越橘花色苷的酰化修飾及其穩定性改善研究

洪森輝，黃冰晴，張晶怡，費鵬*

1(閩南師范大學 生物科學技術學院，福建 漳州，363000)2(閩南師范大學 閩臺特色園林植物福建省高校重點實驗室，福建 漳州，363000)

蔓越橘屬于杜鵑花科、越橘屬(Vacciniumspp.)多年生落葉或常綠灌木，在全世界廣泛分布[1]。越橘中含有豐富的花色苷，其含量在目前已測蔬菜與水果中較高。BARON等[2]從蔓越橘中提取了花色苷并進行分離鑒定，結果表明越橘花色苷中主要包括15種花色苷，是由矢車菊素、飛燕草素、芍藥色素、牽牛花色素和錦葵色素分別與葡萄糖、半乳糖以及阿拉伯糖通過糖苷鍵結合形成的。花色苷在酸性條件下形成穩定的紅色烊陽離子，并在堿的存在下部分轉變為醌類結構并呈現藍色[3-4]。這種特性使它們可以用于制備有顏色指示的智能食品包裝材料，用以監測肉類食品的腐敗變質[5-7]。

花色苷在貯藏和加工過程中容易降解和褪色，極大地影響了其在智能包裝中的應用。除了pH、光、氧[8]等外部因素外，花色苷的結構對其穩定性也有很大的影響。有研究表明花色苷中2-苯基苯并吡喃陽離子結構中羥基的增加通常會導致其穩定性的降低，而甲基化程度的增加有利于提高花色苷的穩定性[9]。游離羥基的糖基化也增強了花青素的穩定性，這是由于糖鏈可以像緞帶一樣在2-苯基苯并吡喃骨架表面堆積，這種堆積可以防止花色苷因水合平衡的轉換而褪色，從而保持其顏色穩定性[10]。部分天然花色苷常被酰化修飾，常見的酰基基團有芳香酸(如阿魏酸、芥子酸、沒食子酸等)和脂肪酸(如丙二酸、乙酸、蘋果酸、琥珀酸、草酸)[11]。有研究表明，在同種情況下，酰基化的花色苷比非酰基化的花色苷穩定性更好[10,12-13]，這是因為酰基的位阻效應使花色苷更不容易受到水攻擊和阻礙，抑制甲醇假堿和查爾酮結構的形成。YANG等[14]利用月桂酸對黑豆花色苷進行酰化改性，結果表明改性花色苷的熱穩定性顯著提高了。本課題組在前期通過固相反應法將馬來酸酐接枝到花色苷分子上，其褪色率顯著降低[15]，但其穩定性仍不理想。

本研究采用酶催化方法將3,4-二羥基苯甲酸及沒食子酸接枝到越橘花色苷分子上以提高其穩定性，為越橘花色苷的進一步研究和開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

越橘(蔓越橘，Vaciniummacrocarpon)花色苷粗提物，西安圣青生物有限公司；脂肪酶(Novozymes 435，≥5 000 U/g，重組酶，在黑曲霉中表達)、3,4-二羥基苯甲酸、沒食子酸，上海阿拉丁試劑有限公司；油酸、β-胡蘿卜素、DPPH，上海麥克林試劑有限公司；四氫呋喃、無水乙醇、吐溫-80、檸檬酸、鹽酸、磷酸氫二鉀，西隴化工股份有限公司。本文所用試劑，如無特別說明，均為分析純。

1.2 儀器設備

MultiSkan Go全波長酶標儀、NICOLET IS 10傅里葉紅外光譜儀，美國賽默飛世爾有限公司；旋轉蒸發儀，上海力辰儀器科技有限公司；T9紫外-可見分光光度儀，北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 酰化花色苷的制備

將10 g越橘花色苷粗提物溶于300 mL無水乙醇，隨后用微孔膜過濾去除花色苷中的蛋白質、多糖、果膠等；然后在50 ℃下旋轉蒸發以去除濾液中的無水乙醇；最后，通過冷凍干燥進一步去除溶劑，所得樣品即為越橘花色苷，記作Na-An。

