蓽茇細粉混懸液的安全藥理學研究

胡玉霞，李君，王敏杰，白圖雅，呂曉麗，張夢迪，高峰，王躍武，張謙，常福厚*（1.內蒙古醫科大學新藥安全評價研究中心，呼和浩特 010110；2.內蒙古自治區新藥篩選工程研究中心，呼和浩特 010110；3.內蒙古醫科大學藥學院，呼和浩特 010110；4.內蒙古醫科大學基礎醫學院，呼和浩特 010110）

蓽茇（Piper longumL.）屬于胡椒科胡椒屬植物蓽茇的干燥未成熟或成熟的果穗，別名蓽撥、派珀茇、畢勃、蓽菝[1]。蓽茇在中醫和蒙醫的臨床應用各有特點，配伍及治療疾病也有較大差異。中醫強調蓽茇溫中散寒、下氣止痛的功效，主要用于治療胃寒或胃冷引起的腹痛、腹瀉及消化不良，亦可治療胸腹痛、冠心病、心絞痛、神經性頭痛及牙痛等[2]，但中醫臨床較少應用。蓽茇蒙醫應用廣泛，《內蒙古蒙成藥標準》記載的103 個成方用蓽茇共27 次[3]，蒙藥臨床常用的1011 個方劑有195 個包含蓽茇[4]。蒙醫藥認為，蓽茇味辛，性溫，效膩、銳、輕、燥，有調理胃火、祛“巴達干、赫依”、調節體素、滋補強壯、平喘、止痛等功效[5]。

現代藥理學研究發現，蓽茇含生物堿類、萜類、揮發油類、甾醇類、木質素類等50 多種有效成分，其中生物堿類化合物多達40 余種，包括胡椒堿、蓽茇寧堿等，為目前已知蓽茇的主要化學成分[6]，具有調血脂、抗腫瘤、抗氧化、保肝、抗炎、鎮痛、抗菌等作用[7]。蓽茇作為一種傳統的民族藥材，具有豐富的藥用價值。

目前蓽茇的安全性評價研究多集中在急性毒性和長期毒性研究，安全藥理學研究鮮有報道。為了進一步明確蓽茇的安全性，參考國家《藥物安全藥理學研究技術指導原則》[8]的相關技術要求，本文觀察蓽茇對實驗動物中樞神經系統和心血管系統的影響，以補充和完善蓽茇的安全性數據，為日后建立蒙藥毒性篩選庫提供依據。

1 材料

1.1 試藥

蓽茇飲片（東營百佳益中藥飲片有限公司，批號：20180325；產地：山東濰坊，經內蒙古醫科大學生藥教研室渠弼鑒定為正品）。稱取適量蓽茇飲片，用粉碎機進行粉碎，過100 目篩，即得蓽茇細粉。稱取適量蓽茇細粉于配藥瓶中，加入總體積70%左右的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，先用玻璃棒攪拌溶解后定容至終體積，再用數控超聲波清洗器100 Hz 振蕩10 min，得蓽茇細粉混懸液，備用。

羧甲基纖維素鈉（天津光復精細化工研究所，批號：20180118）；異氟烷（瑞沃德生命科技有限公司，批號：217171101）；生理鹽水（山東華魯制藥有限公司，批號：D16070503）；戊巴比妥鈉（上海榕柏生物技術有限公司，批號：20170916）；無水乙醇（天津市津東天正精細化學試劑廠，批號：20180317）。

1.2 動物

1.2.1 動物來源 ICR 小鼠，SPF 級，80 只，雌雄各半，體質量：20.0～22.0 g [北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產許可證號為：SCXK（京）2012-0001]。SD 大鼠，SPF 級，40只，雌雄各半，體質量：190.0～210.0 g [北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產許可證號為：SCXK（京）2012-0001]。Beagle 犬，普通級，6 只，雌雄各半，體質量：9.05～12.15 kg [北京瑪斯生物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0001]。

1.2.2 飼養管理 ICR 小鼠和SD 大鼠飼養于內蒙古醫科大學新藥安全評價研究中心屏障設施內[實驗動物使用許可證號：SYXK（蒙）2014-0003]。PVC 塑料盒飼養，一盒5 只。60Co 放射滅菌SPF 級大小鼠生長繁殖飼料。每日上、下午定量給食，自由攝取，自由進水。

