細菌對抗生素與重金屬的聯合抗性機制研究進展*

戎玲玲 王復標 吳禮貴 馮關萍 肖小雨 鄒小明

(井岡山大學生命科學學院，江西 吉安 343009)

環境中的生物已經不可避免地面臨著污染物的聯合影響[1-2]。抗生素和重金屬是兩類典型的環境污染物。環境中的抗生素主要來源于醫療、農牧養殖及工業生產等；環境中的重金屬主要來源于農牧養殖、工農業生產及礦山開采等。抗生素和重金屬在環境中都具有持久性特征[3-4]，因此環境中的抗生素和重金屬聯合污染狀況日益嚴峻[5]。

研究表明，當細菌受到抗生素或重金屬脅迫時會誘導產生抗生素抗性基因(ARGs)或重金屬抗性基因(HRGs)。KNAPP等[6]研究發現，農田土壤中銅污染可誘導細菌產生tetM、tetW、blaOXA、ermB、ermF、copA、pcoB等抗性基因；ALONSO等[7]臨床研究分離到的嗜麥芽寡養單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)中發現含有mphB、cadA等抗性基因及cadA的轉錄調控基因cadC。細菌中的ARGs和HRGs可通過水平轉移、基因重組等方式進行傳播、擴散[8]。因此，ARGs和HRGs已被普遍視為新型環境污染物，而且ARGs已被世界衛生組織(WHO)視為21 世紀威脅人類健康的最重大挑戰之一[9]。

細菌中的可移動遺傳元件(MGEs)是ARGs和HRGs進行水平轉移的主要載體，能促進基因重組[10]，促使ARGs和HRGs在不斷重組、水平轉移過程中形成聯合抗性[11]。ENNE等[12]研究發現，單獨降低磺胺類抗生素含量并不能有效控制磺胺類ARGs的豐度，原因是磺胺類ARGs與汞抗性基因位于同一MGE上，存在協同抗性，磺胺類ARGs的豐度同時受汞含量的影響。此外，交叉抗性、協同調控抗性和生物被膜抗性也是抗生素和重金屬的聯合抗性機制[13]。因此，本研究在歸納總結細菌中ARGs和HRGs來源的基礎上，綜述了協同抗性、交叉抗性、協同調控抗性和生物被膜抗性4種聯合抗性機制。

1 細菌中ARGs和HRGs的來源

具有聯合抗性機制的細菌常稱為多抗細菌，在環境中廣泛分布，其攜帶的ARGs和HRGs可通過多抗細菌自身繁殖進行垂直傳播，也可通過細菌間的轉導、結合等途徑水平轉移。細菌的抗性可分為內在固有抗性和外源獲得抗性。

1.1 內在固有抗性

細菌的內在固有抗性是指存在于細菌基因組上的抗性基因原型、準抗性基因或未表達的抗性基因產生的抗性[14-15]，是細菌與生俱來的，有種屬特異性[16]。環境中的抗生素可以作為細菌種群間或種群內的信號分子，激活細菌的內在固有ARGs，使其產生抗性表達，這是ARGs潛在的產生源[17]。隨著多種細菌基因組和環境宏基因組測序技術的發展，科學家發現環境中存在著大量潛在ARGs及與抗性基因水平轉移相關的MGEs[18]。

同樣，作為細菌生長所需的微量元素的重金屬也會激活菌體內固有的HRGs，使其表現重金屬耐受性[19]。在高濃度重金屬環境下(如火山噴發口)生存的細菌，通常具有HRGs。PAL等[20]就在火山噴發口檢測到細菌中含有HRGs。科學家通過分析多年凍土和深層地下水發現，古細菌中銅和汞的古老抗性基因保守DNA序列與現代銅和汞的抗性基因相似度在95%以上[21-22]。

1.2 外源獲得抗性

外源獲得抗性是指細菌通過基因變異、獲取新的基因等途徑而獲得的抗性。外源ARGs和HRGs主要通過質粒、整合子和轉座子等MGEs在細菌間進行轉移，少部分以結合、轉化或轉導的方式完成轉移[23]。獲得新的抗性基因的細菌形成了變種，獲得的新抗性又成為了該變種細菌的內在固有抗性。

多抗細菌最初是在人體內發現的，它們隨糞便排出體外，進入環境，從而將攜帶的抗性基因通過水平轉移傳播到環境中的細菌里[24]。污水處理廠產生的污泥中含大量抗生素和重金屬的抗性細菌，排放后，各類抗性基因就進入了環境中[25]。水產養殖場常有ARGs和HRGs檢出，有研究發現四環素類的抗性基因tetE與銅的抗性基因cueR位于同一質粒上[26]。畜牧養殖業由于常用重金屬作為添加劑或用抗生素防治畜牧病患，造成動物體內耐藥細菌的產生，這些耐藥細菌及其攜帶的ARGs和HRGs隨排泄物進入環境[27]。在我國的養豬場附近土壤中，四環素類、磺胺類ARGs和銅HRGs檢出率較高，施用豬糞的農田土壤相比未施用豬糞的農田土壤檢出更高水平的ARGs和HRGs[28-29]。由此可見，細菌通過抗生素或重金屬誘導獲得ARGs和HRGs而具有外源獲得抗性已是普遍存在的現象。

