組學技術在木質素降解酶系挖掘中的應用進展

李艷，陳復生，楊趁仙

(河南工業大學 糧油食品學院，河南 鄭州， 450001)

當前，人們對化石燃料的過度需求和開發引起了許多問題，從能源短缺、環境污染再到不可持續性發展，因此，亟需尋找綠色、清潔、可再生能源作為替代[1]。生物質資源是指利用環境中大氣、土壤、水等進行光合作用而產生的可再生有機物質，包括農作物、樹木等植物及其廢棄物、畜禽糞便等有機廢棄物，例如草木、秸稈。生物質中含有豐富的纖維素、半纖維素、木質素等有機物[2]，是生產清潔能源的主要原料[3]。因此，生物質資源將成為石油工業的重要替代品。我國作為農業大國，糧食作物產量大，而農業廢棄物(如秸稈)年產量高達7億t[4]。但目前，大部分秸稈廢棄物被就地焚燒，這不僅對環境造成了嚴重的污染，同時也是生物質資源的極大浪費[5]。

在生物質資源的利用過程中發現，木質素作為天然的物理屏障，將纖維素緊緊包裹，不利于纖維素的開發和利用，極大的降低纖維素生產能源的效率。近年來，學者們開始關注植物生物質中木質素的降解。目前，木質纖維素生物質的降解方法主要包括物理處理(機械粉碎，熱解等)、物理化學處理(二氧化碳爆炸，蒸汽爆炸等)、化學處理(臭氧分解，堿水解等)以及生物法處理(微生物、酶的降解)。但物理和化學法降解木質纖維素通常需要昂貴的設備，消耗更多的能量甚至會產生有毒有害的廢棄物。與此相比微生物介導的生物催化過程因其反應條件溫和、設備簡單，在降解木質素方面具有較高的優勢，為木質素的利用提供了更具體有效的替代方法[6]。本文主要對木質素降解酶系及其作用機制進行綜述，尤其總結了基于組學技術挖掘的木質素降解酶，旨在全面深入的了解木質素降解酶系，對生物質資源的高效利用奠定基礎。

1 木質素的結構和性質

木質纖維素是植物生物質中細胞壁的主要成分，其結構如圖1所示，包括木質素、纖維素、半纖維素、果膠等[7]。木質素由復雜的芳烴組成，其單元結構是愈創木基(G型)、對羥基苯基(H型)和丁香基(S型)，3種結構單元通過不同的化學鍵相連構成無規則的3維網狀結構，因此木質素結構復雜，難溶于水，不易降解。木質素降解的意義在于：(1)木質素包裹在纖維素和半纖維素的外部，降解木質素可以增加纖維素和半纖維素的利用率，因此木質素的有效解聚是打破木質纖維素物理屏障對其進行生物利用的關鍵過程[8]；(2)木質素是生物圈中含量最豐富的芳香生物聚合物，降解后可用來生產香草酸等芳香族化合物類高附加值化學品[9]；(3)木質素結構中含有甲氧基、羰基、醇羥基等，使其具有抗菌、吸附、抗氧化等潛力，可用來生產木質素基樹脂材料、木質素基吸附材料。對木質纖維素的生物降解進行有效了解和控制，將減輕因秸稈焚燒或副產物丟棄造成的環境污染，同時木質素也可作為生產可再生化合物和高級生物燃料的原料，以滿足對化石燃料衍生能源和材料日益增長的需求。

圖1 植物生物質結構Fig.1 Structure of plant biomass

2 木質素降解酶系的研究

細菌、真菌和放線菌是自然界中能夠降解木質纖維素的微生物[10]。在木質素的降解中，真菌因其具有強大的木質素降解酶系統而起主要作用，例如可產生胞外木質素降解酶的白腐菌[11]。與真菌相比，細菌因其生長快、結構簡單、具有較強的適應性，分泌的酶熱穩定性強以及pH耐受范圍廣等優點，引起了越來越多研究者的注意[12]。除有氧環境外，木質纖維素還被厭氧細菌降解和轉化。低氧濃度真菌降解木質素具有抑制作用，但是細菌表現出對厭氧條件較強的適應性，這也是細菌降解木質素成為近年來研究熱點的原因之一[13]。

木質素降解通常可以得到高產率的芳香族化合物，尤其是木質素單體。木質素解聚過程主要包括2個階段：天然木質素的解聚和所得異質芳烴的礦化，在不同的降解階段起主要作用的酶不同[14]。

