天麻參與灰樹花固態發酵對基質主要活性成分的影響

吳力亞，吳天祥，汪玲

1(貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽，550025)2(貴州食品工程職業學院，貴州 貴陽，550025)

灰樹花(Grifolafrondosa)是一種名貴的藥食用真菌，以子實體或菌絲體作為食用部分，具有多種活性功能[1-2]，如抗氧化[3]、降血糖[4]、降血脂、抗腫瘤[5]、清除重金屬[6]，并且含有較為豐富的生物活性物質，如灰樹花多糖、多酚、甾醇類、萜類等活性成分[2,7]。傳統灰樹花固態培養主要是利用木屑、稻草以及農作物副產品作為生長基質，灰樹花采收后，菌糠則被丟棄，造成很大的資源浪費及環境污染。開發一種新型的灰樹花生長基質，并完全利用其發酵基質,具有很高的研究價值[8]。本研究通過前期的實驗將已優化的苦蕎、薏仁米等各種基質的比例作為灰樹花發酵基質進行實驗。苦蕎作為西南地區一種藥食同源谷物,富含黃酮類物質，其蘆丁含量極高[9-10]，薏仁米富含薏仁酯、薏仁素和豐富的淀粉物質[11-12]，兩者可以作為灰樹花發酵基質，為灰樹花的生長提供碳氮源。

天麻(Rhizomagastrodiae)是一種名貴中藥[2,13]，富含天麻素(p-hydroxymethylphenyl-β-D-glucopyranoside，GA)、對羥基苯甲醇(p-hydroxybenzyl alcohol，HA)、對羥基苯甲醛(p-hydroxylbenzaldehyde，HBA)、巴利森苷(parishin)，具有很高的藥理功效[14-15]。課題組前期試驗驗證了添加一定比例的天麻提取物參與灰樹花液態深層發酵能夠顯著地促進灰樹花胞外多糖的分泌及生物量的增加以及分解利用天麻成分進行生物轉化[16-20]。本研究將中藥天麻以不同比例的添加量參與灰樹花的固態發酵，旨在進一步豐富和拓展中藥資源與食用菌共發酵以及兩者之間相互影響、生物轉化的研究前景以及中藥菌質產品的食藥價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

灰樹花(菌種編號5404)，中國普通微生物菌種保藏管理中心；天麻，貴州大方；苦蕎，貴州威寧；薏仁米，貴州興仁；GA對照品、HA對照品、HBA對照品、巴利森苷對照品、蘆丁對照品、異槲皮苷對照品，北京索萊寶生物科技有限公司；Al(NO3)3、NaNO2，上海阿拉丁試劑有限公司；其余試劑均為市售分析純；斜面培養基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)培養基。

1.2 儀器與設備

BXM-30R型立式滅菌鍋、恒溫培養箱，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；SW-CJ-1D型凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司；TGL-20M型臺式高速冷凍離心機，長沙邁佳森儀器設備有限公司；CTFD-12S型真空冷凍干燥機，青島永合創信電子科技有限公司；Agilent 1100型高效液相色譜儀及檢測器、Agilent 5TC-C18型色譜柱，美國Agilent公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 灰樹花固態發酵培養基配制流程

灰樹花固態發酵培養基配制流程如圖1所示。

圖1 灰樹花固態發酵培養基配制流程圖Fig.1 Flow chart of preparation of Grifola frondosa solid fermentation medium

1.3.2 灰樹花菌種培養方法

1.3.2.1 斜面種子培養

從母種試管中挑取黃豆粒大小菌絲塊接種于PDA培養皿中部，25 ℃恒溫培養，至菌絲長滿整個斜面，轉置4 ℃保存。

1.3.2.2 發酵培養

培養基成分組成：苦蕎粉4.5 g；苦蕎皮1.5 g；薏仁米1.5 g；麩皮0.4 g；葡萄糖0.1 g；

天麻粉：天麻烘干，超微粉碎機打碎成天麻粉，過60目篩。分別按照培養基質量分數的0%、10%、20%、30%、40%、50%加入到發酵培養基中參與固態發酵。

將上述材料混勻加水，置于滅菌鍋中滅菌(121 ℃、30 min)，培養基降低到室溫，接入灰樹花菌種于培養基中，放入恒溫恒濕培養箱中進行生長發酵12 d(25 ℃)。

1.3.3 發酵基質的處理

發酵基質在恒溫恒濕培養箱中培養12 d后，將其進行真空冷凍干燥，干燥之后的發酵物超微粉碎并過80目篩，收集粉末，置于-20 ℃條件下保存，作為實驗材料。

1.4 分析方法

1.4.1 總黃酮含量的測定

精確稱取0.4 g菌粉，加入20 mL 50%的乙醇中，常溫搖晃提取1 h，8 000 r/min離心10 min，取上清液，作為待測樣品溶液。采用NaNO2、Al(NO3)3顯色法測量，總黃酮含量以蘆丁當量表示。

