微生物法從頭合成2-苯乙醇的研究進展

朱靈桓，徐沙，李由然，張梁，石貴陽*

1(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)2(糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫，214122)3(河北科技大學 食品與生物學院，河北 石家莊，050018)

2-苯乙醇(2-phenylethanol，2-PE) 是一種效用普遍、價值可觀的高級芳香醇，天然存在于多種蔬果、花卉的花葉或其萃取的精油中。由于2-苯乙醇具有令人愉悅的香味及穩定的性質，在食品、日化用品甚至醫藥等領域都具有非常廣泛的應用[1-2]。國內外的2-PE年產量已突破1萬t，并以每年10%～15%的速度快速增長，但仍然供不應求[3]。目前2-PE工業規模的生產方法主要是化學合成法，雖然產品市場價低，工藝成熟，但此類化學原料具有致癌風險，而且產物中常含有一些難以去除的副產物與雜質，導致產品質量差異較大，無法達到香料添加劑標準，極大限制了產品的使用范圍[4]。采用物理方法從植物精油中直接提取2-PE，雖然產品純度高且品質天然，但原料稀缺，提取成本高，難以滿足市場需求。與此相比，微生物發酵法原料廉價易得，反應條件溫和，對環境友好，其產品相當于物理提取法產品的天然質量，又具備化學合成法成本低廉的應用潛力，受到國內外研究者的關注[5]。本文主要論述了構建從頭合成2-PE工程菌的代謝改造策略，并展望了合成2-PE的研究方向以及存在的問題，以期為微生物發酵法生產2-PE及其工業化提供支持。

1 微生物中2-PE的主要合成途徑

多種酵母天然具有合成2-PE的能力，如解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)[6]、馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)[7-8]、魯氏接合酵母(Zygosaccharomycesrouxii)[9]、季也蒙畢赤酵母(Meyerozymaguilliermondii)[10]和釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)[11]等，為微生物發酵法生產2-PE奠定了基礎。一些原核微生物中雖然缺少關鍵酶導致無法合成2-PE，但其莽草酸途徑(shikimate pathway)能夠提供必要的前體物質苯丙酮酸，為合成2-PE創造了有利條件。

在酵母細胞中，2-PE的合成路徑取決于培養基中氮源的種類。當L-苯丙氨酸作為唯一氮源時，酵母直接通過艾氏途徑(Ehrlich pathway)對底物L-苯丙氨酸進行生物轉化合成2-PE；當培養基使用豐富易利用氮源，如無機氮、尿素時，酵母細胞主要通過莽草酸途徑以葡萄糖為底物從頭合成2-PE，如圖1所示。艾氏途徑包括轉氨、脫羧和還原3個反應，合成效率高，研究較為深入，然而以氨基酸為底物的多級生產模式限制了其作為生物合成方法的發展潛力[12]。另一方面，以葡萄糖為底物從頭合成2-PE的方法雖然反應多且調控復雜，但其擺脫了以氨基酸作為底物的生產成本限制，并且在建立芳香族化合物合成的平臺菌株方面意義重大，因此隨著莽草酸途徑相關研究的不斷深入[13-15]，逐漸成為研究熱點。以往的報道中采用了傳統的方法，包括篩選高性能菌株，隨機誘變，培養基和其他工藝優化等，為從頭合成2-PE 的研究打下堅實基礎。其中，釀酒酵母遺傳背景清晰且對2-PE的耐受性較高，用于黃酒釀造的酵母天然合成2-PE的能力較強，馬克斯克魯維酵母的代謝改造潛力可觀等，均為具有高產2-PE潛力的優良菌株。近年來，代謝工程改造策略也被用于進一步提高2-PE的產量，并取得了可觀的成果，如表1所示。

圖1 酵母中2-PE的合成途徑Fig.1 Synthetic pathway of 2-PE in yeast

表1 不同微生物菌株合成2-PE的能力比較Table 1 Comparison of 2-PE production by different microorganism

