高劑量攝入火麻仁肽和火麻仁蛋白對小鼠腎功能的影響

朱艷，畢園，王雨辰，馬永慶，王憬，薛晨，谷瑞增，魏穎

(中國食品發酵工業研究院有限公司 北京蛋白功能肽工程技術研究中心，北京，100015)

腎臟疾病的發病與不良的飲食習慣密切相關，尤其是某些高蛋白食品的過量攝入，給腎臟的濾過功能造成了沉重的負擔[1]。但是對于健身愛好者和一些大病初愈的人群而言，為了達到增長肌肉和體力恢復的效果，高蛋白飲食必不可少。但是過量的補充蛋白質可能會增加機體罹患疾病的風險。因此，是否存在營養價值高且對機體腎功能損傷程度小的蛋白產品還值得我們進一步去發現。

火麻仁是桑科植物大麻的種子，又稱漢麻、線麻，是我國歷史悠久的藥用和食用物質[2]。火麻仁中營養物質含量豐富，蛋白質含量高達35.9%，不含抗營養因子[3]，易消化且含有理想的必需氨基酸成分，因此火麻仁蛋白是一種優質的植物蛋白來源[4]。對火麻仁蛋白進行氨基酸組成分析發現，精氨酸和谷氨酰胺含量豐富，其中精氨酸含量高達12%[5]，此外還含有很高的支鏈氨基酸[6]。火麻仁蛋白的特殊氨基酸組成賦予了它特殊的生理功能。研究表明，火麻仁蛋白具有抗疲勞[7]、提高運動員的營養指標[8]、增強免疫力[9]、抗氧化等生理功能。而火麻仁肽是以火麻仁蛋白為原料，通過酶解制備的生物活性肽，相比于蛋白質而言，生物活性肽的吸收能耗低、不易飽和，且轉運過程中無競爭性和抑制性[10]，因此其營養價值相比于蛋白質明顯提高。

因此，本文以火麻仁蛋白和火麻仁肽為研究原料，以正常小鼠和環磷酰胺誘導的免疫力低下小鼠為實驗對象，探究高劑量攝入火麻仁蛋白和火麻仁肽對正常小鼠和免疫力低下小鼠腎功能的影響。以期為將來相關食品和保健品的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

健康雄性6～8周雄性小鼠[許可證：SCXK(京)2016-0006]，北京維通利華實驗動物技術有限公司；環磷酰胺，江蘇盛迪醫藥有限公司；火麻仁蛋白和火麻仁肽，實驗室自制；總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathion peroxidase，GSH-PX)測定試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)測定試劑盒、肌酐(creatinine,CRE)檢測試劑盒、尿酸(uric acid,UA)檢測測試盒、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)檢測試劑盒，南京建成生物技術有限公司；小鼠免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)、免疫球蛋白 M(immunoglobulin M，IgM)酶聯免疫檢測試劑盒，北京百智生物科技有限公司。

Spectra MR多功能酶標儀，美國Dynex公司；721型紫外分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；動物麻醉機，北京眾實迪創科技發展有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 火麻仁蛋白和火麻仁肽的制備工藝

火麻仁蛋白和火麻仁肽的制備工藝如下：

火麻仁籽→80～100 ℃冷榨→超臨界萃取→火麻仁粕→粉碎、過篩→堿溶酸沉→火麻仁蛋白；

火麻仁蛋白→1∶10調漿→調溫度至55 ℃、調pH=5→1.5%酸性蛋白酶，30 min→1%中性蛋白酶、1%木瓜蛋白酶，3.5 h→滅酶→吸附、過濾、濃縮→冷凍干燥→火麻仁肽

1.2.2 火麻仁蛋白和火麻仁肽的基礎理化性質測定

參考GB 5009對水分[11]、灰分[12]、脂肪[13]、蛋白[14]含量進行測定；采用氨基酸分析儀測定火麻仁肽中游離氨基酸含量；采用凝膠色譜法測定火麻仁肽的分子質量分布[15]。

