同位素內標法快速篩查分析動物源性食品中地西泮殘留

◎ 崔瑞霞，宋潤娜，趙喜華

（河南中測技術檢測服務有限公司，河南 鄭州 450000）

地西泮（Diazepam，C16H13CIN2O）又名安定，是苯二氮卓類藥物的一種，主要作為抗焦慮和鎮定劑類藥物使用，對患有焦慮、睡眠不好、癲癇和驚厥的患者人群和動物有一定功效；地西泮也可以降低動物對外界的感知能力，降低其代謝功能，使之在運輸和儲存過程中仍然鮮活，并有促進生長和增重催肥的作用；地西泮也有一定的副作用，例如過度服用可引起嗜睡、宿醉反應，精神萎靡不振。長期服用地西泮會形成嚴重的藥物依賴性，尤其對老人和小孩的身體損害較大，且損傷不可逆。近年來動物源性食品中檢出了地西泮，可能是由于養殖戶在養殖過程中違規使用相關獸藥。鎮靜劑類藥物被許多國家列為動物養殖和運輸過程中明確禁止使用的藥物，我國農業部176號公告也規定嚴禁在飼料和動物飲用水中使用地西泮等精神類藥物?！妒称钒踩珖覙藴?食品中獸藥最大殘留限量》（GB 31650—2019）[1]中規定地西泮在動物性食品中不得檢出。

近年來食品抽檢量加大，動物源性食品中地西泮檢出率也相對較高[2]。報道的主要檢測方法有液相色譜法[3-4]、高效毛細管電泳法[5]、氣相色譜質譜法[6-9]、液相色譜串聯質譜法[10-16]以及超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜[17-18]等檢測方法。其中，液相色譜法檢測禁用物質痕量靈敏度相對較低；氣相色譜-質譜法前處理相對比較復雜，對除水要求較高；超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜檢測樣品成本較高；液相色譜-串聯質譜法因其痕量靈敏度高、選擇性強和定性準確等優點，在獸藥殘留分析中應用最為廣泛。目前國家抽檢細則推薦使用標準《出口動物源食品中多類禁用藥物殘留量檢測方法液相色譜-質譜/質譜法》（SN/T 3235—2012）[19]，并且只有此標準適用于動物源性食品中地西泮的檢測，但檢測過程中發現該方法存在前處理繁瑣、加標回收率較低、重復性差等問題，不適合日常大批量監督抽檢篩查檢測。每年7—12月份食品抽檢高峰期，能建立一種快速檢測動物源性食品中地西泮檢測方法是很有必要的。

Cleanert LipoNo獸殘除脂萃取管是博納艾杰爾科技有限公司新研發的一種除脂材料，填料表面修飾了許多長的碳鏈，可針對性地吸附脂肪。此方法以QuEChERS[17]的方式對脂類含量較高的樣品如肉、蛋、奶等進行前處理，能在除脂的同時保證良好的獸藥回收率，方法操作簡單便捷，適于處理大量樣品。本研究將Cleanert LipoNo凈化技術與同位素內標法相結合，采用LC-MS/MS法，建立了水產品中地西泮快速檢測方法，考慮到日常監督抽檢和風險監測時間短、任務重，此方法適用于大批量水產品中地西泮的定性定量分析，為水產品安全提供了一定的技術支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

LC-MS/MS-1290-6470A超高效液相色譜-串聯質譜儀（安捷倫公司）；氮吹儀（日本Eyela公司）；高速冷凍離心機SIGMA1-15K（德國Sigma希格瑪離心機公司）；MS205DU型電子天平（瑞典Mettler Toledo）；渦旋振蕩器（德國伊卡公司）；Milli-QDirect-Q10超純水機（美國默克密理博公司）。

標準品。甲醇中地西泮、甲醇中地西泮-D5均采購于北京壇墨質檢標準物質中心。

乙腈、甲醇、甲酸質譜級，德國默克公司；乙二胺四乙酸二鈉分析純天津市凱通化學試劑有限公司）；甲酸色譜純德國默克公司；0.22 μm水系濾膜天津津滕公司；Cleanert LipoNo獸殘除脂萃取管樣品前處理凈化劑（博納艾杰爾科技有限公司）。