2 酵母以葡萄糖為底物合成2-PE的代謝改造策略

酵母細胞中，以葡萄糖為底物的2-PE合成是通過基于莽草酸途徑的芳香族氨基酸合成途徑來實現的。芳香族氨基酸合成途徑是酵母細胞內最為復雜的合成途徑之一，其代謝途徑長，支路多，存在多種抑制作用，涉及到胞內所有主要代謝途徑，同時具有胞內最為復雜的調控機制，與之相關的代謝囊括了糖酵解途徑、磷酸戊糖途徑、葡萄糖吸收系統、檸檬酸循環等。目前，利用代謝工程從頭合成2-PE的改造策略主要集中在增加前體供應、解除反饋抑制、減少副產物升成、增強關鍵酶活性和途徑重構方面。

2.1 增加前體供應

莽草酸途徑是生物合成各種芳香族衍生物不可或缺的途徑，它始于磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate，PEP，來源于糖酵解途徑)和赤蘚糖-4-磷酸(erythrose-4-phosphate,E4P，來源于磷酸戊糖途徑)的縮合，如圖2所示。代謝通量分析表明，只有8%的PEP會流入莽草酸途徑，而E4P的碳流量比PEP還要低一個數量級[20]。因此，有效碳通量的缺乏以及PEP和E4P之間流量的不平衡是阻礙2-PE合成的重要原因。通過代謝改造策略能夠有效提高前體PEP和E4P流入莽草酸途徑的通量，這在芳香族化合物的從頭合成研究中已得到證實。GOLD通過敲除釀酒酵母中的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因ZWF1實現了PEP的積累[21]；GUO等[22]在酪醇合成的研究中，敲除丙酮酸脫羧酶基因PDC1以阻斷PEP流向丙酮酸的合成方向，并在此基礎上過表達磷酸酮醇酶基因xfpk，將存在于糖酵解和磷酸戊糖途徑的重要中間代謝物果糖-6-磷酸直接轉化為E4P[23]。增加前體PEP和E4P的供應對于從頭合成2-PE也是至關重要的，這已成為最近研究中的熱門策略。HASSING等[12]在釀酒酵母中過表達酮醇轉移酶基因TKL1，并結合關鍵酶過表達等代謝工程手段將2-PE產量提高了1.4倍；另外，考慮到ZWF1的敲除會對細胞生長產生不利影響[24]，此改造策略中并未采用zwf1Δ菌株。本實驗室在增加前體供應的研究中證實了與HASSING相似的結論[25]，即過表達TKL1能夠增加E4P的積累，從而促進2-PE的合成。GU等[6]在解脂耶氏酵母中篩選并表達不同來源的磷酸轉酮酶[26]，并敲除丙酮酸激酶增加了莽草酸途徑前體E4P和PEP的積累，進一步解除3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸 (3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate，DAHP)合酶的反饋抑制后構建了高產2-PE的代謝工程菌株，將2-PE產量由出發菌株的8.48 mg/L提高至2 426 mg/L。值得注意的是，不同菌株之間的代謝差異可能造成適用的代謝策略差異[21,27]，并且由于PEP和E4P均為細胞代謝中重要的中間代謝物，增加前體供應需要與莽草酸途徑中其他代謝改造手段共同作用，以便顯著提高2-PE產量[23, 28]。

圖2 釀酒酵母中2-PE的從頭合成途徑Fig.2 De novo synthetic pathway of 2-PE in S.cerevisiae注：CHO，分支酸；DAHP，3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸；DAHP，二羥基丙酮磷酸；E4P，赤蘚糖-4-磷酸；FBP，果糖-1,6-二磷酸；F6P，果糖-6-磷酸；GAP，D-甘油醛-3-磷酸；G6P，葡萄糖-6-磷酸；PEP，磷酸烯醇式丙酮酸；L-Phe，L-苯丙氨酸；PAC，苯乙醛；PPY，苯丙酮酸；PREP，預苯酸；PYR，丙酮酸；Ru5P, D-核酮糖-5-磷酸；R5P，D-核糖-5-磷酸；S7P，D-景天庚酮糖-7-磷酸；L-Trp, L-色氨酸；L-Tyr, L-酪氨酸；X5P, D-木酮糖-5-磷酸；1,3DPG，3-磷酸-D-甘油酰磷酸；2-PE，2-苯乙醇；2PG，2-磷酸-D-甘油；3PG，3-磷酸-D-甘油；6PG，3-磷酸-D-甘油；6PGL, 6-磷酸-D-葡萄糖酸-1,5-內酯

