外源基因表達對解脂亞羅酵母糖醇代謝影響的初步研究

周蕓琪，李紅嬌，李克文，郭蓓，裴疆森*

1(中國食品發酵工業研究院有限公司，北京，100015)2(保齡寶生物股份有限公司，山東 禹城，251200)3(北京農學院 生物與資源環境學院，北京，102206)

赤蘚糖醇廣泛存在于酵母、蘑菇、藻類等微生物和多種水果中，作為四碳多元醇甜味劑，具有一定的抗氧化活性且熱量低、無吸濕性、穩定性高[1]。赤蘚糖醇在人體代謝中不改變血糖和胰島素水平[2]，作為功能性代糖更適合肥胖癥和糖尿病患者[3-4]；一般不被口腔細菌利用不引起齲齒，被廣泛應用于醫藥和食品行業[5-6]。赤蘚糖醇主要由耐高滲酵母菌，如畢赤酵母屬(Pichia)，亞羅酵母屬(Yarrowia)，假絲酵母屬(Candida)等作為生產菌株[7-9]，以葡萄糖為底物發酵，后續經過濾分離純化等步驟得到赤蘚糖醇，具備較高的生產效率、反應溫和且成本低[10]。酵母菌在需氧條件下主要通過磷酸戊糖途徑合成赤蘚糖醇，葡萄糖經己糖激酶催化生成6-磷酸葡萄糖，再在轉酮酶催化下轉化為4-磷酸赤蘚糖，由4-磷酸赤蘚糖激酶去磷酸化生成赤蘚糖，最后由赤蘚糖還原酶催化加氫生成赤蘚糖醇[11-12]。

解脂亞羅酵母(Yarrowialipolytica)是一種非常規酵母，常用表達載體均為整合型載體，能將目的基因整合到酵母基因組保證遺傳的穩定性[13]，已完成全基因組和線粒體基因序列測序，部分基因功能得到注釋，設計有成熟的組成型和誘導型啟動子[14-15]，便于進行基因操作，且已經建立了成熟的工業化發酵體系，可利用碳源范圍廣泛并分泌大量代謝產物如脂質、多元醇、有機酸等，能夠定向分流代謝途徑生產具有一定價值的化合物[16]，所以解脂亞羅酵母逐步發展為一種外源蛋白表達宿主[17]。pINA系列質粒用于整合解脂亞羅酵母，hp4d強啟動子由4個連續的UAS1激活序列和最小的Leu2啟動子重組構成，它介導的異源蛋白基因在穩定期前期啟動表達，這種生長與表達非偶聯的方式可避免外源蛋白對細胞的毒害作用[18]。

利用代謝工程技術在鑒定新基因和研究解脂亞羅酵母赤蘚糖醇合成途徑方面取得了比較廣泛的進展。JANEK等[19]在解脂亞羅酵母中過表達YALI0F18590g基因可能編碼的赤蘚糖還原酶(erythrose reductase,ER)，其中ER的氨基酸序列與已知赤蘚糖醇生產菌的高度相似，該研究首次鑒定、過表達赤蘚糖醇合成途徑中涉及的天然赤蘚糖還原酶基因最終使赤蘚糖醇產率提高。CARLYA等[20]過表達甘油激酶GUT1基因和轉酮酶TKL1基因，并破壞分解代謝中赤蘚酮糖激酶EYK1基因，獲得的菌株赤蘚糖醇產率比野生型高75%，培養時間減少40%，且菌株不消耗自身產生的赤蘚糖醇，能夠進一步提高生產效率，在后續的研究中[21]分離并鑒定了YALI0F01650g基因，認為該基因編碼赤蘚糖醇脫氫酶重命名為EYD1，在破壞EYK1基因的解脂亞羅酵母菌中過表達EYD1，從赤蘚糖醇得到赤蘚糖。

本研究基于前期對1株酵母Zygoascushellenicus全基因組測序獲得的一段含有核苷酸結合域的可能具有糖激酶功能的開放閱讀框(open reading frame，ORF)序列，該序列與已知編碼赤蘚糖醇代謝途徑中相關激酶的序列相比同源性較低。鑒于目前對于赤蘚糖醇合成相關途徑糖磷酸化酶的研究較為欠缺，本研究嘗試將該基因克隆到解脂亞羅酵母菌中進行表達，對該基因的功能進行初步驗證，并考察基因轉化對酵母碳源同化能力的影響，為進一步優化解脂亞羅酵母糖醇代謝工程改造開拓新的方向。