樣品。水產品、禽蛋、羊肉、牛肉及豬肉共400批購于鄭州市金水區的農貿市場和超市。

1.2 試驗方法

1.2.1 溶液配制

將地西泮標準儲備液100 mg·L-1標準儲備液用乙腈稀釋為10 mg·L-1的中間液，將地西泮-D5同位素內標稀釋為4 mg·L-1中間液；將標準溶液用乙腈稀釋成1.0～200 ng·mL-1的系列標準溶液，含內標100 μg·L-1，現用現配；稱取空白樣品2.0 g，分別加入系列標準溶液各100 μL，其他處理同樣品前處理2.2.2，制成基質加標標準工作溶液。

0.1 mol·L-1乙二胺四乙酸二鈉溶液。稱取3.362 g乙二胺四乙酸二鈉于100 mL容量瓶中，用水定容至100 mL。

0.2%甲酸水溶液。取0.2 mL甲酸于100 mL容量瓶中用水定容至100 mL。

1.2.2 樣品前處理

（1）提取。稱取均質后的樣品1.00 g（精確至0.01 g）置50 mL離心管，加入2 mL 0.1 mol·L-1EDTA溶液，渦旋30 s，超聲提取10 min；加入5 mL乙腈，再加入1 g無水硫酸鎂后振蕩提取2 min，8 000 r·min-1高速離心5 min。

（2）凈化。取上乙腈層3 mL加入Cleanert LipoNo提取凈化管中，渦旋振蕩1 min，靜置分層，取上清液過0.22 μm微孔濾膜至進樣小瓶，待測。

1.2.3 液相色譜-串聯質譜條件

（1）液相色譜條件。PerkinElmer Brownlee SPP（Superficially Porous Particles）C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）；流動相：A為0.1%甲酸，B為乙腈；流速：0.3 mL·min-1； 進樣體積：10 μL；柱溫：30 ℃；液相色譜梯度洗脫程序：0～2 min，92% A，8% B；2.0～8.0 min，70%～40% A,30%～60% B；8～12min，92%A，8% B。

（2）質譜條件。離子源：ESI源，正離子模式；檢測方式：多反應監測（MRM）模式；電噴霧電壓：4.9 kV；脫溶劑管溫度：380 ℃；氣簾氣壓力：241 kPa；霧化氣壓力：345 kPa；輔助霧化氣：275 kPa；碰撞氣壓力：50 kPa。碰撞氣，氮氣。地西泮的監測離子對及碰撞能量見表1。

表1 質譜參數表

2 結果與分析

2.1 質譜條件優化

將1 μg·mL-1乙腈中地西泮標準溶液以超高效液相注入質譜儀，在正離子模式下進行一級質譜全掃描，確定其分子離子峰；確定地西泮和地西泮-D5母離子，再對獲得的母離子進行二級質譜掃描，確定目標物的主要離子碎片，選擇相對豐度強、干擾小的離子對，通過優化碰撞能，確定最佳的質譜條件（見表1）。

2.2 前處理條件優化

2.2.1 稱樣質量的優化

分別精確稱取1.00 g、2.00 g、5.00 g 3組9份空白基質樣品，對每組空白基質樣品中加地西泮1.0 ng、5.0 ng、10.0 ng，依次加入2 mL 0.1 moL·L-1乙二胺四乙酸二鈉溶液和5 mL乙腈依次提取，再加入1 g無水硫酸鎂后振蕩提取2 min，8 000 r·min-1高速離心5 min，取3 mL乙腈層經Cleanert LipoNo提取凈化管中凈化，渦旋1 min后靜置分層，取上清液乙腈層待測?；|內標法做標準曲線。經對比發現稱樣量1.00 g樣品中目標物回收率最高。

2.2.2 提取的優化

地西泮易溶于甲醇、乙腈和乙酸乙酯等有機溶劑。本實驗以牛蛙、雞蛋、鯽魚和羊肉為例，比較甲醇、1%（V/V）甲酸甲醇、乙腈、1%（V/V）甲酸乙腈、先加0.1 moL·L-1EDTA溶液再加乙腈提取、乙酸乙酯以及先加0.1 moL·L-1EDTA溶液再加乙酸乙酯提取7種提取方式提取效率，結果見表2。