1.2.3 動物飼養分組與模型建立

36只健康雄性昆明小鼠，體重(40±2) g，飼養于20 ℃、通風良好的環境中。適應性喂養1周后，將小鼠隨機分為空白組(CM)、免疫力低下組(MG)、正常小鼠灌胃高劑量火麻仁蛋白組(CM+Prot)、正常小鼠灌胃高劑量火麻仁肽組(CM+Pept)、免疫力低下小鼠灌胃高劑量火麻仁蛋白組(MG+Prot)、免疫力低下小鼠灌胃火麻仁肽組(MG+Pept)，一共6個組，每組6只，蛋白和肽均按照10 g/kg體重(每日蛋白攝入量相當于運動員的攝入水平)的劑量進行灌胃，每天上午9～10時進行灌胃，持續30 d，空白組和免疫力低下組用等量的生理鹽水代替，每周進行體重記錄。在灌胃的第27天開始，連續3 d按照60 mg/kg的劑量對小鼠進行腹腔注射環磷酰胺誘導小鼠產生免疫力低下，正常小鼠除外。最后1次灌胃后，小鼠斷食不斷水12 h后，處死小鼠。

1.2.4 臟器指數測定

(1)

式中：m1，臟器質量，mg；m2，小鼠體重，g。

1.2.5 小鼠血清UA、CRE和BUN含量的測定

小鼠麻醉后，眼角采血，分離血清，按照試劑盒的要求檢測血清中UA、CRE和BUN的含量。

1.2.6 小鼠血清中IgG和IgM含量的測定

按照試劑盒要求用酶聯免疫吸附測定法檢測血清中IgG和IgM含量。

1.2.7 小鼠腎臟抗氧化能力的測定

小鼠處死后，解剖取其腎臟，于冰上進行勻漿，3 500 r/min離心10 min，測定上清液中SOD和GSH-PX活力以及MDA含量。

1.2.8 小鼠腎臟HE染色

小鼠處死后，解剖取其腎臟，切小塊置于組織固定液中，充分固定后，對其進行修剪和脫水，經浸蠟、包埋、切片、展片、烤片、脫蠟、至水后，用蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)進行染色，染色后進行脫水、透明和封片處理，最后用光學顯微鏡對腎組織病理學變化進行觀察，并使用顯微鏡數碼相機進行拍照。

1.3 數據分析

所有數據用X±SD表示，使用Origin 94進行統計學分析并作圖。單因素方差分析進行組間比較，t檢驗進行兩兩比較，P<0.05表示具有顯著差異性，P<0.01表示具有極顯著差異性。

2 結果與分析

2.1 火麻仁蛋白和火麻仁肽的基礎理化性質

表1為火麻仁蛋白和火麻仁肽的基礎理化性質，火麻仁蛋白中蛋白質含量為79.54%，灰分含量為10.52%，可見，本實驗室所制備的火麻仁蛋白中雜質含量較少，蛋白質含量豐富。通過酶解法制備的火麻仁肽中蛋白質含量高達82.84%，游離氨基酸含量為7.404%，肽含量為75.44%。通過凝膠色譜法對火麻仁肽的相對分子質量分布進行分析，結果如表2所示，火麻仁肽的分子質量分布主要在150～1 000 u，重均分子量為503.7 u，在這個范圍內的肽主要是由2～6個氨基酸組成的小肽組成。

表1 火麻仁蛋白和火麻仁肽的基礎理化性質 單位：%

表2 火麻仁肽的分子質量分布Table 2 Molecular weight distribution of hemp seed peptide

2.2 火麻仁蛋白和火麻仁肽對小鼠體重和臟器指數的影響

圖1為小鼠體重變化，隨著灌胃時間的增加，小鼠體重逐漸上升。環磷酰胺會引起小鼠體重的下降，火麻仁蛋白和火麻仁肽能夠在一定程度上防止體重的降低。表3為小鼠脾臟指數和腎臟指數的變化，可以看出高劑量的火麻仁蛋白和火麻仁肽對正常小鼠脾臟指數和腎臟指數無顯著的影響。環磷酰胺誘導后的小鼠，脾臟指數顯著降低(P<0.05)，腎臟指數顯著升高(P<0.05)，高劑量攝入火麻仁蛋白和火麻仁肽對環磷酰胺誘導后的小鼠的脾臟指數無顯著影響，但是能顯著降低小鼠的腎臟指數。

圖1 小鼠體重變化(n=6)Fig.1 The weight change of mice (n=6)

表3 火麻仁蛋白和火麻仁肽對小鼠臟器指數的影響(n=6)Table 3 Effects of hemp seed protein and hemp seed peptide on viscera index in mice (n=6)