2.1 木質素解聚過程相關酶

木質素過氧化物酶(lignin peroxidase，LiP)、錳過氧化物酶(Mn-dependent peroxidase，MnP)和多功能過氧化物酶(versatile peroxidase，VP)在木質素解聚過程中發揮著重要的作用[15]。3種木質素分解過氧化物酶具有相當高的序列同一性，并與二硫鍵和鈣離子共享相似的螺旋形折疊，以實現結構完整性。LiP具有高氧化還原電位，可氧化高達90%的木質素非酚結構。它還具有氧化多種芳香族化合物的能力，因此具有在木質素酶促降解中的作用。除了非酚類底物的特征性氧化外，LiP還顯示出氧化多種酚類化合物的能力。此外，VP結合了MnP和LiP的催化特性，具有廣泛的木質素分解能力。VP活性的多功能性可能歸因于其獨特的分子結構。VP氧化高氧化還原電位化合物的能力與暴露的催化色氨酸有關，該色氨酸通過遠端電子轉移至血紅素而在酶表面形成自由基[16]。MnP分子結構與LiP相似，也是一種糖蛋白，大多數的白腐菌和土壤垃圾降解菌具有合成MnP的能力，MnP具有底物特異性，主要催化酚醛類的Cα—Cβ鍵裂解，Cα—H鍵氧化和烷基-芳基的C—C鍵裂解。MnP表現出對Mn2+的依賴，MnP催化通常是將Mn2+轉化為Mn3+，高氧化活性的Mn3+可將大量的酚類底物氧化[17]。

與上述木質素分解過氧化物酶不同，漆酶(laccase,Lac)是一種氧化酶，可以促進木質素分子的裂解，包括芳香環的打開，烷基-芳基的破壞和酚羥基的增加，完整的催化反應是電子轉移氧化，涉及4個連續的單電子氧化[18]。一般而言，漆酶蛋白質分子中均含有4個銅離子，分為3種不同類型：1個Ⅰ型銅，1個Ⅱ型銅，2個Ⅲ型銅[19-20]。漆酶氧化木質素時首先從木質素中提取1個電子，利用雙氧作為電子受體，導致底物分子產生自由基，產生的自由基不穩定，并且會發生聚合或解聚反應，從而導致木質素降解。產生的大量自由基經歷非酶反應[21]，最終，木質素大分子解聚為單體，產生了大量的芳香族化合物，漆酶可以將其用作底物以繼續進行酶促水解[22]。

在細菌中，最早被鑒定的木質素降解酶是來自紅球菌RhodococcusjostiiRHA1的過氧化物酶DyPB[23]。DyP型過氧化物酶具有使染料脫色和氧化多種酚類底物的活性[24]。基于序列比對建立系統發育樹后，根據一級結構的同源性將DyPs分為ABCD 4個亞型，其中A～C型DyP主要在細菌中發現，D型大多存在于真菌中。DyPs結構通常表現出二聚體鐵氧還蛋白樣折疊，構成具有由α-螺旋外圍連接的4個β鏈的反平行β-折疊[3, 25]。DyPs的特異性比較低，主要在酸性pH下具有活性，顯示出非常廣泛的底物分布，比如一些典型的過氧化物酶底物：ABTS、剛果紅；DyPs能夠降解不同的染料，尤其是一些不易降解的蒽醌染料；此外還能降解單酚化合物、β-胡蘿卜素，木質素模型化合物[26-27]。YU等[28]從Saccharomonosporaviridis中克隆了編碼SviDyP的基因，在大腸桿菌中異源表達，然后純化，根據系統發育分析，SviDyP屬于DyPs的A型，與來自A型的其他DyPs相比，純化的SviDyP具有顯著的廣泛底物特異性，SviDyP重組蛋白顯示出顯著的耐熱性和耐堿性，并且可以直接有效地降解木質素。

2.2 木質素礦化過程相關酶

木質素解聚衍生的異質低分子質量芳烴的礦化作用主要受細菌的控制[14]。降解木質素的細菌通常形成聚合體共同降解木質素，Sphingobiumsp.SYK-6具有同化各種聯芳基的能力[29]，包括β-芳基醚，聯苯甲基以及單芳基如阿魏酸酯、香蘭素，在細菌分解代謝途徑中，各種芳香族化合物通過各種酶促反應例如醚裂解、雙鍵裂解、側鏈裂解、脫羧和氧化作用分別轉移到香草醛、丁香酸酯和對羥基苯甲酸酯中，然后這些化合物都轉化為兒茶酚衍生物，芳環被裂解產物通過幾種不同的途徑進入三羧酸循環[30-31]。