Beagle 犬飼養于內蒙古醫科大學新藥安全評價研究中心普通設施內[實驗動物使用許可證號：SYXK（蒙）2014-0003]。動物單籠圈養，每日上、下午定量給食，自由攝取，自由進水。

1.3 儀器

植入式生理信號遙測系統（美國Data Sciences International 公司）；動物麻醉機（VME2，美國Midmark 公司）；小動物活動記錄儀（YLS-1C）、大小鼠轉棒測試儀（YLS-31A）（山東益延科技有限公司）；數控超聲波清洗器（KH-500DV，北京晨曦勇創科技有限公司）；粉碎機（DSY350，上海市頂帥工貿有限公司）；分析天平（BSA4202s）、電子天平（BSA224s）（賽多利斯科學儀器有限公司）。

2 方法

2.1 心血管系統實驗

ECG 采用標準Ⅱ導聯的方式放置，胸右側2～3 肋間隙與鎖骨中線相交處為負極，胸左側12～13 肋骨體與腋中線相交處為正極。呼吸電極由4 條導線組成，正極導線和負極導線各2 條，2 條正極導線放置在胸左側第7 肋骨前后，相距2.5 cm，而2 條負極導線放置在胸右側第7 肋骨前后，相距2.5 cm，通過檢測呼吸阻抗的值，確定呼吸電極放置得是否合適。手術全程通過植入式大動物生理信號遙測系統和VME2 型麻醉機（通過觀察氣囊的變化檢測呼吸頻率）實時監測動物狀態。動物手術后進入手術恢復期，恢復期為4 周。

選用已經埋入植入子（TL11M3-D70-PCTR）的健康Beagle 犬6 只，雌雄各半。實驗設溶媒對照組及蓽茇細粉低、中、高劑量組，分別為0.1、0.3、0.9 g·kg－1（相當于臨床成人用藥劑量的3、10 和30 倍）。實驗設4 個給藥周期，相鄰給藥周期間隔為7 d。灌胃給藥，給藥體積為10 mL·kg－1。

待全部動物恢復好后，利用植入式生理信號遙測系統的Ponemah 軟件操作平臺（版本5.0）采集動物心電、血壓、體溫等指標。心電指標包括心率、PR 間期、QRS 間期、QT 間期、P 波、R 波、ST 段（取絕對值進行統計）、T 波，血壓指標包括收縮壓、舒張壓、平均壓。采集給藥前2 h 及給藥后24 h 數據。采集間隔為每10 s 系統自動記錄一次。統計時選取給藥前30 min 的時間點為給藥前基礎值、記錄給藥后0.5、1、2、3、4 h 的連續數據。剔除因動物躁動等因素導致的數據丟失和大幅度偏移的數據，取每個時間點后5 min數據的平均值作為該時間點數據。

2.2 中樞神經系統實驗

2.2.1 對小鼠自主活動的影響實驗 選取ICR 小鼠40 只，根據中心SOP 規定按體質量隨機分為4 組，每組10 只，分別為溶媒對照組，蓽茇細粉低、中、高劑量組（0.52、1.56、4.68 g·kg－1，相當于臨床成人用藥劑量的17、52 和156 倍）。分別經口灌胃給予相應供試品，給藥體積為10 mL·kg－1。于給藥前30 min 及給藥后30 min、1 h、2 h、3 h、4 h 時間點放入小動物活動記錄儀的活動箱中，測定各鼠活動情況，記錄10 min 內的自主活動次數。

2.2.2 對小鼠戊巴比妥鈉閾下催眠的影響實驗 選取ICR 小鼠40 只，根據中心SOP 規定分為4 組，每組10 只，分別為溶媒對照組，蓽茇細粉低、中、高劑量組。于給藥后6 h 腹腔注射30 mg·kg－1戊巴比妥鈉，注射體積均為10 mL·kg－1（質量濃度為3.0 mg·mL－1），即刻開始觀察注射戊巴比妥鈉30 min 內每組翻正反射消失達1 min 以上的動物數，凡30 min 內動物翻正反射消失達1 min 以上者，表明發生了睡眠，翻正反射恢復即為動物覺醒，翻正反射消失至恢復這段時間為動物睡眠時間。記錄每組發生睡眠的小鼠數和入睡潛伏期、睡眠時間。