1 材料與方法

1.1 菌種與質粒

解脂亞羅酵母Po1g、Zygoascushellenicus酵母、pINA1269質粒、大腸桿菌DH5α均由所在實驗室保藏。

1.2 培養基與試劑

LB培養基(g/L)：酵母提取物5，蛋白胨10，氯化鈉10，滅菌條件為121 ℃，20 min；YPD培養基(g/L)：酵母提取物10，蛋白胨20，葡萄糖20；YNB培養基(g/L)：酵母含氮堿基(不含氨基酸)6.7，葡萄糖20。其中，固體培養基添加2%(質量分數)瓊脂，在接種和涂板前按需在培養基中加入相應抗生素或營養元素(50～100 μg/mL氨芐或0.1 g/L亮氨酸)，培養基中含葡萄糖時，滅菌條件為115 ℃，25 min，酵母含氮堿基采用過濾除菌。發酵種子液培養基(g/L)：酵母提取物3，蛋白胨5，葡萄糖50；發酵培養基(g/L)：葡萄糖100，酵母提取物5，檸檬酸三銨5，硫酸鎂0.25，磷酸二氫鉀0.25[22]，木糖醇、山梨糖醇、甘油、赤蘚糖醇、D-木糖、核糖、D-阿拉伯糖、甘露糖醇10，滅菌條件115 ℃，20 min。赤蘚糖醇母液發酵培養基(g/L)：20%(質量分數)赤蘚糖醇分離液(母液)，酵母提取物5，檸檬酸三銨5。

DNA限制性內切酶，NEB公司；T4 DNA連接酶、TaqDNA聚合酶和克隆載體pMD18-T Vector，TaKaRa公司；PfuDNA聚合酶、50X TAE緩沖液，上海生工生物工程股份有限公司；質粒提取試劑盒、酵母基因組提取試劑盒、DNA Maker，天根生化科技有限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒，Omega Bio-Tek公司；PEG 4000，北京博奧拓達科技有限公司；其他常規試劑采用進口或國產分析純。引物合成和測序由上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.3 儀器與設備

Agilent 1260高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；Carbomix Ca-Np強陽離子鈣型色譜交換柱，Sepax Technologies公司；Tanon 1600全自動數碼凝膠圖像分析儀，上海天能公司；Bio-rad C1000梯度PCR儀，美國伯樂公司；BG-Power 600通用電泳儀，北京百晶生物技術有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 目的基因片段的克隆

首先提取出發菌株Z.hellenicus希臘接合酵母的基因組DNA作為模板，根據目的基因序列結合pINA1269的多克隆位點，設計擴增目的片段的正向引物spx-F攜帶PmlI酶切位點，反向引物spx-R攜帶KpnI 酶切位點，引物序列如表1所示。PCR反應體系50 μL，反應程序為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 45 s，30個循環；72 ℃延伸7 min。

表1 用于PCR擴增目的基因的引物Table 1 Primers used for PCR amplification of target genes

1.4.2 解脂亞羅酵母表達載體的構建

瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，凝膠回收后連接到pMD18-T克隆載體上，轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞，涂布在含氨芐抗性的LB固體平板，37 ℃培養過夜，挑轉化板上單菌落，接種到含氨芐抗性的LB液體培養基，37 ℃，200 r/min振蕩培養12 h后提取質粒DNA，雙酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳驗證酶切片段，經驗證構建成功的重組克隆T載體送至上海生工生物工程股份有限公司測序。

將解脂亞羅酵母表達載體pINA1269與構建成功的重組克隆T載體分別經PmlI、KpnI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳后回收線性化質粒和目的片段，用T4 DNA連接酶16 ℃過夜連接并轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，涂布到含氨芐抗性的LB固體平板37 ℃培養過夜，挑取長出的單菌落接入LB氨芐液體培養基搖床培養12 h，提取質粒DNA，經PCR驗證和雙酶切驗證，雙重驗證后的陽性克隆子送至上海生工生物工程股份有限公司測序，即為所要構建的解脂亞羅酵母表達載體。重組載體構建流程如圖1所示。

