膠質母細胞瘤組織Asporin表達變化及其與患者替莫唑胺耐藥、預后的關系

鄭向榮，楊洪安，丁鋒

山東第一醫科大學附屬省立醫院神經外科，濟南250021

膠質細胞瘤是一種常見的顱內原發性腫瘤，占所有顱內腫瘤的50%以上，世界衛生組織（WHO）根據其惡性程度及病理特征分為Ⅰ～Ⅳ級［1］。膠質母細胞瘤（GBM）是最常見、侵襲性最強、預后最差的中樞神經系統腫瘤，屬于Ⅳ級膠質瘤，即使采取手術切除+放化療的傳統綜合治療策略，中位生存期仍然不到18個月，3年生存率<10%［2-3］。目前，分子靶向治療是腫瘤治療研究領域中的熱點，而分子治療靶點的選擇是基礎和關鍵。牙周韌帶相關蛋白-1（Asporin）在骨與軟骨疾病進展中發揮重要作用，近年研究證實其能促進多種腫瘤的惡性進展，但在膠質瘤中的研究鮮有報道。本研究觀察了Asporin在GBM組織中的表達變化，并分析其與GBM患者替莫唑胺（TMZ）耐藥和預后之間的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2012年10月—2015年10月山東第一醫科大學附屬省立醫院神經外科收治并經術后病理確診的GBM患者40例，男18例，女22例；年齡（52.3±10.1）歲；膠質纖維酸性蛋白（GFAP）陽性23例（57.5%），陰性17例（42.5%）；少突膠質細胞轉錄因子-2（Olig-2）陽性16例（40.0%），陰性24例（60.0%）；P53陽性21例（52.5%），陰性19例（47.5%）；IDH1陽性13例（32.5%），陰性27例（67.5%）。另選10例高血壓腦出血患者，男5例，女5例；年齡（49.5±9.3）歲。手術留取GBM患者和高血壓腦出血患者（為減輕顱內壓所切除的正常大腦組織）腦組織標本。本研究均經患者知情同意并簽署知情同意書，且通過了山東第一醫科大學附屬省立醫院倫理委員會的評議。

1.2 主要試劑及儀器 Asporin抗體（Abcom公司，美國）；GAPDH抗體（中杉金橋公司，中國）；免疫組化試劑盒、蘇木素、檸檬酸鹽修復液、磷酸鹽緩沖液（PBS）、中性樹膠、DAB試劑盒（中杉金橋公司，中國）；一抗稀釋液（北京索萊寶公司，中國）；RIPA裂解液、PMSF、5×蛋白上樣緩沖液、1.5 mmol/L Tris-HCl（pH 8.8）、10%SDS、30%Acr-bis、過 硫 酸 銨（APS）、1 mmol/L Tris-HCL（pH 6.8，碧云天公司，中國）；蛋白Marker、BCA蛋白定量試劑盒（Thermo Fisher Scientific公司，美國）；脫脂奶粉（內蒙古伊利公司，中國）；山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG（中杉金橋公司，中國）。ECL發光液、PVDF膜（Millipore公司，美國）；顯影液、定影液（樂凱膠片公司，中國）；膠片（柯達公司，美國）。

1.3 腦組織Asporin蛋白檢測 ①Western blotting法：提取GBM組織和正常腦組織的總蛋白，采用BCA蛋白定量分析試劑盒檢測蛋白濃度，蛋白變性后每個上樣標本采用40μg總蛋白，進行電泳分離，電轉至PVDF膜后5%脫脂奶粉封閉，Asporin（1∶1 000）及GAPDH（1∶1 000）抗體4℃孵育過夜，次日洗膜后行二抗孵育，TBST洗膜后暗室曝光，采圖。用Image J軟件測量譜帶的光密度，以GAPDH為內參，計算目的蛋白的相對表達量。②免疫組化染色法：對GBM組織和正常腦組織標本進行Asporin免疫組化染色，明確Asporin在正常腦組織和GBM標本組織中的表達情況。實驗方法簡述如下：切片、烤片、脫蠟并水化，高壓抗原修復，山羊血清封閉，抗體孵育，DAB顯色，蘇木素復染，樹膠封片，免疫組化結果評分。染色評分根據陽性細胞比例得分和染色深度得分相乘得到［13］，沒有陽性染色計0分，1%～10%陽性細胞或淺黃色染色記1分，11%～50%陽性細胞或深黃色染色記2分，51～75%陽性細胞或棕色染色記3分，>75%陽性細胞或深棕色染色記4分；總分≤4為低表達，總分≥6為高表達。

1.4 Asporin表達與GBM患者TMZ耐藥關系分析 17例GBM患者進行了基因檢測，O6-甲基鳥嘌呤-DNA-甲基轉移酶（MGMT）啟動子甲基化提示對TMZ敏感，MGMT啟動子未甲基化提示對TMZ耐藥。針對這17例患者行Asporin高低表達分組，通過χ2檢驗進行耐藥性分析。

1.5 Asporin表達與GBM患者預后關系分析 依據免疫組化染色得分將Asporin表達分為高、低表達組，總分≤4為低表達組，總分≥6為高表達組。然后采用Kaplan-Meier法比較Asporin高表達組、低表達組患者預后情況。

1.6 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件。計量資料以±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數資料比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各腦組織Asporin表達比較 GBM組織、正常腦組織Asporin相對表達量分別為1.90±1.20、0.34±0.20，免疫組化染色得分分別為（8.01±4.38）、（2.00±1.15）分，兩者比較，P均<0.05。Asporin在各腦組織中的表達情況見圖1。