表2 提取溶劑不同對地西泮加標回收率的影響表（單位：%）

通過比較不同溶劑提取方法發現加甲醇、1%（V/V）甲酸甲醇、乙腈、1%（V/V）甲酸乙腈、EDTA溶液/乙腈、乙酸乙酯及EDTA溶液/乙酸乙酯其中提取方式，直接加有機溶劑做提取劑后樣品直接聚合成一個團狀，想要分散樣品，要把已加過試劑的樣品用高速勻漿機勻漿，但是過程中會有損失，加標回收率都不高，都在50%以下，用先加0.1 moL·L-1EDTA溶液提取再加乙腈或乙酸乙酯提取，發現樣品加EDTA溶液渦旋后樣品分散了，無需用高速勻漿機勻漿，提取更徹底，損失更少。對比發現用先加0.1 moL·L-1EDTA溶液再加乙腈提取加標回收率均在90%以上，故選擇先加0.1 moL·L-1EDTA溶液再加乙腈此種提取方式。

2.2.3 凈化方式的選擇

動物源性食品中含豐富蛋白質、微量元素和不飽和脂肪酸等，基質比較復雜。有效去除基質中的干擾成分并徹底把目標物提取出來是最終目的。本研究實驗過程中比較了QuEChERS-MAS、Cleanert LipoNo和QuEChERS固相萃取材料凈化效果，均可以有效去除基質干擾，但是大批量的監督抽檢需要操作更快捷準確。液液萃取法脫脂效果不是很好，脫脂不完全，容易堵塞儀器進樣系統，降低色譜柱和儀器使用壽命。QuEChERS方法是一種普遍用于蔬菜或水果中的多農殘檢測預處理方法，主要是基于C18、PSA、石墨碳等材料的分散固相萃取技術，目前已延伸至非法添加[14-15]和獸藥殘留[18-19]等領域。考察了月旭科技和中檢維康QuEChERS、天津博納艾杰爾Cleanert LipoNo和QuEChERS-MAS的樣品凈化處理效果，結果顯示Cleanert LipoNo凈化后樣品溶液相對比較澄清，去除動物源性中脂質率效果最好，且地西泮的回收率也相對較高，基質效應最小，因此選則Cleanert LipoNo凈化樣品。

2.2.4 基質效應

基質效應/（%）=B/A×100%，其中，溶劑中目標化合物的響應值記為A；取空白樣品加入地西泮和地西泮-D5內標按照2.2.2制成與純溶劑中濃度相同的基質測定溶液，測定后響應值記為B。經過實驗，牛蛙、雞蛋、鯽魚、羊肉4種不同基質樣品在經過樣品處理后的基質效應為40.6%～61.8%，可以認為基質效應對目標物地西泮的提取有很大影響，為消除不同的基質效應，本方法用全程基質配制標準曲線，內標法進行定量分析。

2.3 方法驗證

2.3.1 線性關系、檢出限、回收率和精密度

取一定量的空白基質，加入一定體積的標準溶液和內標溶液，按2.2.2優化好的前處理條件進行提取、凈化，按2.2.1配制成全程基質加標標準溶液，按濃度由低到高進行測定。在0.1～20.0 ng·mL-1范圍內，線性回歸方程為Y=68.06X+13.2，相關系數0.999 7，線性關系良好。以3倍信噪比（S/N）為檢出限（LOD），以10倍信噪比為定量限（LOQ），得出檢出限為0.05 μg·kg-1，定量限為0.15 μg·kg-1，表明該方法的檢出限低，靈敏度高。取4個不同基質陰性樣品，添加濃度、平均回收率、相對標準偏差計算如表3所示。

表3 不同基質中地西泮平均回收率與精密度表（n=6）

2.3.2 方法穩定性

以牛蛙為基質連續4 d做加標回收，以驗證本方法穩定性，結果如表4。

表4 連續4 d牛蛙加標檢測結果表（n=6）

結果表明，本方法在不同時間實驗方法相關系數在0.998以上，回收率在96.1%～99.7%，精密度滿足要求，相對目前已有檢測方法，該方法定性定量準確、重復性好、檢測結果可信、前處理快速，適合大批量水產品中地西泮快速篩查檢測。

2.3.3 實際樣品的測定

2020年10月運用本研究方法對鄭州市金水區400批次動物源性進行檢測。通過對實際樣品的檢測結果分析，其中3批鯽魚和2批草魚檢出，檢出濃度在1.3～3.8 μg·kg-1范圍內，存在一定的食品安全風險。

3 結論

本研究通過內標法定量和優化提取溶液體系，有效提高動物源性食品基質中地西泮藥物殘留的回收率，再通過Cleanert LipoNo凈化，具有較好回收率、靈敏度、重復性和穩定性，實現內標法快速篩查分析動物源性食品中地西泮藥物殘留。該檢測方法前處理快速準確，為快速篩查動物源性食品中地西泮和食品安全監管部門提供了技術支撐。