圖1 pINA1269-spx重組載體的構建Fig.1 Construction of pINA1269-spx

1.4.3 醋酸鋰化學轉化以及重組菌的鑒定

制備宿主菌解脂亞羅酵母細胞感受態，解脂亞羅酵母菌株Po1g劃線于YPD固體培養基，30 ℃培養2 d 后，挑取單菌落于YPD液體培養基，30 ℃，220 r/min 搖床培養18 h，接種到50 mL YPD培養基中(使初始OD600在0.15左右)，30 ℃振蕩培養4 h(至OD600=0.4～0.6)，將菌液分裝后4 000 r/min 離心5 min，棄上清液，收集菌體，用100 mmol/L LiAc溶液重懸，即為酵母感受態細胞。

用限制性內切酶NotI線性化處理驗證正確的重組表達載體pINA1269-spx，凝膠回收即得待轉化的酶切純化載體，將其導入宿主菌解脂亞羅酵母感受態細胞中，轉化體系為100 ng酶切純化載體，600 μL 50%PEG4000，10 μL滅活的鮭魚精DNA，100 μL酵母感受態，輕輕混勻后30 ℃孵育30 min，42 ℃熱激15 min，期間每隔5 min輕輕顛倒混勻，將處理后的酵母轉化體系混合液離心棄上清液，用100 μL培養基重懸涂布于YNB固體篩選培養基，28 ℃倒置培養3 d，挑取在篩選培養基上生長的酵母轉化子，以spx-F和spx-R為引物進行菌落PCR初步驗證，同時接種至YPD液體培養基30 ℃，220 r/min活化培養18 h，并提取陽性轉化子基因組，以spx-F和spx-R為引物再次驗證，收集菌液用甘油冷凍管保藏。驗證為陽性的轉化子，送樣測序，得到成功導入目的基因片段的解脂亞羅酵母重組菌株。

1.4.4 解脂亞羅酵母重組菌株的培養以及對碳源的利用和轉化實驗

1.4.4.1 解脂亞羅酵母的培養與同化實驗

將未改造的宿主菌株和已驗證的重組菌株甘油管菌液分別劃線于YPD和YNB固體培養基，28 ℃倒置培養。用接種環挑取單菌落分別接種到2.5 mL發酵種子液培養基，28 ℃，220 r/min搖床培養24 h，隨后將種子液以10%的接種量轉接入25 mL的8種不同碳源發酵培養基(質量分數為1%木糖醇、1%山梨糖醇、1%甘油、1%赤蘚糖醇、1%D-木糖、1%核糖、1%D-阿拉伯糖、1%甘露糖醇，發酵培養基其他成分相同)，28 ℃，280 r/min 搖瓶培養72 h，獲得發酵液。

1.4.4.2 分析方法

發酵液經稀釋過濾，以高效液相色譜法檢測糖和糖醇含量。HPLC色譜條件，色譜儀：安捷倫Agilent 1260；檢測器：RID-G1362A示差檢測器；色譜柱：Carbomix Ca-Np；檢測池溫度：室溫；分離柱溫：80 ℃；流動相：超純水；流速：0.7 mL/min；進樣器：G1329A/B自動進樣器；進樣體積：10 μL(根據發酵液稀釋倍數)。觀察重組工程菌株生長特征，用高效液相色譜法對發酵代謝底物、產物進行檢測分析。

1.4.5 解脂亞羅酵母重組菌株對赤蘚糖醇母液的利用和轉化實驗

將未改造的宿主菌株和已驗證的重組菌株甘油管菌液分別劃線與YPD和YNB固體培養基，28 ℃倒置培養。用接種環挑取單菌落分別接種到2.5 mL發酵種子液培養基，28 ℃，220 r/min搖床培養24 h，隨后將種子液以10%的接種量轉接入赤蘚糖醇母液發酵培養基，28 ℃，280 r/min 搖瓶培養72 h，獲得發酵液，適當稀釋過濾后，以高效液相色譜法檢測代謝物中糖和糖醇的含量。

