實時定量PCR對檢測乳腺癌CK-19及CK5/6的診斷及療效分析

(南通大學(xué)附屬建湖醫(yī)院，南通 224700)

乳腺癌患者早期癥狀不明顯，晚期癌細(xì)胞侵襲周圍正常組織，并向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，損傷多器官功能，造成病變，威脅患者生命[1]。乳腺癌的發(fā)病機制尚不明確，但已經(jīng)證實多種危險因素與其發(fā)病有關(guān)；常見因素有月經(jīng)初潮年齡早(<12歲)、絕經(jīng)年齡晚(>55歲)、不孕及初次生育年齡晚(>30歲)、哺乳時間短、停經(jīng)后進(jìn)行雌激素替代療法等均可增加或延長體內(nèi)雌激素的暴露，與乳腺癌發(fā)病密切相關(guān)[2]。除此之外，與生活習(xí)慣也有一定的關(guān)系，如，肥胖，吸煙，酗酒等，也會增加其患病的概率；乳腺癌一般表現(xiàn)為乳頭溢液等，但多數(shù)患者癥狀并不明顯，容易被忽視。乳腺癌患者中、晚期病情惡化，常伴有厭食，消瘦、貧血等癥狀產(chǎn)生[3]。近年來，乳腺癌的易感基因CK-19(細(xì)胞角蛋白19)及CK5/6(細(xì)胞角蛋白5/6)成為研究的熱點。有關(guān)研究表明CK-19、CK5/6的異常表達(dá)與乳腺癌的產(chǎn)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，另有研究證明RT-PCR技術(shù)對乳腺癌患者的蛋白因子等檢測效果較好[4]。因此本文研究實時定量PCR對檢測乳腺癌CK-19、CK5/6的診斷及療效分析。

1 對象和方法

1.1 研究對象和分組

收集2018年4至2020年4月于我院就診的70例腺癌患者的癌組織及20例乳腺良性病變患者的病變組織，均為女性，最大年齡67歲，最小年齡32歲，抽血前均未接受化學(xué)治療和放射治療，所有患者均經(jīng)手術(shù)治療證實，手術(shù)后均經(jīng)病理診斷，術(shù)前經(jīng)胸部X線、B超、CT及骨掃描等檢查未發(fā)現(xiàn)明顯的轉(zhuǎn)移灶，基本資料見表1。

表1 乳腺癌組、乳腺良性病組臨床資料對比

1.2 實驗試劑與儀器

離心機；Trizol試劑；逆轉(zhuǎn)錄酶；PCR擴增儀；反轉(zhuǎn)錄緩沖液。

1.3 方法

取癌組織及良性病變組織 RNA，分別將組織放在液氮中研磨成粉末后 ，按每 50mg組織加入 1mL Trizol 進(jìn)行裂解。室溫靜置 5min，按照 200μL氯仿71mL Trizol的比例加人氯仿 ，劇烈振蕩 15s，使其充分混合 ，室溫靜置 5min后 ，4℃、12000×g離心 15min。 離心后混合物分為 3相，將上層水相移至另外 1個1.5mL離心管 中按0.5mL異丙醇/1mL Tfizol的比例加入異丙醇 ，充分混勻后室溫靜置10min，然后4℃ 、12000×g離心 10min。RNA在底部和側(cè)面形 成白色的小團沉淀。移去上清。在 1．5mL離心管 中按 1∶1加 入 75% 乙醇 ，來回顛倒混勻后 ，4℃、 10600×g離心 5min，小心棄上清。室溫靜置 10min使RNA沉淀干燥加入DEPC水溶解 ，在波長 260nm處測定核酸濃度 ，波長 280nm處測定蛋白質(zhì)濃度 ，二者比值在1.8～2.1時表示RNA提取成功 ，提取的總RNA置人1.5mL無菌離心管中，離心5min，1250r/min，將dNTP混合物及反轉(zhuǎn)錄緩沖液全部加入逆轉(zhuǎn)錄酶管中配置成反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，混勻，加入探針及PCR緩沖液，配置成PCR反應(yīng)液，定量PCR儀上行PCR擴增(如圖1 所示)，PCR反應(yīng)體系為：模板5.0μL、PCR反應(yīng)液15.0μL、水5.0μL。其中模板為實驗組樣品反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或?qū)φ战M樣品反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。PCR反應(yīng)條件：370C 10min，95℃15min，95℃15s，60℃1min，以β-actin為內(nèi)參，共50循環(huán)，引物序列見表2。