2.2.3 對大鼠協調運動的影響實驗（轉棒法） 選取檢疫合格的SD 大鼠置于大小鼠轉棒測試儀的滾筒上訓練，轉速為12 r·min－1。訓練結束后，選取能在轉棒儀滾筒上維持3 min 以上不掉落的大鼠40 只，雌雄各半，按潛伏期（從轉棒儀滾筒上掉落所用時間）隨機分為4 組，每組10 只，分別為溶媒對照組，蓽茇細粉低、中、高劑量組（0.52、1.56、4.68 g·kg－1，相當于臨床成人用藥劑量的17、52 和156 倍）。分別經口灌胃給予相應供試品，給藥體積為10 mL·kg－1。分別于給藥后1、2、3、4 h 時間點將大鼠放在轉棒儀滾筒上，記錄每只大鼠從轉棒儀滾筒上掉落所用時間（即潛伏期），若10 min 以上不掉落則以10 min 計。

2.3 數據處理及統計分析

按照中心SOP 規定進行統計學分析，所用軟件為SPSS 20.0。計量資料采用±s表示，用Levene’s test 方法檢驗方差齊性。方差齊，用單因素方差分析（ANOVA）進行統計分析，兩兩比較采用LSD test（參數法）進行比較分析；方差不齊，則用Kruskal-Wallis 檢驗，兩兩比較采用Dunnett’s Test（非參數方法）進行比較分析。計數資料用頻數表示，采用χ2檢驗。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 心血管系統的影響

3.1.1 對清醒Beagle 犬心電指標的影響 結果顯示給藥前各劑量組所有心電指標（心率、PR 間期、QRS 間期、QT 間期、P 波、T 波、R 波及ST 段）均無明顯差異。蓽茇細粉在給藥后心電指標見表1。與溶媒對照組在同一檢測時間點的QT 值相比，給予高劑量組蓽茇細粉混懸液2 h 后，動物心率降低（P＜0.05），QT 間期出現延長（P＜0.05）。給藥后3 h，心率恢復正常，QT 值恢復正常。

表1 蓽茇細粉對Beagle 犬心率和QT 間期的影響(±s，n＝6)Tab 1 Effect of piper longum fine powder on the heart rate and QT interval of Beagle dogs (±s，n＝6)

表1 蓽茇細粉對Beagle 犬心率和QT 間期的影響(±s，n＝6)Tab 1 Effect of piper longum fine powder on the heart rate and QT interval of Beagle dogs (±s，n＝6)

注：與溶媒對照組比較，*P＜0.05。Note：vs the solvent control group，*P＜0.05.

組別 標準Ⅱ導聯 采集時間給藥前30 min 給藥后30 min 給藥后1 h 給藥后2 h 給藥后3 h 給藥后4 h溶媒對照組 心率/BPM 102.62±10.22 114.56±36.72 95.37±9.68 96.24±15.28 95.23±24.38 98.72±19.23 QT 間期/ms 217.32±27.84 213.54±21.46 220.57±23.42 216.72±25.53 220.52±29.78 228.49±25.47低劑量組 心率/BPM 99.09±20.53 109.53±28.47 115.36±49.45 93.46±15.27 89.52±12.53 92.33±15.67 QT 間期/ms 209.31±17.52 206.37±19.87 209.64±26.34 221.34±18.64 215.49±24.76 230.17±19.28中劑量組 心率/BPM 98.76±17.96 117.44±27.38 98.75±40.35 88.92±15.01 89.58±18.73 90.40±7.62 QT 間期/ms 214.75±28.51 215.37±26.72 210.38±25.76 225.63±28.35 230.96±24.51 218.79±17.64高劑量組 心率/BPM 107.38±27.54 99.50±10.19 105.63±35.67 68.25±7.45* 82.36±16.81 90.87±13.28 QT 間期/ms 209.38±27.63 218.17±19.40 213.72±27.51 273.38±30.27* 235.82±28.91 235.68±24.22