2 結果與分析

2.1 源基因的分析

在對希臘接合酵母全基因組的分析中獲得了一段長度為1 680 bp的新功能基因序列，命名為spx，通過對核酸保守區域比對和結構域的預測(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)，此序列中至少包含2個功能域：糖結合功能域和ATP結合功能域，可能與戊糖或己糖激酶基因家族有關，在基因中該序列無內含子，其5′-端的序列為ATGTCAGATTCAAACGGCCCTCTTTATC-，3′-端的序列為-TTTGAGCAGATGGAGTC-TCGGCTTGTATAA。圖2是spx與真核生物木酮糖激酶cd07776的前165個氨基酸序列的對比結果，該基因屬于FGGY糖激酶家族，可催化ATP對木酮糖的磷酸化反應，因此推定新基因也為具有糖磷酸化功能的基因。

圖2 spx和cd07776氨基酸序列的比對Fig.2 Alignment of spx and cd07776 amino acid sequence注：紅色代表相同的氨基酸殘基

2.2 表達載體的構建與解脂亞羅酵母重組菌株的鑒定

2.2.1 克隆載體與表達載體的構建與鑒定

按照1.4.1中所述方法進行PCR擴增目的基因，瓊脂糖凝膠電泳，結果表明PCR擴增獲得的目的片段大小為1 680 bp，與預期片段大小相符(圖3)。按照1.4.2的實驗方法，將目的基因片段進行TA克隆(original TA cloning)，提取重組克隆T載經酶切驗證并測序獲得正確的目的序列(圖4)。TA克隆連接效率高，易于操作，因PCR為體外擴增堿基突變幾率大，而單克隆菌體自身的修復機制可以保證序列的準確性，測序正確的克隆子在宿主中擴增有利于目的片段的富集，且便于目的片段的長期保存[23]。將含有目的基因的重組克隆T載與表達載體pINA1269分別進行雙酶切，在T4 DNA連接酶作用下構建含目的片段的重組表達載體，并通過PCR驗證和雙酶切驗證(圖5、圖6)，測序后得構建成功的解脂亞羅酵母表達載體。

M-DL 2000 DNA Maker;1、2、3-目的基因PCR產物圖3 目的基因PCR擴增Fig.3 PCR amplification of target gene

M-DL 5000 DNA Maker;1-重組克隆載體質粒;2、3-重組克隆T載雙酶切圖4 重組克隆T載體的雙酶切驗證Fig.4 Enzyme digestion of recombinant cloned T vector

M-DL 2000 DNA Maker;1、2-以重組表達載體為模板的PCR產物圖5 重組表達載體的PCR驗證Fig.5 The verification of recombinant expression vector by PCR

M-DL 15000 DNA Maker;1、2-重組表達載體雙酶切圖6 重組表達載體的雙酶切驗證Fig.6 Enzyme digestion of recombinant expression vector

2.2.2 解脂亞羅酵母重組菌株的鑒定

所用的pINA1269為整合質粒，是攜帶有pBR322同源序列的單拷貝質粒，通過同源交換的方式實現整合。在酵母表達系統啟動子hp4d和終止子XPR2的控制下，目的基因片段在解脂亞羅酵母中實現異源表達[24]。本身宿主菌是Leu-營養缺陷型，在葡萄糖培養基上生長受到抑制，構建的pINA1269-spx重組表達載體帶有Leu基因，因此重組載體成功轉化解脂亞羅酵母Po1g后獲得的酵母轉化子可以在YNB篩選培養基上生長(圖7)。提取陽性轉化子的基因組，用spx-F和spx-R為引物進行PCR擴增驗證，陽性酵母轉化子可以擴增出一條1 680 bp大小的片段,與目的功能基因的大小相符(圖8)，回收純化后測序驗證序列同源性，表明重組載體成功整合到宿主解脂亞羅酵母菌的基因組，獲得解脂亞羅酵母重組菌株。

圖7 解脂亞羅酵母重組菌株在YNB篩選平板上的生長Fig.7 Growth of the recombinant Yarrowia lipolytica strains on YNB selective medium

M-DL 5000 DNA Maker;1-以重組載體為模板的PCR產物;2、3、4、5-以解脂亞羅酵母重組菌基因組為模板的PCR產物圖8 解脂亞羅酵母菌轉化子的PCR鑒定Fig.8 Screening of Yarrowia lipolytica transformants by PCR