2.3 火麻仁蛋白和火麻仁肽對小鼠血清UA、CRE和BUN含量的影響

圖2為小鼠血清中UA、CRE和BUN含量的變化。正常小鼠血清中UA、CRE和BUN含量與空白組相比沒有發生顯著的變化。與空白組小鼠相比，小鼠受到環磷酰胺的誘導后，血清中UA、CRE以及BUN含量顯著升高(P<0.05)，表明腎功能發生損傷，高劑量的火麻仁蛋白并不會增加免疫力低下小鼠的腎負擔，而且高劑量的火麻仁蛋白和火麻仁肽均顯著降低免疫力低下小鼠血清中UA、CRE和BUN的含量(P<0.05)，且與空白組無顯著差異。相比于火麻仁蛋白，火麻仁肽所呈現的效果更強。

a-血清UA含量；b-血清CRE含量；c-血清BUN含量圖2 小鼠血清UA、CRE和BUN含量變化(n=6)Fig.2 Changes of UA, CRE and BUN in serum of mice (n=6)注：不同小寫字母之間代表具有顯著差異(P<0.05)(下同)

2.4 火麻仁蛋白和火麻仁肽對小鼠血清IgG和IgM含量的影響

圖3為小鼠血清中IgG和IgM含量的變化。從結果中可以看出，小鼠經環磷酰胺誘導后，血清中IgG和IgM含量顯著降低(P<0.05)，說明環磷酰胺導致小鼠免疫力降低。對于正常小鼠，高劑量攝入火麻仁蛋白或火麻仁肽對小鼠血清中IgG和IgM含量無顯著的影響。對免疫力低下的小鼠而言，高劑量的火麻仁蛋白和火麻仁肽使得小鼠血清中IgG含量分別增加2.032、2.03 mg/mL。因此高劑量攝入火麻仁蛋白或火麻仁肽對正常小鼠和免疫力低下小鼠的免疫系統功能均不會產生負擔。

2.5 火麻仁蛋白和火麻仁肽對小鼠腎臟SOD和GSH-PX活力、MDA含量的影響

如圖4所示，小鼠經環磷酰胺誘導后，腎臟中SOD和GSH-PX活力顯著下降(P<0.05)，MDA含量顯著升高(P<0.05)。對于正常小鼠而言，火麻仁蛋白和火麻仁肽均能在一定程度上提高小鼠腎臟的抗氧化酶SOD和GSH-PX的活力，且灌胃火麻仁肽的小鼠抗氧化酶活力更強，但是對于MDA含量來說，火麻仁蛋白效果更好。對于免疫力低下的小鼠而言，高劑量的火麻仁肽能夠顯著提高小鼠腎臟中抗氧化酶SOD和GSH-PX活力(P<0.05)，且使得小鼠腎臟中MDA含量顯著降低(P<0.05)，火麻仁蛋白也具有較強的抗氧化作用，但是效果弱于火麻仁肽。

a-血清IgG含量；b-血清IgM含量圖3 小鼠血清中IgG和IgM含量的變化(n=6)Fig.3 Changes of IgG and IgM in serum of mice (n=6)

2.6 火麻仁蛋白和火麻仁肽對小鼠腎臟組織病理學形態影響

為了能更直觀的探究火麻仁蛋白和火麻仁肽對小鼠腎功能的影響，對小鼠腎臟進行了HE染色，觀察其病理學變化，結果如圖5所示，空白組小鼠腎組織結構正常，腎小管排列整齊，腎小球大小和形狀正常，無炎性細胞浸潤。經環磷酰胺誘導后的小鼠腎臟中細胞核數量明顯增多，炎性細胞浸潤明顯，腎小球體積增大，腎小囊囊腔擴張，腎間質中局部出現纖維化，腎功能受到一定程度的損害。對于正常小鼠而言，連續30 d灌胃高劑量的火麻仁蛋白和火麻仁肽后小鼠的腎臟沒有出現損傷現象，腎小球大小正常，無炎性細胞浸潤現象。對于免疫力低下小鼠，經灌胃火麻仁蛋白和火麻仁肽后的小鼠腎臟損傷程度明顯減輕，尤其是灌胃火麻仁肽的小鼠，細胞核數量明顯減少，炎性細胞浸潤現象減輕，腎小球體積減小，腎小囊囊腔擴張現象減輕，腎間質纖維化消失。由此可見，分別攝入高劑量的火麻仁蛋白和火麻仁肽均不會對小鼠腎臟造成損害，并具有一定程度的保護腎功能的作用。

a-小鼠腎SOD活力；b-小鼠腎GSH-PX活力；c-小鼠腎MDA含量圖4 小鼠腎臟SOD、GSH-PX活力和MDA含量的變化(n=6)Fig.4 Changes of the SOD and GSH-PX activity and the content of MDA in kidney of mice (n=6)

