支氣管哮喘患兒白三烯B4 受體和2 型免疫相關標志物的表達及其臨床意義

林鴻勝， 楊 丹， 龍巧波， 趙春妹， 鄧廷茂

（1.海口市瓊山區婦幼保健院兒科，海南 海口 571101；2.張掖市第二人民醫院兒科，甘肅 張掖 534000；3.海口市瓊山區婦幼保健院檢驗科，海南 海口 571101）

支氣管哮喘是一種慢性呼吸系統疾病，其特征是氣道高反應性、炎癥引起的氣道阻塞及氣道重塑[1]。免疫細胞和其他炎性介質參與了哮喘的病理生理進程[2]。哮喘患者中大部分為兒童及青少年[3]。因此，通過各種臨床和生物標志物預測兒童哮喘的發病及其嚴重程度是小兒呼吸學科的重要課題。在特應性體質人群中，過敏原暴露可促進輔助性T細胞2（T helper cell 2，Th2）細胞因子的激活，特別是白細胞介素（interleukin，IL）-4、IL-5和IL-13等2型免疫相關因子，這提示2型免疫應答有可能是哮喘的發病機制之一[4]。另外，有研究結果顯示，白三烯B4受體（leukotriene B4 receptor，LTB4R）在過敏性疾病，包括哮喘中發揮了重要作用[5]。為此，本研究擬探討LTB4R及2型免疫相關標志物在支氣管哮喘患兒中的表達及其臨床意義。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2019年1月—2020年1月海口市瓊山區婦幼保健院就診的支氣管哮喘患兒100例（哮喘組）作為訓練集，其中男68例、女32例，年齡6～11歲。根據《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南（2016年版）》[6]將100例患兒分為輕癥組（輕中度哮喘，70例）和重癥組（重度及以上哮喘，30例）。選取同期海口市瓊山區婦幼保健院喘息性支氣管炎[7]患兒32例（喘支組），其中男17例、女15例，年齡6～10歲。另選取2020年2—11月海口市瓊山區婦幼保健院就診的支氣管哮喘患兒78例（男48例、女30例，年齡7～12歲；輕癥組55例、重癥組23例）、喘息性支氣管炎患兒21例（男11例、女10例，年齡7～11歲）作為測試集。支氣管哮喘患兒納入標準：（1）由2位兒科呼吸病專科醫生獨立進行評估，根據癥狀、體征及支氣管激發或舒張試驗確診為支氣管哮喘；（2）年齡6～12歲；（3）既往未接受抗哮喘治療；（4）無其他急、慢性呼吸道疾病。排除標準：（1）存在急、慢性感染；（2）存在其他自身免疫性或免疫缺陷疾病；（3）使用過激素或其他影響免疫系統功能的藥物。本研究經海口市瓊山區婦幼保健院倫理委員會批準，所有患兒監護人均簽署書面知情同意。

1.2 方法

1.2.1 樣本收集 采集所有對象清晨空腹靜脈血5 mL，其中2 mL分離血清，3 mL用于分離外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）。

1.2.2 LTB4R檢測 采用密度分離液（深圳達科為生物技術股份有限公司）分離PBMC，將佛波酯（終濃度20 μg/L）、離子毒素（終濃度為1 μmol/L）及莫能霉素（終濃度2 μmol/L）與單個核細胞懸液混勻制成1 mL懸液，置于培養箱中孵育6 h，收集細胞。LTB4R檢測試劑盒（貨號MA1-20232）購自美國ThermoFisher Scientific公司，采用MACSQuant流式細胞儀（德國美天旎生物技術公司）檢測，嚴格按儀器和試劑盒說明書要求進行操作。每份樣本重復檢測3次，取平均值。

1.2.3 2型免疫相關標志物檢測 采用酶聯免疫吸附試驗檢測血清IL-4、IL-5及IL-13水平，試劑盒（貨號分別為KAC1281、BMS278、BMS231-3）購自美國ThermoFisher Scientific公司，檢測儀器為Multiskan FC 酶標儀（美國ThermoFisher Scientific公司）。每份樣本重復檢測3次，取平均值。

