基于高通量擴增子測序技術解析中高溫大曲微生物來源

周天慈，何宏魁，周慶伍，曹潤潔，馬葉勝，杜海*，徐巖*

1(工業生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)2(安徽古井貢酒股份有限公司，安徽瑞思威爾科技有限公司，安徽 亳州，236800)

根據白酒行業的報告，2019年中國白酒排行前50中，濃香型白酒占比54%，占據了中國白酒的大半江山[1]，而濃香型白酒的釀造離不開中高溫大曲的參與[2]。大曲俗稱“酒之骨”，為中國白酒發酵提供多種微生物。其中，以霉菌和酵母菌為主的真菌，是白酒發酵的重要功能微生物，可以分泌淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶等多種酶[3]。傳統中高溫大曲的生產是自然接種的自發固態發酵過程[4]。在發酵過程中，未經高壓滅菌的原料在從原料到成熟大曲的階段會暴露于許多環境(例如空氣、地面等)中[5]。因此，原材料和加工環境都是大曲菌群的重要來源。

隨著現代分子技術的發展，研究者可以借助高通量測序技術，進一步深入分析中高溫大曲微生物群落結構[6]。楊旭等[7]利用高通量測序技術，發現中高溫大曲在發酵開始及結束時，細菌的結構組成變化不大，乳桿菌屬(Lactobacillus)是整個大曲制作過程的優勢菌屬，而當曲溫達到頂溫時，克羅彭斯特菌屬(Kroppenstedtia)成為明顯優勢菌群。在發酵前期真菌以根霉屬(Rhizopus)、假絲酵母屬(Candida)及曲霉屬(Aspergillus)為主，發酵后期以毛霉屬(Mucor)和曲霉屬為主。李靜心等[8]使用高通量測序技術解析中高溫大曲與高溫大曲真菌群落的結構差異，發現中高溫大曲的真菌以酵母菌為主，霉菌僅占25%左右。其中，東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis)、熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)、阿氏絲孢酵母(Trichosporonasahii)等真菌為中高溫大曲所特有。目前利用高通量測序技術解析中高溫大曲菌群結構的研究已經大量涌現，極大的擴展我們對于中高溫大曲的認識。然而，關于中高溫大曲微生物菌群溯源仍缺乏系統性的研究。

針對以上問題，我們以中高溫大曲為對象，采用高通量擴增子測序技術解析了大曲制作過程、原料及多種環境中的微生物菌群結構組成，并采用微生物溯源分析手段分析了大曲微生物的來源。這項研究對于認識中高溫大曲的微生物來源提供了新見解，為制曲工藝的優化提供了科學參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

樣品收集于安徽省某酒廠，選擇3個曲房作為平行跟蹤采集樣本。在大曲制作之前，采集環境樣本，分別從室外地面(HSD)、室內空氣(HKQ)、室內草席(HCX)、室內墻壁(HQB)、室內曲架(HQJ)、室內屋頂(HWD)，6個位置采集環境樣品(圖1)，具體環境樣品的采集方法參考DU等[9]的取樣方法。大曲樣本分別在大曲發酵開始與發酵結束時采集，每個曲房約500 g。原料樣本從倉庫中隨機收集原料樣品(500 g)。最后，將所有27個樣品，包括6組環境樣品、原料樣品(YXM)、發酵開始大曲(YQ)、發酵結束大曲(MQ)，一式三份轉移到冰上的實驗室中，并在-80 ℃下保存直至提取DNA。

圖1 環境樣品采集示意圖Fig.1 Schematic diagram of environmental sample collection

1.2 試劑與儀器

氯化鈉、三氯甲烷、乙醇、異戊醇，國藥集團化學試劑(北京)有限公司；飽和酚溶液，生工生物工程(上海)股份有限公司。

NanoDrop蛋白核酸測定分光光度計，Thermo FisherScientific公司；高速冷凍離心機，Eppendorf 公司；Illumina MiSeq PE300、HiSeq測序平臺，Illumina公司。