圖5 小鼠腎臟HE染色結果Fig.5 Results of HE staining of mice kidney

3 結論與討論

高蛋白飲食在健身愛好者、肥胖患者以及糖尿病患者中非常流行。研究表明，高蛋白飲食能夠幫助肥胖者減輕體重[16]，也可以幫助Ⅱ型糖尿病患者控制血糖[17]，更能幫助運動人群增長肌肉[18]。大量進食蛋白質會增加腎小球過濾和腎血流量，從而增加腎代謝負擔。但是不同來源的蛋白質對腎臟產生的影響不同，動物性蛋白對腎臟血流動力學的影響最為明顯，其次是乳蛋白，最后是植物源蛋白[19]。

火麻仁蛋白中含有人體必需的8種氨基酸，氨基酸組成合理，效價均衡，被稱為優質完全蛋白[20]。而火麻仁肽作為小分子生物活性肽，具有更強的生物活性。但是它們對機體腎功能的影響目前還不明確，因此，探究它們對腎功能的影響對進一步發掘其商業價值至關重要。

環磷酰胺是臨床上常用的一種烷化抗腫瘤藥，具有良好的抗腫瘤效果，但是常伴有免疫抑制、器官損傷，如腎臟、睪丸等損傷等副作用[21-22]。本實驗結果顯示，小鼠經環磷酰胺誘導后，小鼠脾臟指數、血清中IgG和IgM含量明顯降低，說明小鼠免疫功能受到抑制。研究表明，腎損傷模型中的小鼠體內激素分泌紊亂，導致腎臟的損傷和腫大[23]。結果顯示，環磷酰胺誘導后，小鼠腎臟指數增大，且HE染色結果顯示，小鼠腎小球體積增大，腎小囊囊腔擴張，體現在生化指標上時，血清中UA、BUN和CRE含量顯著上升，腎臟中抗氧化酶SOD和GSH-PX活力降低，MDA含量上升，因此，經環磷酰胺誘導后的小鼠免疫功能和腎功能均受到一定程度的損傷。

UA是體內嘌呤代謝的產物，血清中UN水平過高會導致尿酸鹽離子在腎臟的堆積、腎促炎因子的釋放以及增加氧化應激，從而引起腎損傷[24]。CRE是人體肌肉代謝的產物，BUN是蛋白質代謝的終產物，二者均是通過腎小球過濾排出體外[25]，二者在血液中的水平與腎功能水平具有密切聯系。本實驗結果顯示，高劑量攝入火麻仁蛋白和火麻仁肽均不會引起小鼠血液中UA、CRE和BUN水平發生顯著的變化，腎臟HE染色結果也顯示出二者對腎小球結構沒有明顯的影響。對于免疫力低下的小鼠，相對于火麻仁蛋白，高劑量攝入火麻仁肽對減緩環磷酰胺引起的腎臟損害效果更為顯著。這可能是因為相對于蛋白質，小肽具有更強的生理活性和營養價值，而且生物活性肽在機體中能夠起到載體作用，幫助將所食用的營養物質更快速的轉運到各種細胞、組織和器官[26]，從而增強了器官的生理機能。

氧化應激在各種腎病的發展中起著關鍵的作用，是導致慢性腎衰竭[27]、急性腎損傷等[28]的主要致病因素之一，因此降低機體的氧化應激狀態，對預防腎病的發生具有重要意義。實驗結果顯示，分別攝入高劑量火麻仁蛋白和火麻仁肽對正常小鼠和免疫力低下小鼠的腎臟抗氧化能力均能起到增強作用，且相比于蛋白，肽的抗氧化能力更強。本實驗所用的火麻仁肽重均分子量為503.7 u，主要由2～6個氨基酸組成的小肽組成，研究表明，小分子肽段與自由基反應時具有更小的空間位阻，因此表現出更強的抗氧化活性[29]。

綜上所述，火麻仁蛋白和火麻仁肽是優質的蛋白來源，高劑量攝入既不會對正常機體的腎功能造成損害，也不會對免疫力低下機體的腎功能造成損害，而且二者具有一定的腎功能保護和抗氧化作用。