2.2 解除反饋抑制

微生物細胞中，一些關鍵步驟的碳代謝流決定了整體代謝水平及產物的生成量，是整個途徑的限速步驟和合成瓶頸。DAHP 合酶和分支酸變位酶受到相應芳香族氨基酸的嚴格反饋抑制，是限制整條途徑代謝流的調控位點。通過定點突變能夠有效解除反饋抑制，加大途徑的代謝通量[29]。LUTTIK等[30]發現抗反饋抑制突變體ARO4K229L在釀酒酵母中的過表達能夠使2-PE的產量提高至220 μmol/L，但ARO7G141S的單獨過表達并未產生顯著影響。此后，一些有效的突變體如ARO3K222L[12]、ARO4K221L[31]等也被用于在酵母中解除抑制并提高2-PE的產量。研究表明，來源于原核微生物的突變基因的表達對增加莽草酸途徑代謝通量的效果往往優于真核微生物基因[14, 25]，如aroGD146N[25, 32]、aroGS180F[6]、aroFfbr[33]等在構建芳香族氨基酸和芳香醇的合成菌株方面效果顯著。另一方面，與酵母的分支酸變位酶不同的是，大腸桿菌中是由雙功能酶PheA催化分支酸的變位和預苯酸的脫水反應，并受到L-苯丙氨酸的反饋抑制，是控制芳香族化合物合成的關鍵節點[34]。雙功能酶PheA 由分支酸變位酶(chorismate mutase，CM)酶活區、預苯酸脫水酶(prephenate dehydratase，PDT)酶活區和R-domain 調節區3個結構域組成，刪除R-domain 能夠有效解除L-苯丙氨酸對PheA 的反饋抑制，且對分支酸變位酶活性沒有顯著影響[32, 35]。因此，抗反饋抑制突變體pheAfbr被廣泛用于克服2-PE的合成瓶頸，在大腸桿菌[17]、腸桿菌[36]、釀酒酵母[25]和畢赤酵母[19]中均能發揮作用，成為代謝改造策略中至關重要的一環。由于在莽草酸途徑中，細胞對于關鍵酶的調控非常嚴格，因此代謝改造中往往需要解除多種酶反饋抑制的協同作用。

除了研究較為透徹的DAHP合酶和分支酸變位酶，酵母細胞中還存在著其他影響2-PE合成的關鍵酶，具有相當大的研究潛力。酵母細胞的五功能酶Aro1p能夠縮短底物通道，結構功能復雜的亞基之間聯系緊密，但與之相關的調控機制鮮有報道。與研究較為透徹的大腸桿菌中具有相似功能的酶對比，如圖3所示，同樣是催化DAHP到5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate，EPSP)的合成，大腸桿菌編碼莽草酸脫氫酶的基因aroE、編碼莽草酸激酶的基因aroL均受到中間產物莽草酸的反饋抑制，編碼莽草酸激酶的基因aroK受到L-色氨酸、L-酪氨酸和L-苯丙氨酸的反饋抑制，這對釀酒酵母的五功能酶Aro1的調控機制研究也能夠起到一定的借鑒作用。GOLD等[21]指出加大上游基因ARO4表達強度會引起中間代謝物莽草酸的大量積累，而通過過表達大腸桿菌來源的莽草酸激酶aroL和莽草酸脫氫酶ydiB能夠有效疏通途徑中代謝通量的阻塞[25]。另外，LIU等[37]在高產2-PE的黃酒酵母中發現其預苯酸脫水酶發生突變(I161K、L239P和Q250H)，且存在L-苯丙氨酸的保守結合位點，這使其具有較高的底物親和力、催化效率和熱穩定性，但不容易受到反饋抑制。

圖3 大腸桿菌與釀酒酵母途徑比較Fig.3 Comparison of synthetic pathways between E.coli and S.cerevisiae