3.1.2 對清醒Beagle 犬血壓的影響 Beagle 犬灌胃給予蓽茇細粉混懸液后，對各組清醒Beagle 犬的血壓進行檢測，結果顯示：與溶媒對照組動物在同一檢測時間點的數值相比，各實驗組動物收縮壓、舒張壓和平均壓在所有檢測時間點均未見明顯改變，差異無統計學意義。

3.1.3 對清醒Beagle 犬體溫的影響 比格犬灌胃給予蓽茇細粉混懸液后，對清醒Beagle 犬的體溫進行檢測，結果顯示：給藥前所有動物體溫均在正常體溫范圍內（37.1～38.2℃）波動，給藥后，與溶媒對照組動物在同一檢測時間點的數值相比，不同實驗組之間未見明顯差異。

3.2 中樞神經系統的影響

3.2.1 自主活動的影響 如表2所示，與溶媒對照組比較，蓽茇細粉高劑量組動物給藥30 min、1 h 后活動次數明顯減少（P＜0.01）；其他各檢測點活動次數均未見明顯差異。

表2 蓽茇細粉對小鼠自主活動的影響(±s，n＝10)Tab 2 Effect of piper longum fine powder on the spontaneous activity of mice (±s，n＝10)

表2 蓽茇細粉對小鼠自主活動的影響(±s，n＝10)Tab 2 Effect of piper longum fine powder on the spontaneous activity of mice (±s，n＝10)

注：與溶媒對照組比較，*P＜0.01。Note：vs the solvent control group，*P＜0.01.

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3.2.2 對小鼠戊巴比妥鈉閾下催眠的影響 如表3所示，與溶媒對照組比較，睡眠潛伏期、睡眠時間各組均無明顯差異。

表3 蓽茇細粉對小鼠睡眠潛伏期及睡眠時間的影響(±s，n＝10)Tab 3 Effect of piper longum fine powder on the sleep latency and sleep duration of mice (±s，n＝10)

表3 蓽茇細粉對小鼠睡眠潛伏期及睡眠時間的影響(±s，n＝10)Tab 3 Effect of piper longum fine powder on the sleep latency and sleep duration of mice (±s，n＝10)

組別 入睡潛伏期/min睡眠時間/min 入睡只數/只睡眠率/%溶媒對照組 7.50±1.05 8.59±1.20 3 30.0低劑量組 6.52±0.57 10.35±0.82 4 40.0中劑量組 5.83±0.49 9.75±0.55 3 30.0高劑量組 6.42±0.73 8.49±0.76 4 40.0

3.2.3 對大鼠協調運動的影響（轉棒法） 如表4所示，蓽茇細粉中劑量組在給藥30 min、1 h 后的運動潛伏期減少，蓽茇細粉高劑量組在給藥30 min、1 h、2 h、3 h 后的運動潛伏期減少，但與溶媒對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。其他各檢測點運動潛伏期均未見明顯差異。

表4 蓽茇細粉對大鼠協調運動的影響(s，±s，n＝10)Tab 4 Effect of piper longum fine powder on the rota-rod test of rats (s，±s，n＝10)

表4 蓽茇細粉對大鼠協調運動的影響(s，±s，n＝10)Tab 4 Effect of piper longum fine powder on the rota-rod test of rats (s，±s，n＝10)

組別 采集時間給藥前30 min 給藥后30 min 給藥后1 h 給藥后2 h 給藥后3 h 給藥后4 h溶媒對照組 600.00±0.00 600.00±0.00 600.00±0.00 600.00±0.00 600.00±0.00 600.00±0.00低劑量組 600.00±0.00 600.00±0.00 600.00±0.00 600.00±0.00 600.00±0.00 600.00±0.00中劑量組 600.00±0.00 588.70±35.73 590.50±46.62 600.00±0.00 600.00±0.00 600.00±0.00高劑量組 600.00±0.00 557.30±45.33 572.20±37.91 580.60±41.59 594.20±18.34 600.00±0.00

