腈水解酶重組菌的培養工藝及磁性固定化研究

商玉婷，龔勁松，王順治，陸震鳴，李恒，史勁松，許正宏*

1(江南大學 生物工程學院，糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫，214122)2(江南大學 藥學院，糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

煙酸又稱維生素B3，在生物體的生命活動中起著重要作用。煙酸具有抗氧化活性，可以保護蛋白質免受UV-C輻射的損害[1]。食用含有煙酸的飲食可以降低牛、火雞或豬等的脂肪含量，從而改善肉質[2]。此外，煙酸還可以作為原料來合成新的化學中間體，例如煙酰胺、6-羥基煙酸[3]等。

利用腈水解酶催化3-氰基吡啶制得煙酸具有產物純度高、反應時間短、操作過程簡單的優點。據報道，產腈水解酶的杜鵑紅球菌tg1-A6在55 ℃下能將130 mmol/L 3-氰基吡啶完全轉化為煙酸，煙酸的最高質量濃度可達165.2 g/L[4]。FAN等[5]構建了1株產重組腈水解酶的大腸桿菌，基因來源為RalstoniaeutrophaH16，該酶可以在20.8 h水解1 050 mmol/L 3-氰基吡啶，積累生產煙酸129.2 g/L。

通過罐上發酵培養可以提高細胞在培養基中的密度，從而提高產物的濃度和比細胞生產率[6]。相比常規細胞培養方法，罐上發酵技術能夠提高生產率、減少培養量和設備投資，并增強下游加工能力[7]。通過控制營養物的補料分批培養是實現高細胞密度發酵的最常用方法之一，其包括簡單間接反饋方法，例如恒pH培養策略、DO-stat策略、指數進料，或者根據葡萄糖需求量反饋補料等方法[8-9]。顧炳琛等[10]在腈水解酶產生菌的發酵中采用pH調節策略，最終腈水解酶的最高活性可達到583.3 U/mL。

磁性固定化是通過使用磁性納米材料對酶、抗體或細胞等進行結合，從而實現通過磁場進行產物或細胞分離的一種固定化方法。磁性納米顆粒比表面積高且在外部磁場下易于分離[11]。與游離酶相比，固定在磁性納米顆粒上的酶對有機溶劑介導的變性具有更高的抵抗力[12]。而復合型磁性納米材料則是磁性納米粒子與特定的載體材料結合而設計的新型材料[13]。陽離子聚合物是復合磁性納米粒子常使用的材料，可以通過提供靜電力的表面修飾提高固定化效率[14]。

在前期工作中，本實驗室已成功構建1株產重組腈水解酶的BacillussubtilispMA5-NITR，其最高酶活力為38.03 U/mL，可以催化3-氰基吡啶累積生產煙酸，質量濃度達到295.46 g/L[15]。為了進一步提高B.subtilis來源的腈水解酶的產酶潛力和累積生產煙酸的能力，本文采用分批培養、恒速補料培養和恒pH培養等策略對重組菌進行發酵培養，提高酶活力及生物量、降低生產成本，進一步運用氨基化核殼結構磁性Fe3O4納米粒子對重組菌進行細胞固定化，以提高酶穩定性，提升其轉化應用潛力。目前的研究可以為未來腈水解酶產生菌的發酵工藝及大規模生物轉化合成煙酸奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種

重組腈水解酶B.subtilispMA5-NITR(以下簡稱重組腈水解酶)為實驗室保藏，基因是惡臭假單胞菌來源的腈水解酶基因[15]。

1.1.2 試劑

酵母粉、胰蛋白胨、瓊脂，OXOID/REMEL(英國)；氯化鈉、葡萄糖、KH2PO4、K2HPO4·3H2O，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 培養基

