青牛膽莖節組織培養關鍵技術研究

張瀟月，溫朝平，周 宇，董凱密，陳 華，王仁睿，侯大斌，楊玉霞，余 馬

（1.西南科技大學生命科學與工程學院，四川 綿陽 621010；2.四川省中醫藥科學院中藥材品質及創新中藥研究四川省重點實驗室，成都 610041）

青牛膽（Tinospora sagittata）為防己科青牛膽屬草質藤本植物，主要分布于湖北西部和西南部、陜西南部、四川東部至西南部、西藏東南部、湖南、江西等地［1］，其塊根名為金果欖，是常用中藥，含有生物堿、萜類、甾醇類等活性成分［2］，主要用于治療咽喉腫痛、癰疽疔毒、痢疾等疾?。?］。由于國家對中醫藥行業的大力支持，市場對金果欖的需求量急劇增加，使得青牛膽野生資源被無序采挖，趨于短缺。為了解決這一問題，人工栽培青牛膽是實現該藥材可持續發展的重要途徑。

組織培養技術具有繁殖系數高、品種遺傳穩定性高、不受季節和自然條件限制等優點，可實現種苗的大批量生產［4］。目前針對青牛膽的組織培養報道較少，劉艷等［5］建立了青牛膽的組培快繁體系，確定了消毒時間、嫩莖和嫩葉愈傷組織的誘導培養基、腋芽的誘導培養基和生根培養基。本課題組以劉艷等［5］報道的快繁體系為參考，建立青牛膽的組織快繁體系，前期試驗發現莖段不同節間的出芽率存在較大差異，且在繼代培養時存在叢生芽長勢較弱、葉色較淺的情況。因此，本研究以青牛膽莖段為材料，篩選腋芽最佳誘導培養基，研究不同節間對腋芽誘導的影響及不同培養基對壯苗的作用，以期為青牛膽的規?；a提供技術支持，對青牛膽優質種苗的工廠化生產具有重要的實踐意義。

1 材料與方法

1.1 材料

青牛膽采自四川峨眉山，引種于西南科技大學生命科學與工程學院龍山實驗基地溫室中栽培，選取青牛膽生長狀態一致的莖段為材料。

1.2 方法

1.2.1 外植體消毒 將青牛膽枝條根據莖節所在部位不同進行編號，頂端的莖段標記為①號，以下的帶芽莖節依次標記為②～⑥（圖1a）。將莖段分別剪成1.0～1.5 cm長帶1個節的莖段（圖1b），按照不同編號進行收集。去除葉片，用飽和洗衣粉溶液浸泡10min，流水沖凈，75%乙醇浸泡30 s，無菌水沖洗2次，0.1%升汞溶液+1～2滴吐溫-20振蕩消毒7 min，無菌水沖洗4次，無菌濾紙吸干多余的水分備用。

1.2.2 莖段不同節間的腋芽誘導 切去莖段兩端與升汞溶液接觸的部分，將莖段依次接種于MS+0.2mg/L 6-BA+0.5 mg/LKT+0.2 mg/L NAA+0.5 mg/L GA3啟動培養基［5］培養4周。培養基中添加蔗糖30 g/L，瓊脂7 g/L，pH為5.8，培養溫度為（24±2）℃，光照強度為1 800 lx，光照時間為12 h/d。

1.2.3 增殖培養 將誘導出的腋芽（＞0.5 cm）切下，接種于新鮮的MS+0.2 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+0.2mg/L NAA+0.5 mg/L GA3培養基上進行增殖培養4周，培養環境同上。

1.2.4 壯苗試驗 將增殖后較弱的叢生芽分成單株，挑選高度一致的苗接種于MS和MS+10 mL/L乙二胺四乙酸鐵鈉（EDTA-Fe）2種培養基上進行壯苗培養4周，培養環境同上。

1.2.5 生根培養 將壯苗后的植株轉至1/2 MS+0.5mg/L IBA+0.5 mg/L NAA［5］進行生根培養6周，培養環境同上。

1.2.6 移栽煉苗 待生根完成后，逐漸打開瓶口，使生根苗逐漸適應外界環境，煉苗1周后，取出小苗，洗凈根部的培養基，用0.5%多菌靈溶液浸泡小苗根部10 min，清洗晾干后，移至滅過菌的珍珠巖+園土（1∶1）基質中培養，相對濕度70%～80%，加強通風，1個月后統計成活率。

1.3 試驗設計與數據調查

每個處理接種10個外植體，重復3次，莖段不同節間的腋芽誘導試驗于培養4周時統計誘導率和＞0.5 cm的腋芽數量，壯苗試驗培養4周時統計平均株高和葉色情況。采用SPSS 17.0軟件進行顯著性分析。

誘導率=（萌芽的外植體數量/接種外植體總數）×100%。

褐化率=（褐化的外植體數量/接種外植體總數）×100%。

2 結果與分析

2.1 莖段不同節間對腋芽誘導的影響

在誘導培養基上培養3 d后可觀察到腋芽開始萌動（圖1c），培養4周后莖段不同節間在同一種誘導培養基上對腋芽的誘導情況存在很大差異，隨著①號莖節至⑦號莖節位置的變化，腋芽的誘導率和＞0.5 cm的腋芽數量逐漸降低，褐化率逐漸增高。①號莖節的誘導率為93.3%，顯著高于其他部位，褐化率為13.3%，＞0.5 cm的腋芽數量為6.7個，除了與②號莖節的褐化率和腋芽數量差異不顯著外，顯著優于其他部位。⑥和⑦號莖節的誘導率分別為26.7%和20.0%，顯著低于其他部位，褐化率達50.0%、63.3%，＞0.5 cm的腋芽數量分別為2.3、2.0個（表1）。