1.3 核酸提取及測序

大曲環境及原料樣品基因組總DNA提取參考SONG等[10]的方法。使用NanoDrop儀器檢測基因組總DNA的濃度，并將提取的基因組DNA貯存在-80 ℃的冰箱中，以進行后續實驗。將每個樣品的基因組DNA進行3次PCR擴增，PCR反應體系和反應條件參考HERTZ等[11]的方法。混合同一個樣本的PCR產物后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。然后構建MiSeq文庫，并使用Illumina MiSeq PE300測序平臺進行測序，以獲得樣品中微生物群落的擴增子基因序列。

1.4 生物信息學分析

通過QIIME軟件分析和處理樣品微生物群落的擴增子基因序列，去除質量較差和含嵌合體的序列，并將相似度>97%的序列聚類為1個操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)。通過NCBI BLAST軟件將代表性的OTU基因序列與數據庫中的序列進行比較，以獲得OTU物種信息。然后，通過NCBI的BLAST軟件將高質量的基因序列與數據庫中的序列進行比較，以獲得該基因序列的物種信息。

1.5 數據分析及繪圖

統計分析采用 SPSS v.22進行，顯著性水平設定在0.05；Source Tracker(0.9.8)用于預測大曲中微生物群落的來源[12]；采用Origin 9.0繪圖，Adobe Illustrator CC 2019進行圖片整合。

2 結果與分析

2.1 大曲、原料及制作環境的微生物多樣性分析

本研究通過豐富度指數(Chao1)、系統發育多樣性指數(phylogenetic diversity (PD) whole tree)評價大曲、原料與環境的微生物多樣性。如圖2所示，在環境樣品中，室外地面中微生物的多樣性最高，室內屋頂中微生物的多樣性最低。我們發現從曲房室外到曲房室內環境樣品中微生物的多樣性都是逐漸降低的，因此得出從曲室外到曲室內是微生物菌種選擇富集的過程。

圖2-a、圖2-b表明發酵結束時大曲中的細菌多樣性比發酵開始時顯著提高(P<0.05)，也高于環境樣品及原料。從發酵開始到發酵結束，大曲細菌群落的多樣性增加。而圖2-c、圖2-d表明，發酵結束時大曲中的真菌多樣性低于發酵開始時的真菌多樣性。其中，細菌多樣性的變化與DU等[9]關于中溫大曲的研究結果一致，而真菌多樣性的變化則與之相反，這可能是不同品溫大曲制作過程中環境差異導致[13]。

2.2 細菌屬水平分析

高通量測序顯示所有樣品(大曲、原料及環境樣品)中在細菌屬水平共檢測到461個屬，大曲(發酵開始及發酵結束的大曲)中檢測到338個屬。其中，發酵結束時大曲中可檢測到334個屬，發酵開始大曲中僅有111個屬，而123個屬僅在制曲原料或環境樣品中能檢測到。

為了進一步分析大曲中細菌微生物群落，本研究將大曲、環境及原料中相對豐度>4%的屬定義為優勢屬，得到其屬水平信息如圖3-a所示，大曲、制曲原料及環境中的細菌主要歸屬于19個屬，且不同樣品中占據主要豐度的細菌幾乎均不相同。其中，環境樣品中室外地面檢測到的細菌以考克氏菌屬[Kocuria，(17.44±0.05)%]為主；在室內空氣和室內曲架檢測到的細菌以鏈霉屬(Streptomyces)為主，分別占(40.66±0.37)%、(79.40±0.01)%；室內草席檢測到的細菌中葡萄球菌屬[Staphylococcus，(58.32±0.01)%]的豐度最高；室內墻壁檢測到的細菌以放線孢菌屬[Actinomycetospora，(41.51±0.14)%]為主；室內屋頂檢測到的細菌糖多孢菌屬[Saccharopolyspora，(66.36±0.19)%]的豐度最高。而原料中檢測到的細菌擬諾卡氏菌屬[Nocardiopsis，(53.15±0.17)%]的豐度最高。早期研究表明，葡萄球菌屬、擬諾卡氏菌屬等在多種大曲中都有報道，是大曲中重要的功能細菌屬[14]。同時，中高溫大曲的生產原料主要以小麥為主，大部分不添加陳曲[15]，因此制曲環境在中高溫大曲的制作過程中起著至關重要的作用。

a、b-細菌的alpha多樣性；c、d-真菌的alpha多樣性圖2 大曲、原料及制作環境微生物的多樣性Fig.2 The diversity of microorganisms in Daqu, raw materials and environmental samples注：圖中不同小寫字母表示具有顯著性差異(P<0.05)