1.4.2 GA、HA、HBA、巴利森苷含量的測定[2]

1.4.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent 5TC-C18型色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；洗脫程序：0～35 min(0%～30% B)，35～40 min(30%～100% B)，40～45 min(100%～3% B)；流動相：0.1%的磷酸水(D)、乙腈(B)；流速：1 mL/min；檢測波長：221 nm；柱溫：30 ℃。

1.4.2.2 樣品溶液的配制

精確稱取0.5 g發酵粉末，加入10 mL 75%乙醇，常溫浸提12 h，8 000 r/min離心10 min，取上清液作為待測樣品溶液，按照上述HPLC條件進行GA、HA、HBA、巴利森苷含量的測定，將各種物質的峰面積代入標準曲線，得到各種物質的含量。

1.4.3 蘆丁、異槲皮苷含量的測定[21]

1.4.3.1 色譜條件

流動相：0.02%的磷酸水、乙腈；流速：1 mL/min；檢測波長：360 nm；柱溫：30 ℃；等度洗脫：V(乙腈)∶V(0.02%磷酸水)=20∶80。

1.4.3.2 樣品溶液的配制

精確稱取0.5 g發酵粉末，加入10 mL甲醇，常溫浸提12 h，8 000 r/min離心10 min，取上清液作為待測樣品溶液，按照上述HPLC條件進行蘆丁、異槲皮苷含量的測定，將各種物質的峰面積分別代入標準曲線，得到各種物質的含量。

1.5 數據處理與分析

所有的數據使用Origin 10軟件畫圖，使用SPSS 19.0軟件進行數據分析。實驗數據以平均值±標準偏差表示(n=3)，使用單因素方差分析(ANOVA)和配對t檢驗進行顯著性分析，P<0.05表示數據具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 灰樹花固態發酵不同時間形態及表觀結構的變化

圖2為灰樹花在未添加天麻培養基上的生長變化。在生長7 d時，灰樹花菌絲體基本鋪滿培養基，且菌絲顏色亮白，聯結致密，說明灰樹花能夠在基質上進行正常的生長，此種培養基未對灰樹花的生長產生抑制作用。圖3為發酵組和未發酵組在不同時間菌質的表觀形態圖。由圖3可知，在發酵組，隨著灰樹花發酵時間的延長，基質結構產生大量細微的孔隙，在發酵終點時，基質由外到內均產生了較大的孔隙，結構近乎崩解，相比于發酵組，未發酵組基質在0～12 d的表觀結構形態均未發生明顯的變化，結構均較為完整致密。對比兩者基質的表觀結構，說明經灰樹花發酵，對基質結構產生了顯著的崩解作用，通過對基質結構的破壞，使得基質的營養物質更容易析出，增加了菌絲體與基質的接觸面積，有利于菌絲體更好地吸收利用營養物質以供自身的生長代謝。

圖2 不同生長時間灰樹花在基質上的菌絲體變化Fig.2 The change of mycelium of G.frondosa in the substrate at different days

圖3 發酵組和未發酵組基質不同時間的掃描電鏡Fig.3 Scanning electron microscopy of substrates in fermented and unfermented groups at different days

2.2 不同天麻添加量對灰樹花發酵基質總黃酮含量的影響

如圖4所示，通過相同天麻添加比例，不同接菌方式[一組為未發酵組(未接菌)，一組為發酵組(接菌)]，對比每組總黃酮含量，結果表明灰樹花在生長發酵的同時能夠分解總黃酮，使得總黃酮含量明顯降低。天麻參與灰樹花固態發酵能夠一定程度的促進灰樹花分解總黃酮，在天麻添加量分別為10%、20%、30%、40%、50%(質量分數)時，相比于空白組(0%)分解總黃酮的能力分別提高了1.05、1.24、1.2、1.3和1.01倍。此結果驗證了灰樹花能夠在以苦蕎為主要基質的培養基進行正常的生長，是由于其能夠對基質中富含的總黃酮類物質進行分解代謝提供自身的生長需求。同時也驗證了添加一定比例的天麻參與灰樹花發酵能夠一定程度的促進其分解代謝總黃酮的能力。通過提高總黃酮類物質的分解能力，提高大分子黃酮類物質轉化為小分子黃酮苷類物質，并且增加其水溶性和分子利用程度，進而提高菌質食藥用價值。

a-天麻添加量0%；b-天麻添加量10%；c-天麻添加量20%;d-天麻添加量30%;e-天麻添加量40%;f-天麻添加量50%圖4 不同天麻添加量對發酵基質總黃酮含量的影響Fig.4 The effect of different proportions of R.gastrodiae on the total flavonoids content of fermentation substrate注：**示與未發酵組相比，具有顯著性差異(P<0.01)(下同)