LB培養基(g/L)：氯化鈉10，胰蛋白胨10，酵母粉5；

TBG培養基(g/L)：胰蛋白胨12，KH2PO42.3，K2HPO4·3H2O 16.4，酵母粉24，葡萄糖10，甘油5；

補料培養基(g/L)：葡萄糖800；

固體LB培養基(g/L)：氯化鈉10，胰蛋白胨10，酵母粉5，瓊脂20；

LB、固體LB培養基于121 ℃滅菌20 min；TBG培養基、補料培養基于115 ℃滅菌20 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 分析方法

1.2.1.1 酶活力檢測方法

酶活力定義：在標準條件下即30 ℃的反應溫度下，1 min生成1 μmol煙酸或氨所需酶量為1 U。

取200 μL菌液在12 000 r/min下離心2 min，并用PBS緩沖液(100 mmol/L，pH 7.2)洗滌2次后收集靜息細胞，加入800 μL PBS緩沖液進行重懸并于30 ℃金屬浴反應5 min。添加200 μL 3-氰基吡啶(500 mmol/L)后繼續反應10 min。反應結束后12 000 r/min下離心2 min。取10 μL反應上清液如上述操作進行顯色反應，測定酶活力。

1.2.1.2 HPLC分析

本研究中3-氰基吡啶和煙酸均使用HPLC(Dionex Ultimate 3000)進行分析。分析柱使用X-Bridge C18柱(5.0 μm，4.6 mm×250 mm；Waters)，0.02%流動相為60%的乙腈和40%的三氟乙酸(均為體積分數)。液相分析的流速、柱溫和檢測波長分別設置為0.5 mL/min、30 ℃和268 nm。

1.2.2 罐上發酵

1.2.2.1 種子制備

將-80 ℃凍存的B.subtilispMA5-NITR于LB平板進行劃線，37 ℃培養12 h后挑取單菌落接種于10 mL LB培養基中，37 ℃、220 r/min培養12 h。然后按接種量2%轉接至100 mL新鮮LB培養基，于37 ℃、220 r/min培養8 h后作為種子液待用。

1.2.2.2 分批培養

發酵罐大小為7.5 L，裝有4 L無菌TBG培養基。將種子液按照10%的接種量接種至發酵罐中并添加卡那霉素(Kanamycin)(終質量濃度50 μg/mL)。控制發酵反應溫度為30 ℃、攪拌轉速為500 r/min，溶氧不低于30%(體積分數)，并流加消泡劑。定時取樣檢測發酵液的菌液濃度、酶活力、pH、殘余葡萄糖濃度。

1.2.2.3 恒速補料培養

首先按照1.2.2.2進行分批培養，在發酵過程中流加25%(體積分數)氨水，控制pH不低于7.0。當檢測到殘余葡萄糖基本消耗完時進行補料，補料速率為3.6 mL/h。

1.2.2.4 恒pH培養

采用恒pH培養法進行補料，在發酵前期進行分批培養，當發酵罐內葡萄糖基本消耗完后根據pH變化進行反饋補料。發酵前期，葡萄糖流加速率為20%，同時流加25%氨水使pH維持在7.0左右；發酵中期，葡萄糖流加速率為15%，同時流加氨水使pH維持在7.0左右；發酵后期，葡萄糖流加速率為5%，同時流加氨水使pH維持在7.0左右。此外，補料全程維持葡萄糖質量濃度在1～5 g/L，發酵中后期通過增加通氣量和提高攪拌轉速來保證溶氧供給。

1.2.3 制備Fe3O4磁性納米粒子

1.2.3.1 制備Fe3O4納米粒子

采用化學共沉淀方法[16]，進行Fe3O4磁性納米粒子制備。具體步驟如下：FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O，按照1∶8的摩爾比溶解于100 mL的超純水中，并在N2下攪拌混勻。然后滴加氨水到混合溶液中，至pH為11。在70 ℃下反應1 h后，置于室溫下冷卻。通過外加磁場將產物從溶液中分離，并用蒸餾水反復洗滌至pH變為中性。最后于室溫下真空干燥，獲得Fe3O4納米粒子。其主要反應過程為[17]：