圖1 Asporin在各腦組織中的免疫組化染色圖像

2.2 Asporin表達與GBM患者TMZ耐藥的關系 17例GBM患者中12例患者MGMT啟動子未甲基化（對TMZ耐藥），5例患者MGMT啟動子甲基化（對TMZ敏感），耐藥者、敏感者Asporin相對表達量分別為3.07±0.61、1.04±0.18，兩者比較，P<0.05。17例GBM患者根據免疫組化染色評分分為Asporin高表達者（13例）、Asporin低表達者（4例），對TMZ耐藥例數分別為10、2例，兩者比較，P<0.05。

2.3 Asporin表達與GBM患者預后的關系 30例GBM患者根據Asporin染色評分分為高表達者（27例）、低表達者（13例），中位生存期分別為（12.0±0.7）、（23.0±3.9）個月，兩者比較，P<0.05。

3 討論

GBM是顱內最常見、侵襲性最強、惡性程度最高的原發性腫瘤，呈浸潤性、侵襲性生長，即使術中采取擴大切除的手段，往往也無法完全切除腫瘤，況且腦組織功能的重要性決定了大多數膠質瘤僅能進行極其有限的擴大切除，還有相當數量的膠質瘤侵犯了丘腦或腦干等重要部位，僅能切除部分腫瘤甚至無法手術治療［3-4］。TMZ是臨床治療GBM的標準一線化療藥，主要攻擊腫瘤細胞DNA，可引起DNA上MGMT發生甲基化，進而導致DNA交聯、斷裂，產生細胞凋亡，然而由于多數患者在化療過程中極易對TMZ化療產生耐藥，因此目前臨床上亟需尋找新的GBM治療靶點［5］。

Asporin是一種細胞外基質蛋白，最初研究發現其在多種骨關節疾病中發揮重要作用。近年來，Asporin在腫瘤中的作用開始受到重視。多項研究證實，Asporin在多種腫瘤及腫瘤相關性纖維母細胞（CAFs）中呈高表達，并通過自分泌或旁分泌方式促進腫瘤的惡性發展［6-8］。SATOYOSHI等［6］發現，CAFs分泌的Asporin能通過活化CD44-Rac1信號軸增加胃癌細胞和CAFs自身的侵襲能力。研究發現，Asporin在胰腺癌細胞和間質中均呈高表達，其可通過自分泌和旁分泌兩種方式與胰腺癌細胞表面的CD44受體結合，激活AKT和ERK通路促進胰腺癌的侵襲和遷移［7］。上述研究表明，Asporin往往通過與CD44受體結合發揮生物學作用進而促進腫瘤的惡性進展。然而，Asporin在膠質瘤中的表達及生物學功能目前尚無研究報道。本研究發現，Asporin在正常大腦組織中不表達，而在GBM組織中普遍呈中高表達，因此我們初步推測，Asporin有可能在GBM中發揮著重要的生物學功能，而后續的研究也進一步驗證了我們的推測。

MGMT是一種DNA修復酶，可通過轉移TMZ造成的DNA甲基化，避免TMZ導致的DNA發生交聯、斷裂，從而參與GBM對TMZ的耐藥，同時自身不可逆的失活，即“自殺式”修復機制［9］。研究［10-11］表明，MGMT啟動子甲基化的患者與未甲基化的患者相比能從TMZ化療中獲得的更好的治療效果，前者的中位生存期為21.7個月，而后者中位生存期僅為12.7個月，因此MGMT是目前臨床上預測TMZ是否耐藥的關鍵分子。本研究收集的40例GBM患者中17例患者曾行MGMT基因檢測，其中12例患者MGMT啟動子未甲基化，5例患者MGMT啟動子甲基化，Asporin在TMZ耐藥GBM患者中表達水平更高，且Asporin高表達與MGMT非甲基化間存在明顯的相關性，提示Asporin可能參與了GBM患者對TMZ耐藥生物學過程，但具體機制目前尚不清楚，有待進一步研究。進一步分析Asporin表達水平與GBM患者預后之間的關系，我們發現Asporin表達水平越高，GBM患者預后越差。文獻［12］報道，CD44在GBM生長、復發和耐藥中起重要作用，檢測CD44表達水平可預測GBM的復發和耐藥。臨床上多數GBM患者在化療過程中會對TMZ產生耐藥，GBM患者術后中位生存期不到18個月，因此TMZ耐藥是臨床上亟待解決的問題，已成為近年來膠質瘤領域的研究熱點［13-15］。目前研究初步發現，信號通路異常、非編碼RNA、DNA損傷修復機制、腫瘤微環境、信號通路異常、膠質瘤干細胞學說、腫瘤細胞自噬等參與了替莫唑胺耐藥，但參與調控TMZ耐藥的具體機制尚未完全闡明，結合前期結果及相關文獻報道，我們推測Asporin可能通過CD44促進替莫唑胺耐藥，進而影響了GBM患者的預后，但具體機制有待進一步研究［16］。而進一步闡述TMZ的耐藥分子機制有助于提高TMZ對GBM患者的治療效果，為克服TMZ耐藥提供新的理論依據。

總之，GBM組織Asporin的表達升高，Asporin表達水平越高，對TMZ耐藥者越多，患者預后越差。