將4 g越橘花色苷溶于100 mL去離子水并加入1 g Novozymes 435脂肪酶混合均勻；將15 mmol的3,4-二羥基苯甲酸溶于100 mL四氫呋喃；然后將上述2種液體混合，并將其置于50 ℃下磁力攪拌24 h進行酶催化反應；反應完成后，通過微孔濾膜過濾去除混合液中的脂肪酶；隨后，在50 ℃下旋轉蒸發以去除混合液中的四氫呋喃，再通過冷凍干燥去除水分；接著，將所得固體樣品分散于100 mL四氫呋喃中，攪拌10 min后通過微孔濾膜過濾，取濾渣，重復3次以洗去固體樣品中的未反應的酚酸；最后，通過冷凍干燥去除濾渣中剩余的四氫呋喃，收集樣品即為3,4-二羥基苯甲酸修飾的越橘花色苷，記作Dh-An。

用同樣方法制備沒食子酸修飾的越橘花色苷，記作Ga-An。

1.3.2 酰化度測定

采用電位滴定法測定花色苷的酰化度(acylation degree，AD)[16-17]。將0.2 g的花色苷(或酰化花色苷)溶解于20 mL 0.1 mol/L NaOH溶液中，在40 ℃下攪拌2 h使花色苷水解并皂化；隨后，用0.01 mol/L的HCl溶液滴定至pH值為9.0。按照公式(1)、公式(2)計算酰化花色苷的酸值(acid value，AV)和AD：

(1)

AD/%=M×(AV1-AV0)×100

(2)

式中：C0為皂化使所用NaOH溶液濃度(0.1 mol/L)；V0為皂化使所用NaOH溶液體積(20 mL)；C1為滴定使所用NaOH溶液濃度(0.01 mol/L)；V1為滴定使所用NaOH溶液體積；m為所用花色苷質量；M為接枝基團的相對分子質量;AV1為酰化花色苷的酸值；AV0為原始花色苷的酸值。

1.3.3 總花青素含量測定

通過pH差示法測定花色苷中的總花青素含量(total anthocyanin content，TAC)，具體參照李曉嬌等[18]方法。分別用pH 1.0(0.5 mol/L檸檬酸/鹽酸)和pH 4.5(0.5 mol/L檸檬酸/磷酸氫二鉀)的緩沖液將2份10 mL花色苷溶液(5 g/L)稀釋至250 mL；在黑暗中放置1 h后，用酶標儀分別測定2種溶液在513和700 nm處的吸光度。花色苷的TAC值計算如公式(3)和公式(4)所示：

(3)

A=(A513 nm-A700 nm) pH1.0-(A513nm-A700nm) pH4.5

(4)

式中：A表示吸光度；MW為矢車菊蘇-3-O-葡萄糖的相對分子質量，為449.2 g/moL；ε為摩爾消光系數，為26 900 L/(mol·cm)；DF為稀釋因子；L為光程。

1.3.4 DPPH自由基清除率測定

用無水乙醇稀釋0.25 mmol/L DPPH乙醇溶液至其在513 nm處吸光度約為0.8；向4 mL的DPPH溶液中加入0.05 mL花色苷溶液，在黑暗中靜置30 min后，測定其在513 nm處的吸光度；參照樣品不加花色苷溶液，以50 μL無水乙醇替代；通過公式(5)計算花色苷的DPPH自由基清除率：

(5)

式中：A0為參照樣在513 nm處的吸光度，A1為樣品在513 nm處的吸光度。

1.3.5 β-胡蘿卜素漂白抑制率測定

參照YANG等[19]，將10 mL β-胡蘿卜素氯仿溶液(1 mg/mL)、400 mL亞油酸和4 mL吐溫-80在梨形瓶中充分混合后，在40 ℃旋轉蒸發除去氯仿。隨后，在梨形瓶中加入100 mL蒸餾水，將混合后的液體均勻混合成乳化液；然后取10 mL乳化液并稀釋至100 mL，制得乳化稀釋液；將0.1 mL的花色苷溶液加入到4.9 mL的乳化稀釋液中，混合均勻后測定其在470 nm處相應的吸光度；然后將樣品置于50 ℃恒溫水浴2 h，并測定其在470 nm處吸光度。參照樣中不加花色苷溶液，用體積分數為70%的乙醇溶液代替。通過公式(6)計算β-胡蘿卜素漂白法的抑制率：