2.3 不同天麻添加量對灰樹花發酵基質蘆丁及異槲皮苷含量的影響

由圖4和圖5研究結果可知，以苦蕎為主要發酵基質，灰樹花會對總黃酮類物質進行分解。為進一步探究對灰樹花發酵基質中總黃酮類物質中具體成分含量的影響，采用HPLC對基質中蘆丁和異槲皮苷進行含量檢測(圖6)，結果表明在發酵12 d后，發酵基質中蘆丁和異槲皮苷的含量均有不同程度的降低。由圖7可知，隨著天麻添加量的增加，發酵基質中蘆丁的含量減少程度更高，相比于空白組(0%)，在天麻添加量為10%、20%、30%、40%、50%時，蘆丁含量降低量分別增加了1.37、1.70、1.03、1.13和4.0倍(P<0.01)。與空白組相比均具有極顯著性差異，說明在天麻添加量為50%時，對灰樹花分解蘆丁具有最大的促進作用；由圖8可知，在天麻添加量為分別為20%、30%、40%、50%時，對灰樹花分解異槲皮苷具有極顯著地促進作用，相比于空白組(0%)，對異槲皮苷的降低量分別提高了1.06、1.09、1.08和1.08倍(P<0.01)。文獻記載，橙皮苷酶可以將蘆丁有效地轉化為異槲皮苷[21]，在此次實驗中，分別對同一基質中的蘆丁和異槲皮苷物質進行含量測定，異槲皮苷的含量并未升高，可以排除蘆丁含量的減少是由于灰樹花分泌的橙皮苷酶將其轉化為異槲皮苷，而是灰樹花在生長過程中對蘆丁進行了分解利用。

圖5 不同天麻添加量對促進灰樹花對總黃酮分解能力的影響Fig.5 The effect of different proportions of R.gastrodiae on the promotion of G.frondosa on the decomposition of total flavonoids

a-蘆丁；b-異槲皮苷圖6 蘆丁和異槲皮苷的高效液相色譜圖Fig.6 High performance liquid chromatogram of rutin and isoquercitrin

圖7 不同天麻添加量對發酵基質中蘆丁降低量的影響Fig.7 The effect of different proportions of R.gastrodiae on the reduction of rutin in fermentation substrate

圖8 不同天麻添加量對發酵基質中異槲皮苷降低量的影響Fig.8 The effect of different proportions of R.gastrodiae on the reduction of isoquercitrin in fermentation substrate

2.4 灰樹花對不同添加量天麻主要成分的影響

微生物在生長代謝的同時會向外界分泌多種胞外酶：如纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶等[22-24]，分泌的胞外酶會按照各種酶的專一性選擇性地分解代謝有機物轉化為小分子。灰樹花分泌的胞外酶同樣可以作用于天麻的成分，選擇天麻所含的4種主要成分(GA、HA、HBA、巴利森苷)進行HPLC檢測，探究灰樹花對天麻4種成分的影響。圖9為天麻4種主要成分的混標圖,結果表明，在天麻添加量為10%～50%時，與未接種灰樹花(未發酵組)相比，接種灰樹花(發酵組)能夠幾乎完全分解GA。由表1可知，在天麻添加量為10%時，灰樹花對HA和HBA的分解最為顯著，表明高比例的天麻參與灰樹花固態發酵能夠抑制灰樹花對天麻本身對HA和HBA的分解；添加天麻都能夠提高巴利森苷的含量，其中50%天麻添加量提高其含量最為顯著。表明在天麻參與灰樹花固態發酵時，整個發酵體系存在著巴利森苷成分不同程度的生物轉化。文獻表明在微生物參與谷物進行發酵時，能夠改變整個發酵體系的生物活性的種類和含量，進而提高發酵物的食藥用價值[25-26]。

圖9 GA、HA、HBA、巴利森苷的標準對照品色譜圖Fig.9 Chromatograms of standard reference substances of GA, HA, HBA, and parishin

表1 灰樹花對不同天麻添加量基質中天麻主要成分的影響Table 1 Influence of G.frondosa on the main components of R.gastrodiae in different dosages of R.gastrodiae

3 結論

以貴州特色藥食同源作物苦蕎、薏仁米等為主要基質，接種灰樹花作為發酵菌種，灰樹花在此基質上能夠正常的生長代謝，灰樹花能夠有效分解利用苦蕎及薏仁米等基質，試研發創新一種新的適合灰樹花菌絲體生長的培養基質。以不同比例的中藥天麻參與灰樹花的固態發酵，研究天麻對發酵基質中主要活性成分含量的影響。結果表明，不同比例的天麻參與固態發酵，對灰樹花菌絲體的生長沒有明顯的抑制作用，同時天麻的加入能夠不同程度地促進灰樹花對基質中總黃酮物質的分解，通過提高總黃酮類物質的分解能力，提高大分子黃酮類物質轉化為小分子黃酮苷類物質，并且增加其水溶性和分子利用程度，進而提高菌質食藥用價值，并且灰樹花也能夠對天麻所含主要成分GA、HA、HBA等物質進行分解，與未發酵組相比都存在不同程度的分解，后期的研究重點主要為總黃酮類和3種主要天麻活性成分的具體轉化物質。發酵體系中巴利森苷的含量與未發酵組相比反而有所提高，表明通過灰樹花的發酵，可以進行巴利森苷成分的生物合成和富集。試驗驗證了灰樹花在非傳統基質上仍然能夠進行正常的生長，并且能夠分解總黃酮類物質,改變基質的表觀和內部結構，天麻參與其發酵能夠促進其分解總黃酮類物質。本研究拓展了中藥資源與大型真菌共發酵的思路和前景，為創新藥物菌質的品種提供了參考。