1.3 統計學方法

采用SPSS 26.0及GraphPad Prism 6.0軟件進行統計分析。呈正態分布的計量數據以±s表示，2個組之間比較采用t檢驗。計數資料以例或率表示，組間比較采用χ2檢驗。采用二分類Logistic回歸分析構建回歸模型，采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評估各項指標鑒別診斷支氣管哮喘的效能。采用STRING 11.0軟件進行蛋白質互相作用（protein-protein interaction，PPI）網絡分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 哮喘組與喘支組LTB4R陽性率及血清IL-4、IL-5、IL-13水平的比較

哮喘組LTB4R陽性率及血清IL-4、IL-5、IL-13水平均高于喘支組（P＜0.01）。見表1。

表1 哮喘組與喘支組PBMC LTB4R陽性率及血清IL-4、IL-5、IL-13水平的比較

2.2 LTB4R及IL-4、IL-5、IL-13鑒別診斷支氣管哮喘的效能

ROC曲線分析結果顯示，LTB4R、IL-4、IL-5、IL-13鑒別診斷支氣管哮喘的曲線下面積（area under curve，AUC）分別為0.784、0.787、0.688、0.739。采用二分類Logistic回歸分析構建4種標志物診斷支氣管哮喘的風險評分模型：風險評分=14.61+0.74×LTB4R+0.86×IL-4+0.50×IL-5+0.99×IL-13。風險評分模型鑒別診斷支氣管哮喘的AUC為0.926，最佳臨界值為468.18，見表2、圖1。在測試集中驗證風險評分模型，鑒別診斷支氣管哮喘的AUC[95%可信區間（confidence interval，CI）為0.856（0.758～0.955），敏感性、特異性及準確性分別為86.66%、73.14%及59.80%，見圖2。

圖1 LTB4R及IL-4、IL-5、IL-13診斷支氣管哮喘的ROC曲線

圖2 在測試集中風險評分模型診斷支氣管哮喘的ROC曲線

表2 LTB4R、IL-4、IL-5及IL-13診斷支氣管哮喘的ROC曲線參數

2.3 不同病情支氣管哮喘患兒LTB4R陽性率及血清IL-4、IL-5、IL-13水平的比較

重癥組LTB4R陽性率及血清IL-4、IL-5、IL-13水平均高于輕癥組（P＜0.001），見表3。

表3 不同病情支氣管哮喘患兒LTB4R陽性率及血清IL-4、IL-5、IL-13水平的比較

2.4 LTB4R、IL-4、IL-5及IL-13鑒別診斷輕癥與重癥支氣管哮喘的效能

R O C 曲線分析結果顯示，LT B 4 R、IL-4、IL-5及IL-13鑒別診斷支氣管哮喘的AUC分別為0.677、0.700、0.689、0.801。采用二分類Logistic回歸分析構建4種標志物診斷支氣管哮喘的風險評分模型：風險評分=-4.38+1.02×LTB4R+0.90×IL-4+0.12×IL-5+1.03×IL-13。風險評分模型鑒別診斷支氣管哮喘的AUC為0.926，最佳臨界值為643.61，見表4、圖3。在測試集中驗證風險評分模型的診斷效能，結果顯示，AUC（95%CI）為0.842（0.764～0.921），敏感性、特異性、準確性分別為78.22%、71.63%、49.85%，見圖4。

圖3 LTB4R及IL-4、IL-5、IL-13鑒別診斷輕癥與重癥支氣管哮喘的ROC曲線

圖4 在測試集中風險評分模型鑒別診斷輕癥與重癥支氣管哮喘的ROC曲線

表4 LTB4R、IL-4、IL-5及IL-13鑒別診斷輕癥與重癥支氣管哮喘的ROC曲線參數

2.5 LTB4R、IL-4、IL-5及IL-13的PPI網絡分析

PPI網絡分析結果顯示，LTB4R、IL-4、IL-5及IL-13主要與信號轉導及轉錄激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）3、血管細胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1）、IL-18、C-C基序趨化因子配體（C-C motif chemokine ligand 22，CCL）22、CCL2、IL-1B、CX趨化因子配體8（CX chemokine ligand 8，CXCL8）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、IL-6、白細胞介素5受體亞單位α（interleukin 5 receptor subunit alpha，IL-5RA）、IL-3、STAT5A、IL-2、GATA結合蛋白3（GATA binding protein 3，GATA3）、白細胞介素2受體（interleukin 2 receptor，IL-2R）、STAT6、IL-4R、白細胞介素13受體α1（interleukin 13 receptor alpha 1，IL-13RA1）、集落刺激因子（colony stimulating factor，CSF）2、白細胞介素13受體α2（interleukin 13 receptor alpha 2，IL-13RA2）之間存在相互作用。見圖5。