2 抗生素與重金屬聯合抗性機制

2.1 協同抗性機制

協同抗性機制一般是指細菌中的多種特定抗性基因空間上位于同一個MGEs上，如同一個質粒、轉座子或整合子上[30]，通常涉及汞、銅、銀、砷、鎘等HRGs和磺胺類、四環素類、大環內酯類等ARGs[31]。

具有協同抗性機制的ARGs和HRGs除位于同一個MGEs外，也有在其他地方發現的。LIMA等[32]研究發現，在傷寒沙門氏菌(SalmonellaTyphi)中還在SGI11基因組島上同樣共存著ARGs(blaTEM-1、catA1、strA、strB、sul1、sul2、dfrA7)和HRGs(merE、merD、merA、merC、merP、merT、merR)。MGEs或基因組島對ARGs和HRGs的水平轉移起著重要作用，它們的歸趨必將影響抗性基因的環境效應，但目前研究多聚焦于抗性基因種類和數量，對抗性基因的環境歸趨研究還甚少。表1總結了一些常見細菌中具有協同抗性的ARGs和HRGs。

表1 常見細菌中具有協同抗性的ARGs和HRGs

2.2 交叉抗性機制

交叉抗性機制一般是指細菌中某一代謝系統對不同的污染物(抗生素或重金屬)同時產生抗性的機制，即不同的污染物攻擊同一靶點而啟動細胞的共同通路，使之對不同污染物同時具有抗性，如外排泵系統(又稱射流系統)[36]，其原理是降低細胞內污染物的濃度，減少累積[37]。外排泵是一種轉運蛋白，可分為7個家族：(1)三磷酸腺苷(ATP)結合盒(ABC)超家族；(2)抗性結節分化(RND)超家族；(3)易化(MFS)超家族；(4)多藥及毒性化合物外排(MATE)家族；(5)小多耐藥抗性(SMR)家族；(6)蛋白細菌抗菌化合物外排(PACE)家族；(7)p-氨基苯甲酰-谷氨酸鹽轉運蛋白(AbgT)家族。除ABC超家族是一類直接利用ATP水解能的主動轉運蛋白外，其他6個家族均是利用離子電化學膜梯度為能源的次級主動轉運蛋白[38]，各類外排泵家族的蛋白結構特征及針對性底物見表2。

表2 各類外排泵家族的蛋白結構特征及針對性底物

目前，外排泵系統是抗生素和重金屬交叉抗性機制的主要表現形式，研究發現的外排泵系統種類及蛋白數量也在不斷增加，但外排泵系統之外的交叉抗性機制研究還非常有限。

2.3 協同調控抗性機制

協同調控抗性機制是指在某種抗生素或重金屬協迫下，細菌通過一系列轉錄、翻譯、應答等信號轉導系統對外源刺激做出調控的抗性機制[75]。其中，由膜定位的感應激酶或組氨酸激酶(HK)和胞質中的反應調節子(RR)組成雙組分調控系統(TCS)是細菌中存在最廣泛的協同調控抗性機制[76]。

環境中抗生素或重金屬污染都能觸發細菌中的協同調控抗性機制，兩者均不但可以增強細菌抗性，而且還可以使其ARGs和HRGs表達上調。在革蘭氏陽性細菌中，萬古霉素抗性由VanRS TCS調控，VanS感應激酶對胞外糖肽類抗生素做出應答，將磷酸基團傳遞給VanR調節蛋白，活化的VanR調節蛋白可以與DNA結合進而激活染色體上相應的vanH、vanA、vanX等抗性基因[77]。POOLE等[78]研究發現，鋅可以激發銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的鋅抗性，還可以提高菌株對氨基糖苷類抗生素的抗性，究其原因是鋅可以激活AmgRS TCS上調表達氨基糖苷類抗生素的mexXY外排泵操縱子。KREAMER等[79]研究發現，BqsRS TCS可以調控銅綠假單胞菌對鐵和氨基糖苷類抗生素的抗性，BqsS感應激酶通過RExxE基序感知Fe2+濃度變化，將磷酸信號傳遞給BqsR調節蛋白，BqsR調節蛋白通過結合一連串DNA序列激活轉錄系統使相關ARGs和HRGs表達上調。除外源重金屬或抗生素外，細菌胞內某些生長所需組分濃度升高也可能會激發TCS的調控作用。LIU等[80]研究發現，在嗜麥芽寡養單胞菌中，調控多黏菌素B、氯霉素、氨芐青霉素、慶大霉素等氨基糖苷類ARGs的PhoPQ TCS受胞內高濃度Mg2+的影響，使SmeZ外排泵表達上調，與此同時，細菌對該SmeZ外排泵調控的重金屬和抗生素抗性增加。具有同源性的TCS在接受相同重金屬刺激時還會作出不同的反應。LIU等[81]研究發現，調控czcCBA外排泵的czcRSs TCS包含czcRS1和czcRS2，前者的轉錄受Cd2+的抑制，而后者的轉錄卻被Cd2+促進。由此可見，細菌的協同調控抗性機制依賴于一系列復雜的信號轉導和相關基因的轉錄、翻譯等過程，是菌體內在固有抗性和外源獲得抗性間轉化的橋梁。