在發酵開始時大曲檢測到的細菌以魏斯氏菌屬[Weissella，(44.57±0.09)%]為主，發酵結束時大曲中細菌則以乳桿菌屬[(24.47±0.13)%]為主。這種變化可能是大曲制作過程中曲中含水量、酸度、溫度等理化性質變化對微生物的篩選作用導致的[16]。此外，發酵結束時大曲中魏斯氏菌屬[(3.32±0.12)%]、芽孢桿菌屬[(1.102±0.01)%]、葡萄球菌屬(Staphylococcus，(0.3272±0.02)%)等也占據較高的豐度，而已有研究表明乳桿菌屬、葡萄球菌屬、芽孢桿菌屬、魏斯氏菌屬等是大曲中重要的功能細菌[17]。其中葡萄球菌屬可代謝產生3-甲基-1-丁醇及乙偶姻等多種風味物質，為白酒中風味物質提供合成前體[18]。乳桿菌屬、魏斯氏菌屬等可代謝產生乳酸、乙酸等多種有機酸，這些物質在白酒中是重要的風味成分[14]。而芽孢桿菌屬能代謝淀粉酶、蛋白酶等多種水解酶，在維持大曲生態平衡中起著重要作用[19]。同時我們發現，海命菌屬(Marivita)、原綠球藻(Prochlorococcus)僅在發酵開始和發酵結束的大曲中檢測到，其他環境樣品及原料均未發現，可能來源于大曲用水。

為更直觀地說明大曲與原料及制曲環境中細菌的關系，本研究分別通過基于weighted UniFrac距離的主坐標分析(principal coordinate analysis，PCoA)和基于Bray-Curtis距離的層次聚類分析(hierarchical clustering analysis，HCA)進一步表征它們的關系(圖3-b,圖3-c)。PCoA結果顯示前2個坐標軸可代表細菌群落的44.29%，而且PCoA與HCA分析結果與群落結構結果一致，室內草席、室內空氣、室外地面、室內墻壁細菌群落距離較近，室內曲架、室內屋頂的細菌群落距離較近，發酵開始大曲與原料的細菌群落距離較近，而發酵結束大曲與其他任何樣品都距離較遠。因此，我們推測原料是發酵開始大曲中細菌群落的主要來源，經過大曲的制作過程，發酵開始時大曲中的細菌逐漸演替為發酵結束時大曲中的細菌。

a-屬水平大曲優勢細菌分布(平均豐度>4%)；b-基于weighted UniFrac距離的細菌主坐標分析；c-細菌層次聚類分析圖3 大曲、原料及環境樣品細菌群落結構Fig.3 Bacterial community compositions of Daqu, raw materials and environmental samples注：圖a中圓大小根據平均豐度的開方值設置(圖4同)

2.3 真菌屬水平分析

高通量測序顯示所有樣品中在真菌屬水平共檢測到69個屬，大曲中可檢測到31個屬。其中發酵結束大曲中可檢測到31個屬，發酵開始大曲中僅有25個屬，多的6個屬則可能來自制曲環境或者原料。已有研究共檢測到中溫大曲真菌79個屬[9]，這可能是中高溫大曲與中溫大曲制作環境與程序差異導致的。

由于真菌屬水平數量較少，為和上文細菌優勢屬數目一致，本研究將大曲、環境及原料中相對豐度>2%的屬定義為優勢種屬，得到其水平信息如圖4-a所示，曲霉屬和根霉屬，在所有樣品中均占據極高的豐度。而早期研究證明，根霉屬和曲霉屬可以代謝產生大量的高活性蛋白酶和葡糖淀粉酶，為大曲中酶的主要來源[20]。在發酵開始時大曲中曲霉屬[(39.14±0.21)%]、假絲酵母屬[(6.39±0.31)%]、根霉屬[(0.3739±0.01)%]為優勢真菌屬。這與楊旭等[7]解析的河南地區中高溫大曲發酵前期結果相似，都以假絲酵母屬、根霉屬和曲霉屬為主。在發酵結束時，大曲中除了根霉屬[(30.65±0.53)%]、假絲酵母屬[(23.68±0.11)%]、曲霉屬[(12.9±0.32)%]之外，嗜熱子囊菌屬[Thermoascus，(23.96±0.01)%]也逐漸成為優勢真菌屬。其中，假絲酵母屬真菌可以代謝產生乙酸乙酯、4-羥基-2丁酮等多種風味物質，是白酒發酵中的重要功能微生物[21]。以前的研究表明，在河南地區的中高溫大曲處于發酵后期時，真菌以毛霉屬和曲霉屬為主[7]，這可能是兩地區制曲用水及原料不同導致的。同時與其他樣品中某一種真菌占據高的豐度相比，在發酵結束時大曲檢測到的真菌結構較為均勻，這說明在大曲制作過程中真菌微生物發生了生物篩選。