(6)

1.3.6 穩定性測定

取10 mL花色苷溶液，將其置于25 ℃環境下貯存，每12 h測量1次花色苷溶液在513 nm處的吸光度，根據公式(7)計算花色苷溶液的褪色率：

(7)

式中：A0為花色苷溶液的初始吸光度(513 nm處)，A1為貯存一定時間后花色苷溶液在513 nm處的吸光度。

1.3.7 結構表征

通過NICOLET IS 10傅里葉變換紅外光譜儀(Fourier transform infrared spectrometer，FTIR)表征花色苷的官能團，波數范圍為4 000～400 cm-1，分辨率為16 cm-1；采用在T9紫外可見分光光度計(UV-visible spectroscopy，UV-Vis)測定其在200～800 nm處的吸光度。

2 結果與分析

2.1 UV-Vis分析

采用UV-Vis研究了3,4-二羥基苯甲酸及沒食子酸改性對越橘花色苷分子結構的影響，結果如圖1所示。越橘花色苷在～279 nm和～523 nm處有2個特征吸收峰，是由花色苷的吡喃環上的電子躍遷造成的。早在1958年，HARBORNE等[20-22]已經開始報道UV-Vis光譜學在花青素結構鑒定中的應用。研究結果表明，花色苷UV-Vis譜圖上300～350 nm處的肩峰是由酰基造成的，且其在該處的吸光度與可見光區最大吸收強度的比值表示花色苷酰化程度。由圖1可以看出，與天然越橘花色苷相比，改性花色苷在～312 nm處出現了明顯的肩峰，表明3,4-二羥基苯甲酸和沒食子酸都通過酰化反應接枝到花色苷分子上，而不是與花色苷物理共混。

a-紫外光區；b-可見光區圖1 越橘花色苷及改性花色苷的UV-Vis圖譜Fig.1 UV-Vis spectra of native and acylated anthocyanins

2.2 FTIR分析

a-4 000～400 cm-1；b-2 000～1 000 cm-1圖2 越橘花色苷及改性花色苷的紅外光譜圖譜Fig.2 FTIR spectra of native and acylated anthocyanins

2.3 酰化度和花青素含量分析

通過電位滴定法測定了越橘花色苷酰化反應后的酰化度。如圖3-a所示，3,4-二羥基苯甲酸及沒食子酸修飾花色苷的酰化度分別為4.65%(Dh-An)和4.53%(Ga-An)。如圖3-b所示，天然越橘花色苷中的花青素含量為373.3 mg/g，酰化改性后，Dh-An 中花青素含量為167.9 mg/g，Ga-An中花青素含量為154.8 mg/g。這可能是由于以下幾個方面造成，一方面，外來基團接枝到花色苷分子上，導致單位質量的花色苷中的花青素含量降低。另一方面，花青素含量是通過pH差示法測定的，其依據是花色苷的發色團結構轉變是環境pH的函數，而起干擾作用的褐色降解物顏色不隨pH值的變化而變化。在酰化反應過程中，可能會有部分花色苷發生降解并形成褐色降解物從而造成TAC降低。

a-酰化度；b-花青素含量圖3 越橘花色苷及改性花色苷的酰化度和花青素含量Fig.3 AD and TAC of native and acylated anthocyanins注：不同大寫字母代表差異顯著(P<0.05)；不同小寫字母代表差異極顯著(P<0.01)(下同)