4 討論

安全藥理學主要觀察藥物對中樞神經系統、呼吸系統、心血管系統3 個方面的影響，屬于新藥安全性評價范疇，既可以在臨床前階段發現該藥物除主要藥效作用之外的其他藥理作用，也可以預測藥物發生不良反應的范圍和概率，為藥物最終用于臨床提供依據。由于技術所限，以往采用麻醉動物進行心血管系統相關指標的測定，但麻醉藥物可能會影響受試物的作用，干擾對結果的評價。遙測技術的成熟應用成功解決了上述問題，已經成為安全藥理學研究的常規技術[9]。本實驗分別通過對不同種屬（嚙齒類和非嚙齒類）動物給予蓽茇細粉混懸液后進行安全藥理學研究，多方面、多角度提供數據，有助于加深對受試物藥理毒理作用的判斷[10]。

現代藥理學研究表明，蓽茇具有抗腫瘤、保肝、抗氧化、抗炎、免疫調節、擴張冠狀動脈血管、抗菌、抗血小板、抗高血脂、減肥、止痛、保護心肌、抗真菌等多種藥理學作用。文獻報道胡椒堿和蓽茇提取物在體內外均對道爾頓腹水瘤具有抑制作用。蓽茇提取物（10 mg·kg－1）和胡椒堿（1.14 mg·kg－1）均可以抑制道爾頓淋巴瘤在小鼠體內的進程，延長小鼠壽命[11]；另外250 μg·mL－1胡椒堿對道爾頓淋巴瘤和埃利希腹水癌細胞具有細胞毒性[12]。研究發現200、400 及800 mg·kg－1蓽茇根粉末水懸液灌胃給予小鼠或大鼠評價其止痛作用。400 及800 mg·kg－1的蓽茇粉末與非甾體抗炎藥的止痛作用相似[13]。然而，對于其安全性的研究卻很少。有報道在急性毒性實驗中，沒有發現胡椒堿有致死作用，并且在藥理藥效研究中給予受試動物3～5 mg·kg－1劑量條件下，沒有觀察到任何病態癥狀[14]。

在本研究中，通過對Beagle 犬和ICR 小鼠及SD 大鼠單次灌胃給藥進行安全藥理學研究，觀察該藥對Beagle 犬心血管系統和ICR 小鼠及SD大鼠中樞神經系統的影響，探討給予蓽茇后有無可能出現非期望的藥理作用[15]。動物選擇應與實驗方法相匹配，一般來說觀察藥物對神經系統的反應采用小鼠進行研究，但小鼠體型較小，現有實驗技術很難對其心血管系統進行評價，故首選Beagle 犬開展心血管系統實驗[16]。

心血管系統實驗研究結果表明，Beagle 犬單次灌胃給予蓽茇細粉混懸液0.1 和0.3 g·kg－1，未觀測到清醒Beagle 犬心電指標的明顯變化。高劑量蓽茇細粉混懸液2 h 后，動物心率出現降低（P＜0.05）；在給藥后3 h 恢復正常。蓽茇細粉混懸液高劑量動物在給藥后2 h，QT 間期出現延長（P＜0.05），在給藥后3 h 恢復正常。各實驗組清醒Beagle 犬的收縮壓、舒張壓和平均壓均未見明顯改變，說明蓽茇在臨床上的用量對心電和血壓指標無明顯影響。由于動物順應性不同，不同動物檢測過程中精神緊張程度及配合程度均有差異，致使心電、血壓檢測指標有一定程度的波動，但未出現一定的趨勢。結合動物一般反應情況，認為這些波動的出現是動物正常的生物學差異，與藥物無關。

中樞神經系統實驗研究結果表明，ICR 小鼠單次灌胃給予蓽茇細粉0.52 和1.56 g·kg－1，未觀測到小鼠活動次數的明顯變化，單與同期溶媒對照組比較，蓽茇細粉高劑量組動物給藥后30 min、1 h 活動次數明顯減少（P＜0.01）。研究發現各劑量組ICR 小鼠均未見與閾下劑量戊巴比妥鈉協同睡眠作用。SD 大鼠單次灌胃給予蓽茇細粉混懸液后各劑量組動物的協調運動能力未見明顯變化。

本研究表明蓽茇對心血管系統和中樞神經系統均無明顯影響，為蓽茇在臨床應用和新藥開發方面提供了一定的動物實驗依據。