細菌β-醚酶系統可以降解木質素中的β-芳基醚結構(β-O-4)。β-醚酶家族首先在Sphingobiumsp.SYK-6中鑒定出來，該細菌具有降解含有β-O-4結構的木質素二聚體的能力，并生成香草酸、丁香酸等中間體化合物[32]。Sphingobiumsp.SYK-6對木質素中β-O-4鍵的降解包括：Cα脫氫酶(LigD、LigL、LigO、LigN)、醚酶(LigE、LigF、LigP)和谷胱甘肽裂解酶(LigG)。LigDFG系統催化以下反應主要分為3步：(1)在NAD+存在下，LigD將底物中Cα的羥基氧化形成酮基，使木質素底物由醇氧化為相應的酮；(2)LigF通過還原型谷胱甘肽攻擊Cβ而破壞醚鍵；(3)谷胱甘肽轉移酶LigG在另一種還原型谷胱甘肽的輔助下，從底物中釋放出氧化的二聚體谷胱甘肽和芳香族單體，生成最終產物。在β-芳基醚催化途徑中，需要多種Lig酶共同作用才能將木質素中的β-醚鍵斷裂。其中，LigL、LigO、LigN和LigD作用相似，LigE、LigP也能催化與LigF相同的反應。

芳香族裂解雙加氧酶代表一組細胞內酶，主要將木質素衍生的芳香族化合物解構為線性形式，可以進一步代謝為三羧酸循環中間體。因此，雙加氧酶被認為是酶降解木質素利用芳香族化合物作為碳源和能源的重要組成部分。兒茶酸雙加氧酶和兒茶酚雙加氧酶是最常見的催化雙氧依賴性環裂變的酶。

2.3 其他相關酶類

除Lip、MnP和漆酶以外，也有一些其他酶類與木質素降解過程密切相關。芳醇氧化酶(aryl-alcohol oxidase，AAO)是一種提供細胞外H2O2的酶，在酶促木質素解聚，特別是在木質素聚合物的氧化中起著重要作用。AAO底物可包括木質素衍生的化合物和芳香族真菌代謝產物，還可減少木質素降解過程中漆酶產生的苯氧基，防止木質素在酶的作用下聚合[33]。AAO能夠將芳香族醇轉化為相應的醛，并提供細胞外H2O2來降解木質素。在幾種降解木質素的真菌中，從1株Trichodermareesei中檢測到了AAO活性[34]。RASHID等[35]從Sphingobacteriumsp.T2 鑒定出2種細胞外錳超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)(MnSOD1和MnSOD2)，催化雙氧與活性氧超氧化物和過氧化物的相互轉化。它們以重組形式對有機溶劑木質素的氧化均具有高活性，產生多種反應產物，并且在存在雙氧而不是H2O2的情況下Sphingobacteriumsp.T2具有更高的木質素氧化活性。

3 組學在木質素生物降解酶系挖掘中的應用

3.1 基因組學在木質素降解過程中的應用

基因組學是應用DNA的重組、測序以及生物信息學的組裝對基因的功能和結構進行分析。全基因組測序可以將木質素降解體系中含有的多種微生物進行分析[36]。LIU等[37]通過PacBio測序技術對TrometestrogiiS0301基因組進行了測序，并進行高質量注釋，確定T.trogiiS0301具有潛在的環境木質素降解和適應能力，為研究Trametes屬真菌對木質素的降解提供有價值的基因組資源。KUMER等[38]對Pandoraeasp.ISTKB進行基因組學分析揭示了負責木質素降解和聚羥基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates，PHA)合成的各種潛在基因的存在，確定了木質素降解的主要途徑，包括芬頓反應以及輔酶A介導的苯乙酸和苯甲酸酯的降解。RIYADI等[39]測定Streptomycessp.S6的基因組草圖顯示細菌過氧化物酶的存在(例如過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶和DyP型過氧化物酶)，并且可參與在木質素的初始解聚階段，基因特征表明Streptomycessp.S6具有堿木素降解能力，同時可生產各種低分子質量木質素衍生的化合物，具有明顯的酶促活性(LiP、Lac和AAO)。宏基因組是將環境中的所有木質素降解微生物的遺傳信息作為一個整體直接提取基因組，將基因組學原本對于單個木質素降解微生物的研究擴大到與環境的研究。MORAES等[40]進行了LigMet的基因組組裝和整體功能注釋，從宏基因組數據集重建基因組草圖，在LigMet中鑒定出與木質素降解代謝途徑相關的幾種微生物和酶，并且分析了木質素降解和香蘭素生產所涉及的生物催化劑和途徑。ZHU等[41]使用PacBio RS II平臺通過SMRT方法獲得了ComamonasserinivoransSP-35的全基因組序列，鑒定出94個可能與木質素降解和代謝有關的基因，并且發現可能與β-芳基醚的裂解有關的酶基因，預測了菌株C.serinivoransSP-35的芳香族中間代謝物的代謝途徑(表1)。