2.4 抗氧化活性分析

圖4反映了越橘花色苷在酰化反應前后DPPH自由基清除率和β-胡蘿卜素漂白抑制率的變化。如圖4-a所示，天然越橘花色苷的DPPH自由基清除率為73.5%，接枝酚酸后，該值分別上升至85.6%(Dh-An)和91.6%(Ga-An)。這是由于花色苷分子為DPPH自由基提供電子從而使其褪色，花色苷分子上的酚羥基是良好的電子供體，可以有效清除DPPH自由基。酚酸分子上也有酚羥基，同樣是良好的抗氧化劑，當其接枝到花色苷分子上后極顯著(P<0.01)提高了越橘花色苷的抗氧化活性。另外，3,4-二羥基苯甲酸分子上有2個酚羥基，而沒食子酸分子上有3個酚羥基，因此可以觀察到Ga-An的DPPH自由基清除率高于Dh-An。

在β-胡蘿卜素漂白實驗中，油酸在加熱過程中被氧化生成自由基并造成β-胡蘿卜素被漂白褪色。花色苷的加入可以有效清除油酸反應生成的自由基并抑制β-胡蘿卜素褪色[1-3]。由圖4-b可以觀察到，天然越橘花色苷的β-胡蘿卜素漂白抑制率為65.9%，接枝3,4-二羥基苯甲酸和沒食子酸后，該值分別上升至79.5%和84.8%。

a-DPPH自由基清除率；b-β-胡蘿卜素漂白抑制率圖4 越橘花色苷及改性花色苷的DPPH清除率和β-胡蘿卜素漂白抑制率Fig.4 DPPH clearance and inhibition ratio in β-carotene bleaching assay of native and acylated bilberry anthocyanins

2.5 花色苷穩定性分析

花色苷以其優異的抗氧化活性和鮮艷的顏色而聞名，它們在空氣中很容易被氧化和變色。圖5反映了在25 ℃的貯藏條件下，天然花色苷和改性花色苷溶液的褪色率變化。如圖5所示，隨著貯存時間的延長，花色苷溶液的褪色率不斷上升。顯然，氧化和水解破壞了越橘花色苷的分子結構，生成無色的甲醇假堿和查爾酮，導致花色苷溶液不斷褪色。

圖5 越橘花色苷及改性花色苷的褪色率Fig.5 The fading degree of native and acylating anthocyanins

與天然越橘花色苷相比，經酚酸修飾后的花色苷的褪色率較低，穩定性提高。顯而易見，酚酸的接枝抑制了花色苷的氧化和分解。3,4-二羥基苯甲酸和沒食子酸對花色苷的保護作用可能體現在兩個方面。一方面，作為良好的抗氧化劑，3,4-二羥基苯甲酸和沒食子酸以其自身的氧化為代價阻止了花色苷被空氣中的氧氣氧化。由于沒食子酸的抗氧化能力強于3,4-二羥基苯甲酸，因此Ga-An的褪色率也要顯著(P<0.01)低于Dh-An。另一方面，3,4-二羥基苯甲酸和沒食子酸分子可能會堆積在在花青素的苯環上，阻礙了花色苷的水解，并抑制其構型轉換及褪色。

3 結論

為了克服天然花色苷在應用過程中易褪色的問題，本文擬通過3,4-二羥基苯甲酸和沒食子酸對天然越橘花色苷進行酶法修飾，以提高其穩定性。UV-Vis、FTIR分析表明，在脂肪酶(Novozymes 435)的催化作用下，3,4-二羥基苯甲酸和沒食子酸可通過酰化反應接枝到越橘花色苷分子的糖基上。酚酸是良好的天然抗氧化劑，當其接枝到花色苷上，大大提高了花色苷的抗氧化活性。酚酸抗氧化活性主要來自其分子上的酚羥基，每個3,4-二羥基苯甲酸分子上有2個酚羥基，而沒食子酸分子上有3個酚羥基，因此，Ga-An組的DPPH自由基清除能力和β-胡蘿卜素漂白抑制率要強于Dh-An組。除了抗氧化活性，酰化花色苷的顏色穩定性也要顯著高于天然越橘花色苷。一方面，3,4-二羥基苯甲酸和沒食子酸通過自身被氧化為代價阻止了花色苷被空氣中的氧氣氧化。另一方面，酚酸分子可能會堆積在花青素的苯環上，阻礙了花色苷的水解，并抑制其褪色。