南極磷蝦油對衰老模型小鼠抗氧化作用的研究

李輝，王廉馨，韓昀穌，林丹妮，曲麗娜

1(遼寧大學 生命科學院，遼寧 沈陽，110036)2(大連醫科大學附屬大連市中心醫院，遼寧 大連，116033)

研究表明，人體中95%的自由基是氧自由基，其來源主要分為輻射、藥物、酒精等外源性自由基和機體自身代謝產生的內源性自由基兩方面，如自由基產生過多而不能及時清除，會通過氧化作用攻擊機體內的核酸、蛋白質、糖類及脂肪等大分子物質，破壞細胞結構和功能，導致機體的組織損傷和退行性變化[1]。因此，防止自由基引起的氧化損傷，有效抑制過氧化的發生，一直是研究的熱點問題。

南極磷蝦分布在環南極海域，蘊藏量巨大，據統計，其生物量約為6.5～10億t[2-3]，并具有極高的營養價值。其中，以南極磷蝦為原料提取的南極磷蝦油(antarctic krill oil,AKO)，含有豐富的磷脂、蝦青素、二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)、二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)、類黃酮、維生素A、維生素E等營養物質，其磷脂含量高達40%，蝦青素含量在40～100 mg/kg[4-5]，其ω-3脂肪酸與磷脂結合，生物利用率較高[6-7]。研究表明，南極磷蝦油具有促進大腦神經發育、提高記憶力、降低血糖和血脂、改善心血管疾病和防止動脈粥樣硬化、保護骨骼關節等保健功效[5,8-10],然而對南極磷蝦油的抗氧化作用鮮有報道。本實驗通過構建小鼠衰老模型，考察南極磷蝦油對小鼠的抗氧化作用的影響，為開發南極磷蝦油類保健食品提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗樣品

南極磷蝦油由遼漁南極磷蝦科技發展有限公司提供。

1.2 實驗動物

無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級癌癥研究學會(institute of cancer research，ICR)雄性小鼠，購于遼寧長生生物技術股份有限公司。衰老模型小鼠：SPF級ICR雄性8～10月齡小鼠；動物飼養條件：屏障環境，實驗溫度20～24 ℃，相對濕度50%～60%。

1.3 實驗動物處理

受試小鼠在清潔級動物飼養室內適應性喂養觀察7 d，未見異常后眼內眥取血測定血清丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量。根據MDA含量將小鼠分層隨機分成4個組，每組10只，并適當調整，使各組的平均體重接近均衡。根據樣品的人體推薦量5、10、30倍分別設置0.075 g/kg·BW低劑量實驗組(L-AKO)、0.150 g/kg·BW中劑量實驗組(M-AKO)和0.450 g/kg·BW高劑量實驗組(H-AKO)，同時設置1個陰性對照組，每組10只小鼠。

1.4 試劑與儀器

MDA、還原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、蛋白質羰基(protein carbonyl，PCO)試劑盒，南京建成生物工程研究所；BSA124S-CW型賽多利斯精密天平，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；UV-2700型島津紫外分光光度計，島津企業管理(中國)有限公司；JW-3021HR型安徽嘉文高速冷凍離心機，安徽嘉文儀器裝備有限公司；HH-4型常州萬豐恒溫水浴鍋，常州市萬豐儀器制造有限公司。

1.5 實驗方法

根據“國食藥監?；痆2012]107號”文中頒布的《抗氧化評價方法》的要求，以MDA、GSH、SOD和PCO為考察指標。

分別取南極磷蝦油1.50、3.00、9.00 g，用玉米胚芽油定容至200 mL，對照組給予等體積玉米胚芽油，分別給予受試動物灌胃，灌胃體積為0.1 mL/10 g·BW，每天灌胃1次，連續灌胃30 d。

30 d后，將老齡小鼠稱重，采尾尖血20 μL加入0.48 mL 蒸餾水制成體積分數為4%的溶血液，按試劑盒說明書測定過氧化脂質(lipid peroxide，LPO)降解產物MDA含量、全血抗氧化物質GSH含量；摘眼球采血離心，取血清按試劑盒說明書測定SOD活力、PCO含量。

1.6 實驗數據統計

實驗數據用SPSS 22.0和Microsoft Excel統計軟件進行分析統計處理。

2 結果與分析

2.1 南極磷蝦油對實驗前后小鼠體重的影響

實驗前，各組小鼠體重無明顯區別，實驗中期和實驗末期各劑量實驗組小鼠的體重和增重，與陰性對照組相比，差別均無統計學意義(P>0.05)(圖1、圖2)，且在實驗期間，各組小鼠生活飲食等未有異常表現，表明南極磷蝦油對衰老模型小鼠體重無明顯影響(表1)。

a-0 d；b-15 d；c-30 d圖1 不同時間小鼠體重情況Fig.1 Body weight of mice at different times注：NS表示無顯著相互差異(P>0.05)(下同)

a-體重增長量；b-體重圖2 小鼠體重增加情況Fig.2 Body weight gain of mice

表1 南極磷蝦油對各組老齡小鼠的體重影響Table 1 The effect on the weight of aged mice in each group

2.2 南極磷蝦油對老齡小鼠血清中LPO的影響

實驗前各組小鼠血清中LPO含量均衡，各組之間差別無統計學意義(P>0.05)。實驗末期結果表明各劑量實驗組小鼠血清的LPO含量均低于陰性對照組，其中，中、高劑量組與陰性對照組比較，均有顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.05)(圖3)。結果表明受試物具有降低衰老模型小鼠的血清中LPO含量的作用(表2)。

a-0 d;b-30 d圖3 血清LPO含量測定Fig.3 Determination of serum LPO content注：*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異顯著(P<0.01)(下同)