3.2 轉錄組學在木質素降解過程的應用

轉錄組學在木質纖維素降解中的應用主要通過先提取能夠有效降解木質纖維素的微生物樣品的總RNA，將其反轉錄成cDNA后進行高通量測序與生物信息學分析[42]。轉錄組學技術已經在堆肥、青貯、動物瘤胃及腸道等環境微生物研究領域加以應用。LIU等[37]從T.trogiiS0301菌絲體中提取總RNA進行轉錄組分析，發現大量的CAZymes編碼基因顯示出下調趨勢，結合基因組與酶活分析探索木質纖維素降解酶及其編碼基因對木質纖維素底物的反應，發現在葡萄糖耗盡的同時，木質素降解酶與MnP、LiP，纖維素酶和木聚糖酶活性同時增加。吳小峰[43]以麝牛為試驗動物，采用轉錄組學技術去除rRNA的Ribozero RNA進行高通量測序，研究真菌、原蟲、細菌和古細菌等微生物的編碼基因表達以及對小黑麥秸稈中木質纖維素的降解作用，探討了秋季麝牛瘤胃對小黑麥秸稈木質纖維素的降解機制(表1)。

利用轉錄組測序技術對木質纖維素降解微生物代謝進行研究，可以說明其基因是否表達以及表達量的多少，確定木質纖維素降解微生物是否能產生所需的降解酶，填補了宏基因組學中僅能說明木質纖維素降解微生物中是否存在產生木質纖維素降解酶的基因，而不能對基因是否轉錄情況進行分析的研究空間。

3.3 蛋白質組學在木質素降解過程的應用

對木質纖維素降解的傳統研究是先篩選出降解能力較強的菌株，再對培養基進行優化，使相關基因過表達得到足量的目標產物，最終有效降解木質素，但這種方法無法全面了解和掌握木質素降解過程的酶系組成以及變化情況。蛋白質組學可以分析木質素降解過程中的酶系組成和表達量，為全面深入地研究酶對木質素的降解途徑和降解機制提供了新方法。

在木質素降解方面可以利用生物質譜分析及絕對定量技術(isobaric tag for relative and absolute quantification，iTRAQ)找差異蛋白表達，并對其功能進行分析，例如對細菌、真菌的分泌蛋白組進行分析以確定木質素降解過程中的相關酶類以及模型化合物。KUMER等[38]應用無標記的定量蛋白質組學方法來鑒定香草酸和堿木素的表達譜，利用蛋白質組學分析發現了DyP型過氧化物酶、乙醇酸氧化酶、醛氧化酶、漆酶、雙加氧酶、谷胱甘肽依賴性醚酶、脫氫酶以及各種還原酶等功能活躍，確定它們在木質素或芳香族化合物的降解中起重要作用。馮茜[44]采用同位素的相對和絕對定量技術探究AspergillusfumigatusG-13降解3種木質素模型化合物的產酶規律，鑒定得到了41個參與木質纖維素降解的酶，篩選出酶活表達差異最大的兩組進行蛋白質組學分析，確定差異蛋白主要富集于NADH-泛醌氧化還原酶、菌絲過氧化氫酶相關蛋白質，且主要富集于碳源和能量、核苷酸代謝相關途徑。ADAV等[45]利用不同的天然木質纖維素生物質作為主要碳源，以基于相對和絕對定量的蛋白質組學方法，以及高通量等壓標記進行纖維素水解蛋白、半纖維素水解蛋白、木質素解聚氧化還原酶蛋白、肽酶和其他蛋白質的鑒定和絕對定量的分析，以量化比較木質纖維素分解蛋白及其可變的底物誘導的表達。RASHID等[35]對來自Sphingobacteriumsp.T2細胞外部分的蛋白質組學分析鑒定出2種細胞外錳超氧化物歧化酶，它們以重組形式對有機溶劑木質素的氧化具有很高的活性，產生多種反應產物，據此提出了錳超氧化物歧化酶與木質素相互作用的2種可能假設(表1)。

表1 組學技術在研究木質素降解酶中的進展Table 1 Progress of omics technology in the study of lignin degrading enzymes

4 總結與展望

木質纖維素通過酶的降解可以產生一系列芳香族化合物，能夠取代諸如多種石油基化合物高價值藥物和化妝品等貴重物品的新型平臺化學品。通過對木質纖維素降解體系的研究，可以探索木質素衍生芳香族化合物生產的新途徑及關鍵酶類，擴大木質素的應用范圍，為實現木質纖維素生物降解和發酵的產業化奠定基礎。