表2 引物序列

圖1 PCR擴增儀

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1檢測CK-19與CK5/6在乳腺癌與乳腺癌良性病變組織中的表達(dá)

采用RT-PCR方法檢測CK-19與CK5/6在乳腺癌患者中與在乳腺良性病變患者中的表達(dá)，并進(jìn)行記錄。

1.4.2檢測CK-19與CK5/6在乳腺癌不同分期中的表達(dá)

采用RT-PCR方法檢測CK-19與CK5/6在乳腺癌不同分期中的表達(dá)，并進(jìn)行記錄。

1.4.3檢測CK-19、CK5/6ROC曲線面積及靈敏度與特異度

繪制ROC曲線，明確靈敏度與特異度，并進(jìn)行記錄。

1.5 統(tǒng)計學(xué)

SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件對乳腺癌組、乳腺癌良性病變組CK-19與CK5/6水平、CK-19與CK5/6在不同乳腺癌分期中的表達(dá)等進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，組間比較采用X2，P<0.05表示差異有意義。

2 結(jié)果

2.1 CK-19與CK5/6在乳腺癌與乳腺癌良性病變組織中的表達(dá)

乳腺良性病變中無CK-19mRNA、CK5/6mRNA表達(dá)，在乳腺癌患者中有26例CK-19mRNA表達(dá)、21例CK5/6mRNA表達(dá)(P<0.05)，見表3。

表3 乳腺癌與乳腺良性病變中CK-19mRNA、CK5/6mRNA的表達(dá)

2.2 CK-19與CK5/6在乳腺癌不同分期中的表達(dá)

在乳腺癌Ⅰ期-Ⅲ期中，Ⅱ期CK-19mRNA、CK5/6mRNA的陽性表達(dá)率最高、Ⅰ期最低，組間比較差距較大(P<0.05)，見表4。

表4 乳腺癌不同分期中CK-19mRNA、CK5/6mRNA的表達(dá)

2.3 CK-19、CK5/6ROC曲線面積及靈敏度與特異度

CK-19的靈敏度、特異度與ROC曲線面積均高于CK5/6靈敏度、特異度與ROC曲線面積，見圖2、表5。

表5 CK-19、CK5/6ROC曲線面積及靈敏度與特異度分析

圖2 CK-19、CK5/6ROC曲線面積及靈敏度與特異度分析

3 結(jié)論

據(jù)相關(guān)疾病研究機構(gòu)調(diào)查顯示，全球范圍乳腺癌發(fā)病率逐年增長，是癌癥中威脅女性生命健康的首要疾病，且有一半以上發(fā)生在發(fā)展中國家[5]。我國每年約有40萬人確診為乳腺癌，隨著年齡的增長，發(fā)病率逐漸增加，乳腺癌一旦發(fā)病，判斷有無轉(zhuǎn)移對于治療和判斷乳腺癌預(yù)后有重要意義[6]。RT-PCR是一種較為敏感和特異的檢測技術(shù)，能在107外周血單個核細(xì)胞中檢出一個癌細(xì)胞，并預(yù)示腫瘤的微小轉(zhuǎn)移。許多學(xué)者利用此技術(shù)檢測乳腺癌患者淋巴結(jié)、骨髓及外周血的微轉(zhuǎn)移。因抽取外周血比抽取骨髓方便，又易被患者所接受，且乳腺癌主要為血行轉(zhuǎn)移，因此，本文研究實時定量PCR對檢測乳腺癌CK-19及CK5/6的診斷及療效分析。

