發酵法生產L-巖藻糖的研究進展

馬巍，鄒祥

(西南大學 藥學院，重慶，400715)

L-巖藻糖(L-fucose)是一種六碳糖，也可視為一種甲基戊糖(圖1)，又稱6-脫氧-L-半乳糖，分子式為C6H12O5，為白色結晶粉末，易吸潮，親水性弱于其他單糖，熔點為138.0～142.0 ℃。L-巖藻糖是巖藻糖在自然界中主要的存在形式，常見于植物或微生物多糖中，而D-巖藻糖較少地存在于一些糖苷類化合物中[1-2]。L-巖藻糖特殊化學結構，在哺乳動物細胞中可作為癌癥生物標記物或靶標的重要的生物功能特征[3-5]，在智能納米載藥系統實現抗腫瘤藥物的靶向遞送[6-7]、減少皮膚受損或延緩皮膚老化[8]等多領域發揮重要的生理活性。

圖1 L-巖藻糖結構Fig.1 Structure of L-fucose

已知，L-巖藻糖的生產主要有天然植物水解(提取)法、化學合成法及微生物發酵法。其中天然植物提取法主要從藻類植物中提取L-巖藻糖，國內外常用的提取方法為溶劑萃取法、酶萃取法等[9-10]；而化學合成法制備L-巖藻糖主要是以L-阿拉伯糖、D-葡萄糖等單糖為起始物通過多步化學反應得到L-巖藻糖[11]。綜合現有植物提取或化學合成方法普遍存在高污染和含量低的問題，而微生物發酵法是一種可持續的L-巖藻糖生產方法，具有不受季節、環境影響、生產周期短、發酵過程容易操作控制、可利用的發酵底物類型多等多種優點，本文圍繞微生物發酵法生產L-巖藻糖的研究進展進行介紹。

1 微生物發酵法

L-巖藻糖常常作為單糖成分存在于微生物胞外巖藻糖基化產物中，微生物發酵法可以利用此特性，以葡萄糖或廉價原料生產富含L-巖藻糖的巖藻糖基化產物或者巖藻胞外多糖(fucose-containing exopolysaccharide, FucoPol)，再從巖藻多糖中水解制備L-巖藻糖。目前常見發酵法生產L-巖藻糖的菌株為腸桿菌屬(Enterobactersp.)、克雷伯菌屬(Klebsiellasp.)、棒形桿菌屬(Clavibactersp.)等[12]。為了提升巖藻糖基化產物產量，通常會采用誘變育種或者基因工程技術構建高產工程菌株的方法，如黃宜蘭等[12]使用紫外誘變和NTG結合的方法獲得高產菌株腸桿菌(Enterobactersp.SIPI-N79)，結果顯示L-巖藻糖的含量達到1.28 g/L，比出發菌株提高了81%。

2 發酵工藝優化

如表1所示，巖藻多糖產生菌株可以利用多種碳源進行發酵培養。FREITAS等[13]以最常用碳源葡萄糖作為發酵碳源，EnterobacterA47(DSM 23139)菌株分批補料培養后得到的L-巖藻糖產量為3.59 g/L。黃宜蘭等[12]對腸桿菌(Enterobactersp.SIPI-N79)的發酵培養基進行優化，得出最佳培養基配方由甘油、胰蛋白胨和碳酸鈣組成，采用甘油代替葡萄糖作為碳源，5 L發酵罐中分批補料發酵，L-巖藻糖產量達到4.55 g/L。除了葡萄糖外， 還使用不同食品加工副產物為廉價發酵底物，考察對EnterobacterA47菌株發酵產巖藻多糖及L-巖藻糖含量的影響[13-19]。本課題組以kosakoniasp.CCTCC M2018092菌株于50 L發酵罐中發酵72 h得到L-巖藻糖最終產量為5.19 g/L[20]。

表1 不同微生物菌株多糖及多糖中L-巖藻糖產量Table 1 L-fucose production in polysaccharides and polysaccharides of different microbial strains