2.4 生物被膜抗性機制

生物被膜抗性機制是在一類包裹于細菌胞外的具有膠黏性的以多聚糖為主的多聚物基質(EPS)及其周邊沉淀的有機物和無機物保護下，使細菌菌體更好地適應環境，從而增強對外源有毒物質的抵抗機制[82]，主要包括膜滲透屏障作用和細菌群體感應效應(QS)[83]。

重金屬和抗生素可誘導某些致病細菌產生生物被膜，這是臨床頑固性細菌不易治療的主要原因之一，因此病原細菌生物被膜被認為是醫學和健康領域的一大隱患。SAKIMURA等[84]研究發現，表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)在與不銹鋼(含有鉻、鎳重金屬)接觸后會形成生物被膜，使其對萬古霉素形成抗性，且其抗性在生物被膜形成的4～8 h內達到最強。GAIDHANI等[85]研究發現，對4種抗生素(慶大霉素、妥布霉素、多黏菌素B、利福平)和2種重金屬鹽(AgNO3、HgCl2)敏感的溶血不動桿菌(Acinetobacterhaemolyticus)，在誘導其形成生物被膜后，就對它們產生了抗性，且隨生物被膜的增長，抗性越強。此外，細菌對抗生素和重金屬的抗性還與其生物被膜形成的時期有關。HALL等[86]研究發現，銅綠假單胞菌由浮游細胞進入靜止期時，其生物被膜中的ndvB基因受RpoS因子的調控上調表達，從而在增加細菌菌體膜密度的同時增強了其對外源有毒物質的抗性。不同來源的同種屬病原細菌形成的生物被膜成分及抗性有很大差異。VITALE等[87]通過比較分析人源性和動物源性的金黃色釀膿葡萄球菌(Staphylococcusaureus)發現，前者的生物被膜相關基因表達水平更高，對青霉素類抗生素抗性也更強，表明病原細菌生物被膜的產生已對人類臨床疾病治療造成了極大挑戰。

2.5 4種抗性機制的比較

細菌中協同抗性、交叉抗性、協同調控抗性和生物被膜抗性4種抗生素與重金屬聯合抗性機制均能使細菌同時對某些抗生素和重金屬產生抗性，但彼此間又有不同。協同抗性機制是在空間上將ARGs和HRGs耦合在同一個DNA位置上，當細菌受相應抗生素或重金屬刺激時，ARGs和HRGs同時表達產生聯合抗性。交叉抗性機制則是在生理水平上將細菌的抗生素和重金屬抗性耦合，主要以ATP水解能或離子電化學膜梯度為動力將有毒物質排出體外，當抗生素和重金屬同時作為底物時，二者外排的共同通路被啟動而產生聯合抗性。協同調控抗性機制涉及細菌胞內復雜的信號轉導和相關基因的轉錄、翻譯調控過程，從細菌整體上進行抗性協調。生物被膜抗性機制更注重對菌體自身的保護，生物被膜的形成可以對環境中有毒物質起屏障作用，使細菌菌體免受毒害。在實際中，細菌的這4種聯合抗性機制是相互交聯、相互融合的。

3 研究展望

目前，對4種抗生素與重金屬聯合抗性機制的研究還停留在分析抗性基因的種類、數量、傳播速率和細菌群落結構的變化上，在以后的研究中還需加強以下方面：

(1) MGEs的歸趨研究。許多抗性基因常與MGEs相關聯，而MGEs又是抗性基因在菌落間傳播、擴散的關鍵因子，它對環境和人類生活的潛在危害更大。因此，開展MGEs在不同環境中遷移規律及環境歸趨研究，將為抗性基因的削減和環境生態健康的評估提供更有力的理論依據。

(2) 生物信息學的應用。環境中抗性基因無處不在，許多未知的抗性基因仍有待人們去探索發現。根據目前已有的抗性基因數據庫，結合宏基因組測序技術，可以采用生物信息學分析法去發現并解析更多抗性基因或抗性機制。如交叉抗性機制涉及很多膜泵蛋白，可通過生物信息學分析DNA序列或氨基酸序列同源性，并驗證功能，不斷發現新的抗性蛋白及抗性機制，從而提高人類對致病細菌抗性上的認知，加速新型抗菌藥物的研發進程。

(3) 數學模型的應用。自然環境污染狀況日趨復雜，除抗生素、重金屬的單一或聯合污染外，其他影響因素如光照、氧氣、溫度、pH、溶解氧、氮磷含量、菌群結構等也對抗性或抗性基因的形成、傳播起著重要作用。建立并應用數學模型研究環境中細菌在復雜的環境因子影響下，抗生素和重金屬聯合污染的抗性響應形式及其機制，可以將菌體所含MGEs的種類、拷貝數等參數化，從而更好地解釋或推測聯合抗性發生的原因。