Fe2++Fe3++OH-→Fe(OH)2/Fe(OH)3(形成共沉淀);

Fe(OH)2+Fe(OH)3→FeOOH+Fe3O4(pH≤7.5);

FeOOH+Fe2+→Fe3O4+H+(pH≥9.2)。

1.2.3.2 制備Fe3O4@SiO2納米粒子。

取4 g制備好的Fe3O4納米粒子，加入160 mL乙醇，40 mL水和5 mL氨水，超聲分散1 h后在室溫下進行機械攪拌，同時緩慢滴加1 mg/L正硅酸乙酯(tetraethoxysilane，TEOS)至混合溶液中。反應12 h后，通過外加磁場將產物從溶液中分離，蒸餾水反復洗滌至pH變為中性。然后加入50 mL 1 mol/L的HCl，過夜浸泡，外加磁場進行分離，并用蒸餾水洗滌至中性，最后于室溫下真空干燥，獲得Fe3O4@SiO2的納米粒子。

1.2.3.3 制備Fe3O4@SiO2@PEI納米粒子

取1 g Fe3O4@SiO2加入到含有100 mL超純水的錐形瓶中，超聲分散1 h后加入20 mg/mL的聚乙烯亞胺(polyethylenimine，PEI，分子量10 000)，N2保護下持續攪拌，反應8 h后，利用外加磁場分離，除去多余未反應的PEI，再超聲分散于超純水中，最后室溫下真空干燥，即可得到經PEI修飾的氨基化核殼結構的Fe3O4納米粒子，即為Fe3O4@SiO2@PEI，保存備用。

1.2.4 制備磁性固定化細胞

1.2.4.1 制備方法

重組腈水解酶10 000 r/min離心5 min后去上清液，使用PBS緩沖液(100 mmol/L，pH 7.2)洗滌3次后重懸制備成靜息細胞懸液，使用分光光度計測定菌液濃度后放于4 ℃備用。

將制備的Fe3O4@SiO2@PEI按照一定比例加入到重組腈水解酶靜息細胞懸液中，30 ℃、120 r/min培養20 min后利用外加磁場除去未吸附上磁性納米粒子的菌體。充分洗滌后測定菌液濃度，置于4 ℃備用。

吸附效率計算如公式(1)所示：

吸附效率/%

(1)

1.2.4.2 制備條件對固定化細胞的影響

(1)靜息細胞濃度：將制備好的Fe3O4@SiO2@PEI磁性納米粒子按照1 g/L進行分裝，并添加PBS進行重懸，然后超聲分散1 h。并將靜息細胞按照比例添加至磁性固定化細胞中，分別稀釋到1～11 g/L。

(2)溫度：分別在20～60 ℃下，將適量的Fe3O4@SiO2@PEI磁性納米粒子加入到靜息細胞懸液中制備磁性固定化細胞。

(3)pH：分別在pH 4.0～9.0環境下，將適量的Fe3O4@SiO2@PEI磁性納米粒子加入到靜息細胞懸液中制備磁性固定化細胞。

測定不同靜息細胞濃度、溫度及pH下固定化細胞的吸附效率和酶活力，研究不同制備條件對磁性固定化細胞的影響。

1.2.4.3 磁性固定化細胞的性能評價

(1)細胞溫度穩定性：將磁性固定化細胞分別置于4、30、40、50 ℃條件下進行孵育，定時取樣測定酶活力直至酶活力降低至初始水平的一半。以初始固定化細胞酶活力作為對照，以殘余酶活力的自然對數對時間進行作圖并計算固定化腈水解酶在不同溫度下的半衰期。

(2)底物耐受性：將50～400 mmol/L的3-氰基吡啶分別加入到固定化細胞和游離細胞體系中進行酶催化反應。通過不同3-氰基吡啶濃度下磁性固定化細胞和游離細胞酶活力的變化來評價底物耐受性。