由于目前在實體瘤中尚無特異、明確的腫瘤標(biāo)記物，因此主要采用組織特異mRNA轉(zhuǎn)錄物為標(biāo)記物，不同類型的正常上皮細(xì)胞顯示特定CK標(biāo)記。CK-19在乳腺癌、胃癌、腸癌中有較高的表達(dá)，而不表達(dá)于正常的血組織和淋巴結(jié)，所以是上皮細(xì)胞性腫瘤的較好標(biāo)志物[7]。上皮特異性標(biāo)志物CK5/6，是上皮源性腫瘤細(xì)胞骨架的組成成分，屬于多基因家族之一，其成員超過30種，已有研究證實，CK在間葉組織(骨髓、淋巴結(jié)等 )中無表達(dá) ，而在上皮性腫瘤組織 (乳腺癌 、宮頸癌 、肺癌等 )中有表達(dá)，而CK5/6由于其高度的上皮組織特異性以及乳腺癌細(xì)胞中的廣泛表達(dá)成為檢測乳腺癌患者腫瘤細(xì)胞的一個最常用的指標(biāo)[8]。在本文研究中表明，在乳腺良性病變組中CK-19與CK5/6無表達(dá)，在乳腺癌中陽性表達(dá)較高。在許立生[9]等人對乳腺癌組織的表達(dá)中提出，CK5/6在乳腺癌中的陽性率高于癌旁正常組織，其表達(dá)水平的變化與乳腺癌的浸潤、轉(zhuǎn)移、預(yù)后聯(lián)系密切。在黃建康[10]等對乳腺癌的研究中提出，CK-19的陽性率為30%高于乳腺良性病變患者，這與本文研究中其在乳腺癌組織中的陽性率37%較為接近。

癌細(xì)胞脫離原發(fā)灶，播散至血循環(huán)或淋巴系統(tǒng)，最后進(jìn)入靶器官實質(zhì)，是一個復(fù)雜過程。轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞在循環(huán)系統(tǒng)及靶器官內(nèi)面臨幾種命運：其一是發(fā)生凋亡；其二是處于休眠態(tài)；其三是持續(xù)增殖，腫瘤細(xì)胞脫落、侵襲并入血循環(huán)只是這一過程的最初階段，檢出的癌細(xì)胞并非一定形成轉(zhuǎn)移灶。有關(guān)研究表明，癌細(xì)胞隱性轉(zhuǎn)移會直接影響患者的預(yù)后，因此，準(zhǔn)確的檢出技術(shù)以及腫瘤微轉(zhuǎn)移的特異性標(biāo)志物對乳腺癌的治療至關(guān)重要。實時RT-PCR檢測是現(xiàn)階段敏感度較高的技術(shù)，可檢測mRNA水平的差異，其主要的檢測原理是采用cDNA作為模板進(jìn)行定量擴增，得到大量的目的基因，每種細(xì)胞表達(dá)的基因范圍都有限，因此某些基因的mRNA不是廣泛存在于每個細(xì)胞或組織中，RT-PCR在理論基礎(chǔ)上檢測腫瘤細(xì)胞特異度表達(dá)的基因，從而判斷是否有完整的腫瘤細(xì)胞存在[11]。實時RT-PCR能在106～107個正常體細(xì)胞中檢測出1個腫瘤細(xì)胞，此外，還能檢測出1g組織、1mL體液中1個腫瘤細(xì)胞，因此實時RT-PCR能檢測到早期脫落得游離細(xì)胞，達(dá)到早期預(yù)判的目的[12]。目前已有研究證實CK-19與CK5/6是乳腺癌的標(biāo)志物，其水平的高低與乳腺癌預(yù)后聯(lián)系密切。在本文中CK-19與CK5/6在乳腺癌Ⅰ-Ⅲ期中的陽性率逐漸增加。在任洪偉[13及李江濤[14]等運用實時RT-PCR檢測技術(shù)對乳腺癌的研究中提出，CK-19與CK5/6水平的表達(dá)與乳腺癌預(yù)后、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，且隨著乳腺癌的分期增加其陽性率逐漸增加。本文研究結(jié)果與上述醫(yī)學(xué)者研究結(jié)果相似，且在本文中兩指標(biāo)的特異度均為100%也可證實其對乳腺癌診斷的重要性。

綜上所述，實時定量RT-PCR對CK-19與CK5/6的表達(dá)進(jìn)行檢測可判斷乳腺癌的轉(zhuǎn)移，且具有一定的診斷價值，值得臨床推廣使用。