利用CRISPR/Cas9系統構建豬PLIN1基因敲除載體及其效率檢測

彭玥晗 ， 徐 磊 ， 許金蔓 ， 王 昊 ， 胡悅旻 ， 鞠輝明,2

(1.揚州大學獸醫學院 ， 江蘇 揚州 225009 ； 2. 江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心 ， 江蘇 揚州 225009)

我國擁有豐富的地方豬種資源，近年來，在豬的肉質性狀、生長性狀、繁殖性狀等方面與全基因組選擇和全基因組關聯分析方面取得了很多研究成果[1]。豬肉的生產效率及豬肉品質一直都是豬種選育的重點，在遺傳上解析不同類型豬的肌肉生長發育差異，對豬種遺傳差異的深入研究具有重要的指導意義[2]。圍脂滴蛋白(Perilipin，PLIN)是最早由 Greenberg 等于小鼠的附睪脂肪細胞中發現的結構蛋白家族[3]，其中PLIN1定位于脂肪細胞脂滴表面，調節脂肪甘油三酯的儲存和水解[4]。越來越多研究表明，PLIN1基因對肌肉生長發育、能量代謝及線粒體功能有調控作用。CRISPR/Cas9可以編輯多種基因功能，是目前實現基因突變效率最高的系統，該系統包括系統元件 sgRNA 和 Cas9 蛋白，利用該系統可以實現基因敲入、基因敲除、基因沉默以及各種目的基因的編輯[5-6]。本課題組前期在研究巴馬豬、大白豬肌肉發育差異的過程中，利用同位素標記相對和絕對定量(Isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ)技術比較出PLIN1蛋白在巴馬豬、大白豬肌肉組織蛋白中表達量差異顯著。本試驗擬利用CRISPR/Cas9系統構建豬PLIN1敲除載體，轉染豬PK15細胞，富集crispr-sgRNA靶向切割引起的PLIN1基因突變或者外源堿基序列插入的細胞群，為后續研究該基因功能提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 豬腎上皮細胞系(PK15 細胞系)、基因敲除載體pYSY-CMV-Cas9-U6-sgRNA-EF1a-Puromycin為本實驗室保存。去內毒素質粒提取試劑盒，購自OmegaBio-Tek公司(美國)；轉染試劑Lipofectamine 3000 Transfection Kit、胎牛血清及細胞培養試劑，均購自Thermo Fisher Scientific公司(美國)；PLIN1抗體(NB100-60554)，購自Novus Biologicals公司(美國)；GAPDH抗體，購自Santa Cruz Biotechnology公司(美國)。其他分子生物學試劑，均購自寶生物工程(大連)有限公司。序列合成及測序由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 基因與載體

1.2.1 載體選擇 CRISPR 基因敲除質粒 pYSY-CMV-Cas9-U6-PLIN1-sgRNA-EF1a-Puromycin(簡稱PLIN1-KO質粒，圖1)作為載體，在gRNA scafflod 位置加入目的 sgRNA 序列。將連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，PCR驗證并送往公司測序，構建PLIN1敲除載體。

1.2.3 相關引物序列 本試驗中涉及的PLIN1 DNA區域PCR檢測引物及mRNA定量檢測引物見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.3PLIN1突變細胞群獲得 將豬PK15細胞分為4組，對照組轉染空載體(簡稱CON組)，其余3組為處理組，分別轉染3種PLIN1-sgRNA，分別稱為PLIN1-KO1、PLIN1-KO2組和PLIN1-KO3組。各組細胞轉染36 h后利用5 μg/mL的嘌呤霉素篩選2 h， 10%胎牛血清DMEM培養富集基因突變后的細胞群，分別提取DNA、RNA和蛋白用于后續試驗。

1.4PLIN1基因突變效率檢測 提取各組細胞DNA 用PLIN1-KO引物(序列見表1)擴增，PCR產物純化后連接至pGEM-T載體，轉化DH5α后每組挑取50個菌落進行序列測定。提取各組細胞總mRNA并反轉錄為cDNA，用 pPLIN1和pGAPDH引物(序列見表1)進行qRT-PCR檢測PLIN1表達水平。提取各組細胞群蛋白，用Western Blot檢測各組細胞蛋白表達差異，利用Analysis軟件測定雜交條帶的灰度值，PLIN1蛋白灰度值和相應內參條帶(GAPDH)的比值為各組PLIN1條帶的相對表達量。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃ 30 s，57 ℃ 25 s，72 ℃ 30 s，30個循環；72 ℃延伸8 min。qRT-PCR反應條件：95 ℃預變性 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個循環；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，20 ℃ 15 s。具體試驗方法見參考文獻[7]。

2 結果

2.1PLIN1突變后DNA水平檢測 處理組細胞PCR 產物連接pGEM-T載體，通過計算各組突變或缺失樣本的比率計算各組DNA突變率，試驗組PLIN1-KO1、PLIN1-KO2及PLIN1-KO3 DNA的突變率為8%、30%和18%，部分測序結果見封三彩版圖2。