2.3 減少副產物生成

酵母的莽草酸途徑中，預苯酸脫水生成性質不穩定的苯丙酮酸，而后可通過可逆的Aro8p和Aro9p轉氨生成L-苯丙氨酸供酵母生長所需，也可通過Aro10p的脫羧生成苯乙醛后，再還原生成2-PE或者氧化生成苯乙酸。以合成2-PE為目標的代謝改造策略中，L-苯丙氨酸和苯乙酸都是可能造成代謝分流的副產物。L-苯丙氨酸是必需氨基酸，且L-苯丙氨酸與苯丙酮酸之間的轉氨反應是可逆的，因此為避免影響細胞正常生長，需要選擇性敲除ARO8或ARO9以弱化支路途徑。ROMAGNOLI等[38]構建了aro8Δ菌株，在以硫酸銨為唯一氮源的葡萄糖合成培養基中能夠促進2-PE的合成。ZHU等[25]將敲除ARO9與過表達ARO10相結合，在非氨基氮源培養條件下將2-PE產量提高了2.3倍，達到116 mg/L。雖然有報道稱Aro8p是酵母中起主要催化作用的芳香族氨基酸轉氨酶，但2-PE合成菌株的特性、培養條件甚至誘導因素存在著差異，使得適用的代謝策略有所不同。苯乙醛是不穩定的化合物，能夠被氧化為苯乙酸，降低2-PE的產量，而通過敲除ALD2和ALD3[39]可以降低苯乙酸方向的分流。另外，其他競爭途徑的阻斷也能促進2-PE合成。HASSING等[12]證實，在釀酒酵母中表達丙酮酸激酶基因PYK1D146N并敲除酪醇合成途徑，能夠有效提高2-PE的產量至13 mmol/L。

2.4 增強關鍵酶活性

在酵母細胞中，苯丙酮酸脫羧酶在芳香族氨基酸的代謝途徑中的作用為催化苯丙酮酸脫羧形成苯乙醛，是由L-苯丙氨酸生成2-PE的必經途徑。酵母中編碼苯丙酮酸脫羧酶的基因包括ARO10、PDC1、PDC5、PDC6及THI3，VURALHAN等[40]的研究發現，以不同氮源為培養條件時，上述5個基因的轉錄水平差異很大，L-苯丙氨酸能夠誘導ARO10的轉錄水平提高至其他基因的30倍以上，說明釀酒酵母的艾氏途徑中Aro10p是起主要作用的苯丙酮酸脫羧酶。Aro10p具備較為廣泛的底物范圍，能夠催化包括甲硫氨酸、以及所有芳香族氨基酸在內的轉氨產物的脫羧反應[41-43]。酵母細胞對苯丙酮酸脫羧酶存在嚴格而復雜的調控機制。Aro10p在氮源豐富的培養基條件下不表達，在氮源貧乏的培養基條件下能夠被L-苯丙氨酸或色氨酸、甲硫氨酸等誘導表達，此誘導作用與Aro80p[44]上游激活序列相關，但具體調節方式位點和調控強度尚不清楚，成為了精細代謝改造有待解決的關鍵問題。KIM等[16]在解除了DAHP合酶反饋抑制的克魯維酵母中，過表達釀酒酵母來源的苯丙酮酸脫羧酶基因ARO10和脫氫酶基因ADH2，得到2-PE 產量約1.3 g/L。KONG等[19]在解除了DAHP合酶和分支酸變位酶反饋抑制的畢赤酵母中，過表達ARO8-ARO10-ADH6，以葡萄糖為底物合成2-PE達到1.17 g/L。