使用PCoA與HCA分析結果進一步表明大曲、原料及環境中檢測到的真菌群落分布規律(圖4-b、圖4-c)。室內草席、室內空氣、室外地面、室內曲架的真菌群落結構較為相似；而與室內墻壁、室內的真菌群落結構存在較大差異。

a-屬水平大曲優勢真菌分布(平均豐度>2%)；b-基于weighted UniFrac距離的真菌主坐標分析；c-真菌層次聚類分析圖4 大曲、制曲原料及環境真菌群落結構Fig.4 Fungal community compositions of Daqu, raw materials and environmental samples

2.4 大曲中的優勢微生物來源分析

利用SourceTracker，以大曲生產的原料及制曲環境的優勢屬微生物為來源端，以發酵開始時大曲的優勢屬微生物為接受端，追蹤發酵開始大曲中微生物的來源，并依此判斷發酵開始時大曲中微生物的來源(圖5)。

a-發酵開始大曲微生物不同來源分析；b-發酵開始大曲細菌的溯源分析；c-發酵開始大曲真菌的溯源分析圖5 發酵開始大曲優勢微生物溯源分析Fig.5 Source tracking analysis of dominant microorganisms in new Daqu

圖5-a顯示，發酵開始時大曲中細菌89.3%來自于原料小麥。其中原料是發酵開始時大曲中糖多孢菌屬、葡萄球菌屬、擬諾卡氏菌屬、短桿菌屬等的主要來源(圖5-b)。早期研究表明，這些細菌在小麥內生菌中也是主要的種群[22]。同時，室內草席還對發酵開始時大曲中細菌貢獻了5.6%。其中，室內草席是魏斯氏菌屬、串珠菌(Leuconostoc)等的主要來源。以上分析結果表明，制曲原料是發酵開始大曲中細菌主要來源，而制曲的環境對細菌貢獻較少。

發酵開始大曲中的真菌主要來自于室外地面，貢獻了53.7%的微生物(圖5-c)。其中，發酵開始大曲中鏈格孢屬(Alternaria)、枝孢菌(Cladosporium)、根霉屬等真菌主要來源于室外地面。此外，發酵開始大曲中的真菌23%來源于室內屋頂。其中，發酵開始大曲中曲霉屬、Trichomonascus等主要來源于室內屋頂。以上分析結果表明，制曲的環境是發酵開始大曲中真菌主要來源，而原料對真菌的貢獻不大。

3 結論

本研究主要解析了環境及原料對中高溫大曲的影響。研究結果表明，從曲房外到曲房內環境樣品中微生物的多樣性都是逐漸降低的，這是微生物菌種選擇、富集的過程。從大曲發酵開始到結束，細菌群落多樣性增加，而真菌群落多樣性降低。發酵開始時大曲中檢測到111個細菌屬，主要以魏斯氏菌屬為主；結束時大曲中可檢測到334個細菌屬，主要以乳桿菌屬為主。發酵開始時大曲中檢測到25個真菌屬，結束時曲中檢測到31個真菌屬，而發酵開始和結束大曲中的真菌主要以曲霉屬和根霉屬為主。基于Source Tracker計算的結果，發酵開始大曲中89.3%的細菌來自于原料，5.6%來自于室內草席；發酵開始時大曲中真菌53.7%來源于室外地面，室內屋頂貢獻了23.0%。綜上所述，本研究強調中高溫大曲的制造環境(主要是室外地面和室內屋頂)是大曲真菌群落的主要來源，而原材料則是細菌群落的主要來源，從生物學的角度為制曲工藝的調整、優化甚至現代化提供參考依據。