(3)初始底物濃度影響：在相同體積的體系中，分別添加50～400 mmol/L的3-氰基吡啶進行轉化反應。每5 min取樣，檢測磁性固定化細胞對不同濃度底物的轉化效率。

1.2.5 磁性固定化細胞批次轉化生產煙酸

使用制備好的磁性固定化細胞進行對3-氰基吡啶的轉化實驗。每批次添加200 mmol/L終濃度的底物3-氰基吡啶，每轉化10批次，通過磁場分離磁性固定化細胞和產物，并將磁性固定化細胞轉入新的體系進行下一輪批次轉化。

2 結果與分析

2.1 重組菌的罐上發酵

2.1.1 分批培養

通過分批培養策略研究重組菌的pH變化、酶活力、葡萄糖濃度和菌液濃度變化情況，分析影響重組菌發酵產酶的因素，為后續發酵優化提供參考依據。由圖1可知，在發酵初始階段，生物量較低，重組菌處于遲緩期，發酵罐內pH基本維持恒定；發酵中期，重組菌達到對數期，菌體開始快速生長，此時酶活力也隨著重組菌生物量的提高而快速升高，在36 h時菌液濃度達到最高，OD600為19.27，同時酶活力也達到最大值為63.41 U/mL；隨后重組菌進入穩定期中后期，此時發酵罐內葡萄糖基本消耗完畢，發酵pH持續增加；在發酵末期，pH進一步升高，達到8.0以上，重組腈水解酶的酶活力開始出現明顯降低。

圖1 重組B.subtilis pMA5-NITR分批培養Fig.1 Batch mode of fermentation of the recombinant B.subtilis pMA5-NITR

2.1.2 恒速補料培養

在發酵過程中進行補料流加，可以有效補充細菌生長所必需的營養物質。由于葡萄糖廉價易得，并且能夠被微生物快速利用，因此被廣泛用作重組菌罐上發酵的限制性基質為微生物生長提供能源[18]。黃燕等[19]通過恒速補料培養的方法提升了角質酶的表達水平，在OD600為75時，進行恒速流加0.8 g/(L·h)的乳糖溶液，重組菌在24 h達到最高(OD600為90)，酶活力在26 h達到最大為4 788 U/mL，是搖瓶發酵酶活力的28倍。

因此，待初始葡萄糖基本消耗完畢后對重組菌進行補料，葡萄糖流加速率為3.6 mL/h。由圖2可知，開始補糖后重組腈水解酶的對數生長期顯著延長。在63 h前，重組菌的酶活力和菌液濃度隨著時間的增加而升高，酶活力在66 h達到最大值，為125.62 U/mL，是分批培養的1.98倍。菌液濃度在75 h達到最大值，OD600為55.80，是分批培養的2.9倍。

圖2 重組B.subtilis pMA5-NITR恒速補料培養Fig.2 Constant-speed feed fermentation of the recombinant B.subtilis pMA5-NITR

2.1.3 恒pH培養

由恒速補料培養可知，發酵中后期由于葡萄糖流加速率有限，無法及時滿足重組菌生長繁殖所需，使菌體生長減慢，產酶受到限制。采取調控更加精細的恒pH培養策略，對重組腈水解酶進行發酵，有望進一步提升菌體的產酶潛力。

如圖3所示，發酵罐內葡萄糖在24 h時基本消耗完畢，此時開始補加葡萄糖。在進行補料之后葡萄糖濃度相對較為穩定，60 h后葡萄糖質量濃度基本穩定在1.2 g/L。重組菌菌液濃度隨著時間延長而穩步上升，并在84 h時達到最高(OD600為58.85)，是分批培養的3.05倍，隨后開始緩慢下降。重組B.subtilis在發酵51 h時有最高酶活力，為167.32 U/mL，是分批培養的2.64倍，隨后酶活力開始下降。90 h后酶活力快速降低，96 h時酶活力約為80 U/mL，在108 h時終止發酵。

圖3 重組B.subtilis pMA5-NITR恒pH培養策略Fig.3 Feeding fermentation in pH-stat strategy of the recombinant B.subtilis pMA5-NITR

