鏈)如表5所示，這些共有特征多肽不會隨季節的變化而改變，可作為特征多肽用于豬皮明膠的溯源。由表5可知，這些共有特征多肽序列共有2種形式：第1種形式為未修飾的特征多肽序列，包括174SAGISVPGPMGPSGPR189、1052GETGPAGPAGPVGPVGAR1069、85G VGAGPGPMGLMGPR99、424GPTGPAGVR432和1068TGQPGA VGPAGIR1080；第2種形式為包含羥基化修飾的特征多肽序列。膠原蛋白脯氨酸羥基化以及膠原蛋白的部分水解會產生的大量羥脯氨酸[26-27]。因而存在序列相同但修飾不同的特征多肽片段，其復雜的修飾情況使序列識別更加困難，如不同數目的羥基化修飾位點和相同的修飾數目但不同的修飾位置。

圖4為冬夏豬皮明膠的3個共有特征多肽的二級質譜圖。3個特征多肽的氨基酸序列相同，但具有不同的羥基化修飾位點。m/z值分別為719.374 32+(圖4-a)、727.375 12+(圖4-b)和735.373 72+(圖4-c)的3個峰均來自豬皮明膠α2鏈，分別具有1、2和3個脯氨酸羥基化位點。這3種共有特征多肽的質量與理論值(1 469.738 3、1 453.743 4和1 437.748 5)很好地匹配。MS/MS產生的一系列y和b離子準確地證明了這3個共有特征多肽均來自同一序列。

值得注意的是，通過一級質譜和串聯質譜鑒定出的胰蛋白酶肽序列中可以檢測到具有不同電荷(+1、+2、+3，+4和+5)的片段，其中+2和+3最常出現。在表5中，出于均一性考慮，列出的特征多肽的價態均為+2和+3。從理論上講，各種電荷的質譜峰均可用于鑒定和分析蛋白質。

表5 冬夏季節豬皮明膠共有特征多肽Table 5 Common peptides of pigskin gelatin in winter and summer

a-豬皮明膠的α2鏈中的特征多肽574GIPGEFGLP*GPAGPR588(Pro582被羥基化)；b-特征多肽574GIP*GEFGLP*GPAGPR588(Pro576和Pro582被羥基化)；c-特征多肽574GIP*GEFGLP*GP*AGPR588Pro576, Pro582和Pro584被羥基化)圖4 通過串聯質譜法鑒定特征多肽的不同修飾水平Fig.4 Identification of different modification levels of characteristic peptides by tandem mass spectrometry

3 結論

綜上所述，不同季節對豬皮明膠的凝膠特性有顯著影響，當夏季轉變為冬季時，豬明膠的凝膠強度由(877.1±0.6) g降低為(811.0±0.6) g；膠凝溫度由(27.92±0.55) ℃降低為(26.7±0.7) ℃；膠融溫度由(19.6±1.2) ℃降低為(18.3±0.0) ℃，表明豬皮明膠隨著季節溫度的降低而有所降低，易斷裂為小分子鏈，導致冬季明膠凝膠特性較差。進一步運用HPLC-LTQ/Orbitrap MS/MS，從冬夏兩季豬皮提取的豬皮明膠中分別鑒定出了66和80個特征多肽，其中包含有44種共有特征多肽序列，不會隨著季節的變化而改變，這些共有的特征多肽序列可以作為豬皮明膠溯源的依據。流變學、質構分析和質譜結果均表明，季節的變化會影響豬皮明膠的流變學特性和溯源性，所以豬皮明膠的溯源應優先考慮那些具有穩定性的共有特征多肽。同時，還應考慮其他外界因素可能會干擾識別，例如飼養方式和條件。后期需要進一步研究不同外界因素對明膠溯源性的影響，以提高豬皮明膠溯源的準確性。