2.5 重構代謝途徑

近年來，通過在大腸桿菌細胞中重構合成途徑得到2-PE產品的成果頗豐。由于缺乏2-酮酸脫羧酶，大腸桿菌無法通過艾氏途徑合成2-PE，因此在解除代謝流量瓶頸的基礎上，必須同時在大腸桿菌中異源表達酮酸脫羧酶才能夠實現2-PE的積累。KANG等[45]通過優化大腸桿菌來源的基因aroF、pheA與酵母來源的脫氫酶基因ADH1和脫羧酶基因KDC的協同表達，將2-PE產量由57 mg/L提高到285 mg/L。GUO等[17, 46]在解除反饋抑制的大腸桿菌中引入了異源的轉氨酶基因ARO8、脫羧酶基因KDC和還原酶基因yjgB，成功構建了艾氏途徑關鍵酶聯合表達體系，得到1.016 g/L 2-PE。大腸桿菌作為遺傳背景清晰、調控相對簡單的模式生物，因其代謝改造便捷、產物積累量高，一直以來深受研究者青睞。由于利用大腸桿菌生產芳香族氨基酸的研究成果已達到工業化水平，莽草酸途徑暢通流量大，為合成相應芳香醇打下了扎實的研究基礎。但是，2-PE作為香料被廣泛應用在食品、日化用品與醫藥行業，使得以大腸桿菌作為宿主的生產方法無可避免地存在應用范圍方面的缺陷。在酵母的途徑重構方面，MO等[47]在釀酒酵母中過表達異源酶，重構了一條“苯乙烯-2-PE途徑”。通過整合來源于擬南芥的苯丙氨酸解氨酶基因PAL2、來源于釀酒酵母的阿魏酸脫羧酶基因FDC1以及來源于惡臭假單胞菌的氧化苯乙烯異構酶基因SOI和苯乙烯單加氧酶基因SMO，得到了680 mg/L的胞外2-PE。

3 2-PE的合成前景與展望

2-PE作為一種在食品、醫藥和日用化工行業應用廣泛的芳香醇，受到越來越多的關注。隨著人們對2-PE在安全性和生產成本方面的要求不斷提高，開發綠色高效的合成方法勢在必行。利用莽草酸途徑從頭合成2-PE具有良好的應用前景，合成代謝的途徑、相關基因及調控位點已非常清晰，為相關研究的開展提供了充足的理論基礎。除了傳統的基因敲除、表達和調控等代謝工程手段外，還有望通過挖掘有潛力的關鍵基因和協調細胞內代謝網絡來實現2-PE的高產。

3.1 挖掘關鍵基因

基于對高產2-PE菌株的組學分析(比如將基因組學、轉錄組學與蛋白組學相結合)，能夠挖掘出促進合成2-PE的關鍵基因，并且需要通過基因編輯與發酵實驗進一步驗證其作用，實現理性改造。隨著從頭合成2-PE相關研究的不斷深入，如何高效利用葡萄糖底物、平衡細胞生長與2-PE合成之間的關系成為提高2-PE產量的難點。與大腸桿菌磷酸轉移酶基團吸收葡萄糖的方式不同，酵母是通過己糖轉運蛋白進行葡萄糖的運輸，轉化效率更高。其中，釀酒酵母的HXT7(YDR342C)編碼高親和性的葡萄糖轉運蛋白，在糖濃度較高時其表達水平會被抑制，這可能與大部分研究中2-PE合成的最適條件(培養基中葡萄糖質量濃度一般為20 g/L)存在關聯；HXT11(YOL156W)能夠運輸多種底物，包括葡萄糖、果糖、甘露糖和半乳糖等，其改造能夠為利用更多種糖類從頭合成2-PE創造可能。另外，芳基醇脫氫酶(aryl-alcohol dehydrogenases，AAD)中的Aad1p和Aad6p對苯乙醛親和力較高[48]，具有進一步研究的價值。

3.2 協調代謝網絡

微生物從頭合成2-PE涉及眾多代謝途徑，協調細胞內代謝網絡以促進2-PE的合成將會是未來研究的重點。除了增加前體供應、減少副產物生成等，還可以利用對NADH 激酶的調控、NADP+依賴型脫氫酶的增強以及支路代謝途徑的重構，將輔因子最大化地流向合成2-PE的途徑。另外，培養基中含有無機氮等易利用氮源時，細胞中的氮分解代謝物阻遏作用(nitrogen catabolite repression，NCR)會抑制2-PE的產生。結合對2-PE合成途徑的改造，對NCR相關基因進行轉錄調控有望緩解這種抑制作用。微生物合成2-PE還存在著一個瓶頸，即2-PE對細胞生長具有抑制作用， 但微生物對2-PE的耐受機制尚不清楚[49]，需要進一步基于組學數據的研究來揭示其機制。

綜上所述，2-PE合成途徑的研究對于促進傳統食品發酵工業的現代化、新型芳香族化合物生產菌株構建和豐富釀酒酵母代謝改造元件方面都具有重要價值，構建新型的高發酵強度和高轉化率生產菌株意義重大。