2.2 重組腈水解酶的磁性固定化

2.2.1 靜息細胞濃度對磁性固定化細胞的制備及酶活力的影響

將1 g/L的Fe3O4@SiO2@PEI磁性納米粒子分別添加到1～11 g/L的靜息細胞中進行混合，并按照1.2.4制成磁性固定化細胞。結果如圖4-a所示，在靜息細胞質量濃度為3 g/L時，吸附效率最高，可達到69%，隨著靜息細胞濃度的升高，吸附效率逐漸降低。固定化細胞酶活力隨靜息細胞濃度的增加而升高，在5 g/L時達到最高酶活力，之后隨著靜息細胞濃度的升高，吸附效率開始下降，而酶活力也隨之降低。因此，5 g/L為最佳靜息細胞吸附濃度。

2.2.2 溫度對磁性固定化細胞的制備及酶活力的影響

為了評估溫度對磁性固定化細胞的制備和酶活力的影響，在20～60 ℃下制備磁性固定化細胞。結果如圖4-b所示，在55 ℃之前，磁性納米粒子對細胞的吸附效率隨著溫度的升高而提高，在55 ℃時達到最大吸附效率為76%，而當溫度超過55 ℃，吸附效率開始下降。酶活力在50 ℃之前隨著溫度的升高而增加，并在50 ℃達到最大，然后隨著溫度的升高而降低。考慮到腈水解酶的穩定性，選擇相對較高的30 ℃作為后續研究溫度。

2.2.3 pH對磁性固定化細胞的制備及酶活力的影響

不同pH條件會影響到磁性納米粒子和菌體表面的帶電情況，并影響到兩者之間的吸附效率。將靜息細胞和磁性納米粒子在不同pH的緩沖液下進行復合，如圖4-c所示，當pH較低時，磁性固定化細胞的吸附效率較低，且隨著pH的升高而增大。當pH在7.2時有最高吸附效率為67.33%，然后隨著pH的升高而逐漸下降。酶活力受pH的影響較大，在pH 4.0～4.6基本完全喪失酶活力，然后隨著pH的上升而升高，并在pH 7.2時有最高酶活力。之后酶活力隨著pH的升高而下降，并在pH為8.9時基本完全喪失。同時磁性固定化細胞的酶活力受緩沖液的影響較明顯，在PBS緩沖液中酶活力最高。

a-不同靜息細胞質量濃度；b-不同反應溫度；c-不同反應pH圖4 不同制備條件對磁性固定化細胞及酶活力的影響Fig.4 Effect of different preparation conditions on the magnetically immobilized cells and enzyme activity

2.2.4 磁性固定化細胞的溫度穩定性

設置不同的溫度孵育磁性固定化細胞，以殘留酶活力(residual enzyme activity,RA)的自然對數ln(RA)對時間進行作圖。初始固定化細胞酶活力設定為相對活性的100%。由圖5-a可知，固定化細胞在4 ℃下最為穩定，其半衰期(t1/2)達到140 h。在30 ℃下相對較穩定，半衰期(t1/2)為15 h。在40、50 ℃ 下保存6 h后，酶活力僅有初始酶活力的29%和5%。和游離細胞相比，磁性固定化細胞在4 ℃下的半衰期提高了2.33倍。

2.2.5 磁性固定化細胞的底物耐受性

底物耐受性是反映酶催化能力的重要指標，良好的底物耐受性可以使酶催化承受更高的底物濃度，提高酶的催化效率和重復使用能力。據報道，產腈水解酶的固定化重組大腸桿菌可以將1 mol/L 3-氰基吡啶完全催化為煙酸，其底物耐受性和穩定性得到顯著提升[20]。