圖5 LTB4R、IL-4、IL-5及IL-13的PPI網絡分析

3 討論

白三烯B4（leukotriene B4，LTB4）在支氣管哮喘的發病過程中發揮著多重作用。（1）LTB4可使受抗原刺激的肥大細胞產生活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS），介導Th2細胞因子的合成；（2）LTB4可通過NADPH氧化酶（NADPH oxidase 1，Nox1）-ROS-核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）級聯反應介導血管內皮生長因子的合成；（3）LTB4可介導內毒素誘導的Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）-髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MYD88）-LTB4-ROSNF-κB級聯反應，產生Th2細胞因子，合成IL-13[8]。LTB4主要通過與其受體LTB4R的相互作用來介導其生物學功能[9]。2型免疫反應即細胞毒型變態反應，是支氣管哮喘重要的發病機制，影響著哮喘的不同表型。根據哮喘發病及疾病進展過程中是否浸潤2型免疫相關細胞及細胞因子，可將哮喘分為2型哮喘和非2型哮喘[10]。除IL-5外，參與2型免疫反應的細胞因子還包括IL-4、IL-13等細胞因子。目前，關于聯合檢測多個2型免疫反應相關標志物及LTB4R預測小兒支氣管哮喘發病及病情嚴重程度的研究較少。為此，本研究探討了LTB4R、IL-4、IL-5及IL-13在支氣管哮喘中的價值。

本研究結果顯示，哮喘組PBMC LTB4R陽性率及血清IL-4、IL-5、IL-13水平均高于喘支組（P＜0.01）。盡管支氣管哮喘與喘息性支氣管炎在臨床表現上極其相似，難以鑒別，但從病理生理機制來看，支氣管哮喘主要涉及肥大細胞和嗜酸性粒細胞，是由超敏反應所致，主要由2型免疫反應介導，因此LTB4R及2型免疫反應相關標志物會升高；而喘息性支氣管炎主要由呼吸道合胞病毒等慢性感染所致，主要涉及中性粒細胞及支氣管黏膜上皮細胞，雖然也是由超敏反應所致，但主要由非特異性免疫反應介導，因此IgE水平通常不升高，亦不涉及2型免疫反應[11]。本研究ROC曲線分析結果顯示，采用二分類Logistic回歸分析構建的風險評分模型可有效提高相關指標對支氣管哮喘的診斷效能（AUC為0.926）。本研究結果還顯示，重癥支氣管哮喘患兒PBMC LTB4R陽性率及血清IL-4、IL-5、IL-13水平均高于輕癥患兒（P＜0.001），構建的風險評分模型鑒別診斷重癥支氣管哮喘的敏感性、特異性及準確性分別為90.24%、65.42%及50.16%。

本研究針對LTB4R、IL-4、IL-5及IL-13的PPI網絡分析結果顯示，4項指標主要與STAT蛋白家族、CCL家族及其他IL家族之間存在相互作用。IL與哮喘的發生、發展的關系已明確，而特應性哮喘與高水平的Th2細胞相關，這些細胞的分化主要通過兩面神激酶（janus kinase，JAK） -STAT信號傳導途徑進行，通過靶向STAT通路可緩解嚴重哮喘的發作[12]。CCL與哮喘患兒呼吸功能相關[13-14]。CCL2的高表達可促進支氣管哮喘患兒巨噬細胞極化，從而促進疾病進展[15]。

本研究尚有一些不足之處：（1）本研究樣本量較小，且為單中心研究；（2）哮喘的診斷主要依賴臨床癥狀及體征，血液學指標僅作為輔助診斷指標。后續將進一步擴大樣本量，并進行多中心研究，進一步提高多指標聯合檢測模型的實用性，以提高其臨床應用價值。

綜上所述，LTB4R及2型免疫相關標志物IL-4、IL-5、IL-13對兒童支氣管哮喘的輔助診斷及病情判斷有一定的價值。