利用微生物生產巖藻多糖相比植物提取方法具有生產周期短等多種優點，但這種富含L-巖藻糖的生物多糖發酵普遍具有高黏度的發酵特性。傳統攪拌槳組合的傳質傳氣和混合效率并不能滿足這種高黏度發酵體系要求，存在氣體分散不均勻，傳質效率差等不足，影響多糖合成效率[21-22]。通過對不同攪拌槳進行設計與組合可以有效改善高黏度發酵體系的生產效率[23-28]，如鄭之明等[29]研究黃原膠高黏度發酵系統發現，具有較高剪切力和較大有效攪拌區域的反應器更適合黃原膠發酵。本實驗室結合計算流體動力學(computational fluid dynamics,CFD)[30-31]的方法通過對劍葉，四寬折葉，六直葉以及設計加框形槳等4種攪拌槳進行組合優化(圖2)，篩選攪拌性能改善的攪拌槳組合來進行實際發酵驗證，進而優化L-巖藻糖發酵過程中的傳質傳氧效率。

a-六劍葉槳;b-四寬折葉槳;c-六直葉槳;d-框形槳圖2 四種攪拌槳示意圖Fig.2 Four types of agitation paddles

新式框式槳的加入降低了攪拌槳尖外的氣液混合遲滯區，有效提高罐內流體的混合效率，促進氣液混合，巖藻多糖發酵水平得到明顯提高。

3 代謝工程改造

巖藻多糖是以二磷酸尿苷葡萄糖(UDP-Glucose)、鳥苷二磷酸-巖藻糖(GDP-fucose)等糖核苷酸分子為底物，在糖基轉移酶(glycosyltransferases,GTs)的催化下合成，隨后又通過Wzx/Wzy依賴的途徑將多糖運輸到細胞表面[32]。研究表明合成單元GDP-巖藻糖的產量直接決定了巖藻糖基化產物中L-巖藻糖的含量，因此提高GDP-巖藻糖產量對生產L-巖藻糖具有重要意義[33]。GDP-巖藻糖的生產有2條途徑，從頭合成途徑和補救途徑，如圖3所示。

圖3 GDP-巖藻糖的從頭合成途徑和補救途徑Fig.3 De novo pathway and salvage pathway of GDP-fucose

從頭合成途徑的關鍵酶主要有甘露糖-6-磷酸異構酶(ManA)、磷酸甘露糖變位酶(ManB)、甘露糖-1-磷酸鳥苷酰轉移酶(ManC)、GDP-甘露糖-4,6-脫水酶(Gmd)、以及一個雙功能酶GDP-4-酮-6-脫氧甘露糖-3,5-變旋酶/4-還原酶(WcaG)，在這些酶的參與下葡萄糖被逐漸轉變為GDP-巖藻糖；補救途徑合成GDP-巖藻糖的關鍵酶主要有GDP-巖藻糖激酶、GDP-巖藻糖-1-磷酸鳥苷酰轉移酶(Fkp)。巖藻糖首先在GDP-巖藻糖激酶的作用下轉變成巖藻糖-1-磷酸，然后經過GDP-巖藻糖-1-磷酸鳥苷酰轉移酶(Fkp)的催化轉變為GDP-巖藻糖。

當前GDP-巖藻糖的代謝工程改造主要圍繞合成通路優化、輔因子工程、轉錄因子調控以及GDP-巖藻糖合成宿主篩選等方面(如表2所示)[34]。LEE等[35]在E.coli中對GDP-巖藻糖關鍵酶基因(manB，manC，gmd和wcaG/fcl)過表達，產量相比于表達gmd和wcaG(fcl)的對照株提高了4.4倍，表明在進行GDP-巖藻糖合成通路優化時，相比于僅對限速酶進行過表達，通路多基因的過表達更為有效。此外，GDP-巖藻糖合成酶催化GDP-4-酮6-脫氧-D-甘露糖形成GDP-巖藻糖的過程需要還原力NADPH，而磷酸戊糖途徑和三羧酸循環途徑是兩大產生還原力NADPH的主要途徑；通過過表達葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因(zwf)使得磷酸戊糖途徑得到強化，增強NADPH供應并采用pH穩態的分批發酵控制，最終獲得了235.2 mg/L的GDP-巖藻糖[36]。除此之外，GDP-巖藻糖的合成還受到其他因素影響，其中轉錄因子RcsA就能夠調節GDP-巖藻糖合成途徑的關鍵酶，但是溫度敏感的ATP依賴型蛋白激酶Lon會快速降解RcsA，HUANG等[37]將溫度敏感的ATP依賴型蛋白激酶基因(lon)敲除使得GDP-巖藻糖產量提升，相比于對照株提高了約61%。

表2 GDP-巖藻糖的代謝工程改造策略Table 2 Metabolic engineering transformation strategy of GDP-fucose