在相同反應體系中，分別在磁性固定化細胞和游離細胞反應液中添加50～400 mmol/L終濃度的底物，檢測底物耐受性。結果如圖5-b所示，隨著底物濃度的升高，游離細胞酶活力快速降低，在添加100 mmol/L終濃度的底物時酶活力僅有相對酶活力的59%，在300 mmol/L終濃度底物下基本完全喪失酶活力。磁性固定化細胞在200 mmol/L以下隨著底物濃度的升高酶活力逐漸提高，并在200 mmol/L終濃度底物下表現出最高酶活力，然后隨著底物濃度的繼續升高而逐漸降低。在400 mmol/L終濃度底物下，磁性固定化細胞仍保留有60%的酶活力。磁性固定化細胞的底物耐受性比游離細胞顯著提升。

2.2.6 初始底物濃度對磁性固定化細胞轉化能力的影響

在相同體系下，分別添加50～400 mmol/L不同初始濃度的底物。結果如圖5-c所示，50和100 mmol/L的底物在5 min內即可完全轉化完畢，當底物濃度進一步提高，轉化時間相應延長，400 mmol/L的底物需要60 min才能完全轉化。考慮到轉化效率，后續批次轉化生產煙酸實驗采用200 mmol/L終濃度的底物進行轉化。

2.3 磁性固定化細胞批次轉化

每批次添加200 mmol/L終濃度的底物3-氰基吡啶，游離細胞在轉化10批次后殘余酶活力約為初始酶活力的20%，產物抑制較為明顯。因此每轉化10批次，通過磁場分離磁性固定化細胞與產物，對固定化細胞進行重復使用結果如圖6所示。

a-磁性固定化細胞的溫度穩定性；b-磁性固定化細胞和游離細胞的底物耐受性；c-初始底物濃度對磁性固定化細胞轉化能力的影響圖5 磁性固定化細胞的性能評價Fig.5 Performance evaluation of magnetically immobilized cells

圖6 磁性固定化細胞批次轉化生產煙酸Fig.6 Batch conversion of magnetic immobilized cells to produce nicotinic acid

前10個批次3-氰基吡啶可以在8 min之內轉化完畢，第11～20批次底物能夠在15 min內完全轉化，第21～30批次底物能夠在20 min內完全轉化，并檢測不到底物殘留，最終煙酸累積質量濃度達到738.66 g/L，是目前已有報道的B.subtilis腈水解酶生產煙酸的最高水平。據報道，DONG等[21]對腈水解酶產生菌惡臭假單胞菌CGMCC3830進行復合固定，該固定化細胞可以轉化14批次3-氰基吡啶，并積累煙酸達418 g/L。

經過酶活力測定，在轉化30批次底物后，磁性固定化細胞仍然保留40%酶活力，而游離細胞僅能完成一輪批次轉化，酶活力就顯著喪失。和游離細胞相比，磁性固定化細胞對3-氰基吡啶的轉化速率大大提升，前期是游離細胞的3.75倍。通過磁場快速分離產物后轉入新的體系仍能繼續進行批次轉化，最終累積生成煙酸濃度是游離細胞的2.5倍。

3 結論

本文分別使用分批培養、恒速補料培養以及恒pH培養等不同策略對重組腈水解酶產生菌B.subtilispMA5-NITR進行發酵培養。其中恒pH培養的策略效果最佳，重組菌最高OD600為58.85，是分批培養的3.05倍；最高酶活力為167.32 U/mL，是分批培養的2.64倍。靜息細胞質量濃度5 g/L、反應溫度30 ℃、pH 7.2是重組腈水解酶的最佳磁性固定化條件。相較于游離細胞，磁性固定化細胞的底物耐受性明顯提升。按照200 mmol/L的批次底物投料濃度，磁性固定化細胞能在450 min內完全轉化30批次底物，煙酸累積質量濃度達到738.66 g/L，是目前報道的B.subtilis腈水解酶生產煙酸的最高水平，并且轉化完畢后仍能保留40%的酶活力。本研究對于提升腈水解酶轉化3-氰基吡啶制備煙酸的工藝經濟性具有重要意義，有望為其潛在工業應用奠定堅實基礎。