表1 不同莖節對腋芽的影響

2.2 不同培養基對壯苗效果的影響

鐵鹽對青牛膽組培苗的壯苗效果起著關鍵作用，在壯苗培養基里生長4周后，生長在MS+10 mL/L EDTA培養基的組培苗平均苗高為4.1 cm（圖2），平均葉片數量為6.5片，葉色濃綠（圖1d）。生長在MS培養基的組培苗平均苗高和平均葉片數量均顯著低于前者，分別為2.8 cm和3.3片，葉色較淡（圖1d）。

圖2 不同壯苗培養基對平均苗高和葉片數量的影響

3 討論

目前青牛膽的組織培養相關研究很少，已報道的青牛膽［5］和青牛膽屬部分植物如寬筋藤［6］、心葉青牛膽［7］建立的快繁體系并未研究不同莖節對腋芽誘導的影響。本研究在劉艷等［5］建立的組培快繁體系基礎上，著重研究不同莖節對腋芽誘導的差異，并證明培養基中添加10 mL/L的EDTA-Fe是有效的壯苗方式，解決了青牛膽增殖叢生芽孱弱的問題，有效地提高了種苗的質量。①號莖節的誘導率和＞0.5 cm的腋芽數量分別達93.3%和6.7個，顯著高于其他莖節，隨著莖節位置的變化，誘導率和＞0.5 cm腋芽數量顯著降低，褐化率升高，證明莖節的幼嫩程度對腋芽誘導的影響較大，木質化程度越高的莖節越容易褐化。在實際生產中，為了增大外植體的數量，并保證較高的誘導率，可以使用①～⑤號莖節作為外植體，平均誘導率為67.3%，平均褐化率為32.7%，＞0.5 cm的平均腋芽數量為4.5個。⑥、⑦號莖節木質化程度高，平均誘導率為23.4%，平均褐化率達56.7%，不適合選作外植體。

莖節作為外植體進行腋芽誘導已在多種藥用植物上有所應用，如燈油藤（Celastrus paniculatus）［8］、白花莧（Aerva sanguinolenta）［9］、穿心蓮（Andrographis paniculata）［10］、短蕊萬壽竹（Disporum cantoniense）［11］、公石松［12］等。據研究，不同位置的莖節對腋芽誘導的效率不同。Gitonga等［13］報道澳洲堅果靠近頂端的1～3號莖節對腋芽的誘導效果優于靠近基部的4～6節；Shirdel等［14］報道玫瑰基部莖節的腋芽萌發率最高，為30%，腋芽長度為5.75 cm，中間莖節的腋芽萌發率最低，為17.4%，腋芽長度為2.8 cm。以上研究說明不同植物不同位置的莖節對腋芽的誘導情況不同。劉艷等［5］報道的青牛膽腋芽誘導率為45%，應是多個位置的節間混合而得的平均誘導率。本研究結果表明，①號莖節腋芽誘導率最高，隨著位置向下變化，腋芽誘導率逐漸降低，由此可見，篩選節間位置可有目的地進行取樣，并有效提高腋芽誘導率。

褐化容易造成植物死亡，是組織培養過程中一個重要的問題，這主要與植物體酚類化合物的含量有關，當植物體表面形成傷口，酚類化合物氧化，形成黑色或褐色螯合物，導致植物部分變暗［15，16］。不同位置的莖節在組織培養過程中褐化程度不同，這是因為多酚類化合物在木質化程度高的組織中合成較多，在木質化程度低的幼嫩組織中合成較少［17］。石榴頂端莖節（1.5 cm）在組培過程中褐化程度最輕，基部莖節褐化程度最重［18］，這與本研究結果一致，青牛膽①、②號莖節的褐化率為20%以下，③～⑦號莖節的褐化率增至40%以上。由此可見，在外植體的選擇上，選擇幼嫩、褐化程度較輕的莖節可極大地降低褐化率，提高成活率。

植物種苗經增殖階段后，容易出現叢生芽孱弱的現象，影響生根和后期移栽效果，為了使種苗健壯，需要在增殖之后進行壯苗培養。據報道，在壯苗培養階段，在培養基中添加一些物質如GA3［19］、VB1［20］、蛋白胨［20，21］、水解酪蛋白［22］等，可有效提高種苗的生長勢，另有研究表明種苗在含高濃度的細胞分裂素上生長后適當降低或去除細胞分裂素，對壯苗有一定的促進作用［4］。常立國等［23］將馬鈴薯弱苗放置于不含激素的3MS上生長，壯苗效果最佳，莖稈粗壯、葉片多、葉面積大。本研究使用了不添加激素的MS培養基和MS+EDTA-Fe 2種培養基，MS培養基對壯苗有一定的效果，但MS+EDTA-Fe培養基壯苗效果更優。于艷等［24］在建立多年生麻櫟組培體系過程中，初代培養基、繼代培養基和生根培養基中均使用2倍鐵鹽，有效提高了多年生麻櫟莖段的不定芽誘導率和再生植株成活率；Papathanasiou等［25］報道將培養基中的可溶性鐵濃度降低后，馬鈴薯種苗在隨后的培養中出現枯黃的現象，這些報道均說明了鐵鹽對于組培苗尤其是葉片生長具有重要的促進作用。本研究在MS培養基中另外增加了10 mL/L EDTA-Fe后，種苗生長健壯，葉色濃綠，證明該濃度的鐵鹽適合青牛膽種苗生長。

研究了不同節間對腋芽誘導的影響，確定了適合用作外植體的具體節間位置，并篩選了壯苗培養基，該組織培養體系可為青牛膽的工廠化生產提供技術指導。