2.3 重組菌株對碳源的利用與轉化

碳源是發酵培養基的主要組成成分，能為細胞生長代謝提供能量，為菌株合成次生代謝產物提供不同碳架。表2為供試的木糖醇、甘油、山梨糖醇、赤蘚糖醇、D-木糖、核糖、D-阿拉伯糖和甘露糖醇標樣在Sepax Carbomix Ca-Np色譜柱上的保留時間，證明在該色譜條件下可有效實現對樣品的分離和定量。

表2 HPLC不同碳源單標保留時間表Table 2 Single standard retention schedule for different carbon sources by HPLC

解脂亞羅酵母重組菌株在搖瓶發酵實驗中表現出與親本不同的碳源同化能力(表3)。試驗表明對解脂亞羅酵母，除了不能同化的品種，無論是重組菌株還是親本菌株在對不同碳源的同化方式方面，葡萄糖與其他碳源之間的異步利用現象并不明顯，而以甘油的利用效率最高。對于重組菌株，與親本在同化能力上的最大差異表現在對赤蘚糖醇的利用上，重組菌株在基質中同時存在葡萄糖和赤蘚糖醇的情況下同化能力至少為親本菌株的2倍，同樣的情況也發生在核糖上，初步表明該基因與磷酸戊糖途徑合成赤蘚糖醇的代謝通路有關。

表3 重組菌株的混合糖同化特性 單位：g/100mL

圖9是目前已經確定的酵母赤蘚糖醇關鍵合成路線，其中的主要關鍵酶都已獲得確認，只有催化4-磷酸赤蘚糖去磷酸生成赤蘚糖的4-磷酸赤蘚糖激酶(erythritose 4-phosphate kinase，EP)沒有查明，本研究所克隆的spx基因是否就是該基因有待在后續的研究中加以確認。

圖9 酵母菌赤蘚糖醇的合成路線Fig.9 Synthetic route of yeast erythritol

2.4 重組菌株對含有混合多元醇的赤蘚糖醇結晶母液的轉化

在工業生產赤蘚糖醇過程中，酵母菌種在將底物轉化為赤蘚糖醇的同時還產生多種混合糖醇，經菌體分離、脫色、凈化除雜、濃縮結晶、重結晶分離赤蘚糖醇后得到的母液成分復雜，且黏度很高，其中的有用成分進一步分離和利用都很困難[25]。通過HPLC分析，赤蘚糖醇結晶母液中主要含有未發酵利用的葡萄糖、未結晶分離的赤蘚糖醇和殘留在母液中的甘露糖醇、核糖醇、甘油等成分(圖10)。經過重組菌株的發酵，結晶母液中的組分比例發生顯著變化(表4)，處理后的母液黏度也明顯降低，其原因可能是母液中有原發酵菌種不能利用的雙糖——麥芽糖的殘留被充分同化而且濃度降低了。經過處理，母液中的殘留赤蘚糖醇可以進行再次濃縮后結晶分離出來，而且由于解脂亞羅酵母為一種富含油脂的酵母，利用母液培養增殖的酵母生物質也可能獲得綜合利用。

a-母液空白培養基；b-親本菌株；c-重組菌株圖10 赤蘚糖醇母液HPLC色譜圖Fig.10 HPLC chromatogram of erythritol mother liquor

表4 重組菌株對赤蘚糖醇結晶母液的轉化單位：g/100mLTable 4 Transformation of erythritol crystallization waste liquor by recombinant strain

3 結論與展望

赤蘚糖醇是一種重要的低熱量甜味劑，由于其超過90%的理論轉化率使得對其合成途徑的深度改造獲得很大的關注[26]。本研究構建了攜帶新目的基因的解脂亞羅酵母表達載體pINA1269-spx，并通過同源交換的方式整合到解脂亞羅酵母基因組進行表達。結果表明，表達此基因的解脂亞羅酵母重組菌株與未經改造的親本菌株相比對赤蘚糖醇和核糖的同化能力出現差異，說明該基因具有調控赤蘚糖醇合成及戊糖代謝功能。未來可通過改造和調控赤蘚糖醇發酵菌種的相關同工酶來進一步提高赤蘚糖醇的產率，拓展赤蘚糖醇發酵的碳源利用譜。本研究在赤蘚糖醇結晶母液處理方面提供了一個新的解決方案，為資源節約、減輕環境負荷，促進產業的綠色發展創造了新的可能。