圖2 細胞內DNA測序結果Fig.2 DNA sequencing results in cellsA：PLIN1-KO1細胞組突變； B：PLIN1-KO2細胞組突變； C：PLIN1-KO3細胞組突變A:Mutation of PLIN1-KO1 cell group; B:Mutation of PLIN1-KO2 cell group; C:Mutation of PLIN1-KO3 cell group

2.2PLIN1基因突變后mRNA表達變化檢測 利用qRT-PCR測量各組mRNA 表達量，CON組PLIN1表達量為0.92±0.05，PLIN1-KO1、PLIN1-KO2、PLIN1-KO3組細胞中PLIN1表達量分別為0.31±0.07、0.20±0.01和0.66±0.04，處理組PLIN1表達分別比正常細胞下降66.30%、78.26%和28.26%。PLIN1-KO2組PLIN1表達水平顯著低于CON組及其他各組(P<0.01)，結果見圖3。

圖3 細胞內mRNA表達量Fig.3 Intracellular mRNA expression

2.3PLIN1突變后各組細胞PLIN1蛋白的表達 利用Western Blot檢測各組細胞PLIN1蛋白表達，雜交條帶通過灰度分析，CON組相對表達量為基準1.00，PLIN1-KO1、PLIN1-KO2和PLIN1-KO3三組蛋白相對表達量為0.45±0.03、0.26±0.07和0.37±0.05。處理組PLIN1表達量均顯著下降(P<0.05)，和CON組相比，處理組蛋白表達量分別下降55.00%、74.00%和63.00%。其中PLIN1-KO2組表達量下降極顯著(P<0.01)。

圖4 細胞蛋白Western Blot檢測及灰度分析Fig.4 Western Blot detection and gray scale analysis of cell proteinA:Western Blot顯影圖； B：PLIN1灰度分析圖A：Developing figure of Western Blot; B：PLIN1 gray level analysis diagram

3 討論

PLIN1基因在豬肌肉中廣泛表達且能通過阻止脂肪酶水解甘油三酯的途徑抑制基礎脂解，進而促進脂滴的形成并能夠改變線粒體功能[8]，另外，PLIN1基因的表達水平和豬生長、胴體及肉質性狀顯著相關[9-10]。本課題小組在前期研究中，利用iTRAQ比較出PLIN1蛋白在巴馬豬、大白豬肌肉組織蛋白中表達量差異顯著，但PLIN1影響豬肉性狀及線粒體功能的具體機制尚未明晰，所以我們擬通過突變PLIN1基因表達來開展相應功能研究。CRISPR/Cas9 基因編輯系統是近年來發現的一種能在多種動植物中實現基因突變的高效的工具[11]，已有的研究表明切割位點設計在越靠前的外顯子導致移碼突變的概率越大[12]，所以本試驗選擇在影響PLIN1重要蛋白功能結構域的第4外顯子設計突變位點，為了提高突變成功率，設計3條CRISPR/Cas9突變的sgRNA，選擇基因突變后能改變PLIN1基因表達效率最高的載體。在確定突變效率過程中，本試驗從細胞群水平進行檢測，由于突變載體上有嘌呤霉素抗性基因，本課題小組前期已經證明了PK15細胞的最小致死劑量是5 μg/mL嘌呤霉素篩選2 h， 本試驗在此條件下對轉染后的細胞進行篩選，在隨后的細胞培養過程中大部分細胞會死亡，存活的細胞則是突變載體成功轉染的細胞，以此富集的細胞群進行基因整體突變效率檢測，大大減少后期細胞中陰性細胞的比例，在總體水平上可以更好的驗證其切割活性。在檢測突變效率過程中考慮到基因突變后，可能由于預測的突變位置不影響基因的表達，即存在PLIN1 RNA及蛋白表達沒有變化的情況，或者蛋白水平的降低，本試驗不僅從DNA層面通過PCR擴增、序列測定來鑒定PLIN1基因突變的效率，也進一步檢測了PLIN1 RNA及蛋白水平的表達變化，檢測結果可以互相驗證，結果顯示，PLIN1-KO2載體在DNA層面上基因突變率最高，該組細胞中PLIN1 RNA及蛋白表達降低幅度也最大。

本試驗利用CRISPR/Cas9系統在豬PLIN1基因第4外顯子設計了3條能夠靶向切割PLIN1基因的sgRNA并構建相應的突變載體，轉染入PK15細胞，富集crispr-sgRNA靶向切割引起的PLIN1基因突變或者外源堿基序列插入的細胞群。通過RNA及蛋白水平檢測，3個PLIN1-KO敲除載體均能突變細胞中PLIN1基因，其中PLIN1-KO2載體突變效率最高，本試驗為后續研究中突變豬細胞中PLIN1基因表達，研究該基因表達缺失后對細胞功能和線粒體功能的影響提供科學依據。