表2 南極磷蝦油對各組老齡小鼠血清中LPO(以MDA計)含量的影響Table 2 The content of LPO (calculated by MDA) in serum of aged mice in each group

2.3 南極磷蝦油對老齡小鼠血清中SOD活力和GSH含量的影響

2.3.1 南極磷蝦油對小鼠血清中SOD活力的影響

SOD活力測定表明，30 d喂養后各劑量實驗組小鼠血清中SOD活力與陰性對照組相比均有提高，其中，中劑量組較陰性對照組SOD活力顯著增高(P<0.05)，高劑量組較陰性對照組SOD活力有極顯著增高(P<0.01)，差異均有統計學意義(圖4)。結果表明受試物具有提高衰老模型小鼠的血清中SOD活力的作用(表3)。

表3 南極磷蝦油對各組老齡小鼠血清中SOD含量的影響Table 3 The content of SOD in serum of aged mice in each group

2.3.2 南極磷蝦油對小鼠血清中GSH含量的影響

GSH測定表明，各劑量實驗組小鼠血清中GSH含量與陰性對照組相比均有提高，其中，中劑量組較陰性對照組GSH含量顯著提高(P<0.05)，高劑量組較陰性對照組GSH含量有極顯著提高(P<0.01)，差異均有統計學意義(圖4)。結果表明受試物具有提高衰老模型小鼠的血清中GSH含量的作用(表4)。

表4 南極磷蝦油對各組老齡小鼠血清中GSH含量的影響Table 4 The content of GSH in serum of aged mice in each group

2.4 南極磷蝦油對衰老模型小鼠血清中PCO含量的影響

PCO含量測定表明，各劑量實驗組小鼠血清中PCO含量與陰性對照組相比雖有所降低，但差別較小，無統計學意義(P>0.05)(圖5)，表明受試物對老齡小鼠血清中PCO含量無明顯影響(表5)。

表5 南極磷蝦油對各組老齡小鼠血清中PCO含量Table 5 The content of PCO in serum of aged mice in each group

圖5 PCO含量測定Fig.5 PCO content determination

3 討論

自由基對脂類、蛋白質和DNA的損傷，是導致組織或細胞損傷等病理狀況的直接原因。在生物體內，通過酶系統與非酶系統產生氧自由基，能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發脂質過氧化作用，生成LPO，其氧化終產物為MDA，會引起蛋白質、核酸等大分子的交聯聚合，從而影響線粒體呼吸鏈復合物及線粒體內關鍵酶活性，加劇膜的損傷，產生細胞毒性，進而導致機體損傷，人體衰老，因此MDA含量可以反映機體脂質過氧化速率和強度，也能間接反映組織過氧化損傷程度，是反映機體抗氧化潛在能力的重要參數[11]。

a-SOD含量;b-GSH含量圖4 SOD活力測定與GSH含量測定Fig.4 SOD activity determination and GSH content determination

SOD和GSH是人體自身代謝過程中生成的抗氧化劑，SOD能專一地清除體內有害的自由基，以解除由自由基氧化體內的某些組分而造成的機體損害；GSH是一種非酶性抗氧化劑，對生物體氧化還原系統和巰基酶有活化作用，通過其巰基氧化-還原態的轉換，作為可逆的供氫體，主要在細胞內的水相提供抗氧化保護，復活被活性氧損傷的巰基酶，保護細胞膜中含巰基的蛋白質和含巰基酶不被破壞，同時還可對抗自由基對重要臟器的損害。在成長期，這些抗氧化物質在體內合成旺盛，GSH和SOD等抗氧化劑含量很高，能抑制氧自由基產生，平衡人體的代謝，預防各種慢性病，而隨著細胞老化影響，其含量會大幅降低，進而導致器官功能衰退[12-14]。因此，SOD和GSH指標是反映人體抗氧化功能的重要指標。

蛋白質羰基化是蛋白質氨基酸側鏈中的自由氨基和亞氨基受到氧自由基攻擊生成NH3和相應羰基衍生物的過程，PCO的產生是蛋白質分子被自由基氧化修飾的一個重要標記，通常在人體各類細胞中氧化的蛋白質數量隨年齡呈指數上升[15]。因此PCO含量可作為反映機體蛋白質氧化損傷的重要依據。

以自然資源篩選出抗氧化作用的天然成分作為抗氧物的補充是解決抗氧化問題的有效途徑之一。南極磷蝦油是從南極磷蝦中提取的脂質組分，是由磷脂、EPA、DHA、蝦青素、膽堿等成分組成的混合物。蝦青素具有不飽和酮基和羥基的共軛雙鍵鏈分子結構，能提供吸引自由基的未配對電子，從而清除自由基，抑制脂質過氧化和增加抗氧化酶活性等[16-17]；磷脂可不同程度地提高肝臟、骨骼肌抗氧化酶的活性，對自由基的清除有促進作用，磷脂酰膽堿可在機體內維持SOD活性，保護脂類等分子免受氧自由基的損害[18-20]。

在本研究中，適量南極磷蝦油能顯著提高衰老模型小鼠血清SOD活力和GSH含量，顯著降低血液中LPO含量，但對PCO含量影響小。表明富含蝦青素和磷脂等大量生物活性物質的南極磷蝦油具有明確的抗氧化的作用，這也為南極磷蝦及其深加工產品的應用提供了基礎數據。南極磷蝦油抗氧化的作用機理機制還有待于深入研究。