GDP-巖藻糖的生產除以大腸桿菌為底盤外，也可以用釀酒酵母、谷氨酸棒桿菌以及乳酸乳球菌等宿主細胞進行生產。釀酒酵母有著優良的GDP-甘露糖代謝池，因此，MATTILA等[38]將大腸桿菌中合成GDP-巖藻糖的2個關鍵基因(gmd，wcaG)克隆到釀酒酵母中，并且獲得了0.2 mg/L的GDP-巖藻糖。而CHIN等[39]通過將大腸桿菌中的manB，manC，gmd和wcaG聯合表達到谷氨酸棒桿菌中獲得了5.5 mg/g細胞干重的GDP-巖藻糖。不過單一菌株發酵產量不能滿足工業化生產，KOIZUMI等[40]利用谷氨酸棒桿菌將鳥苷一磷酸(GMP)轉化為鳥苷三磷酸(GTP)的高轉化特性和過表達GDP-巖藻糖合成途徑中的關鍵基因的重組大腸桿菌聯合來生產GDP-巖藻糖。利用這2種不同的菌株以GMP和甘露糖作為出發底物，在發酵22 h的時候就獲得了高達29 mmol/L(18.4 g/L)的產量，這是目前報道的GDP-巖藻糖的最高產量。LI等[41]用食品安全菌株乳脂乳球菌作為宿主菌株，采用一鍋多酶法將合成GDP-巖藻糖的關鍵基因(manB，manC，gmd和wcaG)克隆到乳脂乳球菌，GDP-巖藻糖產量也達到了0.13 mmol/L(82.3 mg/L)。

當前代謝工程改造主要圍繞提升GDP-巖藻糖目標產量，近期LIU等[42]以L-巖藻糖為直接產物進行代謝工程改造，首先改造大腸桿菌產生巖藻糖基乳糖，再通過表達巖藻糖苷酶從巖藻糖基乳糖中釋放L-巖藻糖，分批補料發酵使L-巖藻糖產量達到16.7 g/L，為發酵法生產L-巖藻糖提供了新思路。

4 L-巖藻糖分離與純化

目前市面上巖藻糖產品大多通過植物源的巖藻多糖水解制備[43]，存在巖藻糖含量低、能耗污染大等缺點。利用發酵法生產富含L-巖藻糖的巖藻多糖，可采用酸水解法進行提取。巖藻多糖發酵液由于混有菌體、蛋白以及雜單糖等雜質組分，核心工藝主要考慮通過酸水解降低聚合度和黏度，過濾、離心以及柱層析等方法除去菌體、蛋白等。如GORI等[44]針對腸桿菌科菌株DSM 22227的巖藻多糖提出了一條提取分離L-巖藻糖工藝。首先利用強酸水解降低料液黏度并通過超濾回收脫去鹽和酸的部分水解多糖溶液；再利用高溫強酸完全水解后使用堿中和溶液，沉淀物CaSO4等通過離心或者過濾去除；最后使用層析色譜或者微生物的方法除去水解液中的其他雜質，使用甲醇或乙醇等有機溶劑結晶從中提取分離L-巖藻糖，最終得到產品收率為75%，純度為98%的結晶樣品。

本實驗室建立了巖藻多糖提取、梯度酸水解及水相結晶的高純度L-巖藻糖分離提取工藝，以實驗室Kosakoniasp.CCTCC M2018092胞外巖藻多糖出發，建立了通過水解巖藻多糖得到高純度L-巖藻糖的提取方法。并對關鍵步驟的最佳操作條件進行初步摸索與研究(圖4)，最終產品結晶L-巖藻糖的純度達到99%以上[45]。

圖4 L-巖藻糖的提取工藝流程初步研究Fig.4 Preliminary study on extraction process of L-fucose

5 總結與展望

L-巖藻糖具有的獨特生理功能，在醫藥、化妝品、食品等領域具有市場開發潛力。近年來，L-巖藻糖在抗癌藥物的靶向研究、延緩皮膚衰老以及特殊人群的營養補充劑等領域研究展現出其特殊的生理活性。最新研究表明，L-巖藻糖還在緩解體內外炎癥反應[46-47]等方面具有良好的活性，并在調節腸道菌群、抵抗病原微生物入侵[48]等臨床研究方面展現出巨大的應用前景。同時，L-巖藻糖是新型食品添加劑巖藻糖基乳糖的關鍵底物，L-巖藻糖的生產成本降低將推動酶法合成巖藻糖基乳糖的低成本生物制造。

采用發酵法生產L-巖藻糖，篩選食品安全型高效合成宿主是未來主要的研究方向。當前代謝工程改造工作目前主要圍繞GDP-巖藻糖合成代謝通路進行，未來可基于新的宿主系統開展GDP-巖藻糖供體的L-巖藻糖合成元件挖掘以及合成路線優化設計。本實驗室以Kosakoniasp.CCTCC M2018092為新的底盤工廠，利用其天然的GDP-巖藻糖高效合成能力，正在建立Kosakoniasp.菌株巖藻多糖、L-巖藻糖及寡糖分子設計等多目標產物生產體系，以期在發酵法生產巖藻糖及衍生物方面取得突破。