風訶止咳顆粒的質量標準研究

任曉蕾，莊巖，劉華石，霍金海（黑龍江省中醫藥科學院中藥研究所，哈爾濱 150036）

風訶止咳顆粒為本院獨立自主知識產權的中藥產品，以本院臨床使用多年的治療咳喘的醫院制劑為基礎，由防風、訶子、梔子、山楂、甘草等8 味中藥組成，具有止咳、平喘、化痰、利咽之功效，對痰內伏于肺引起的咳嗽、咳吐不利、痰黏難出、呼吸急促、喉間哮鳴、咽痛等癥狀均有顯著療效。為了對制劑質量進行控制，本研究建立風訶止咳顆粒質量標準，采用薄層色譜法（TLC）對制劑中訶子、梔子、山楂、甘草進行定性鑒別，采用高效液相色譜法（HPLC）同時測定制劑防風藥材中升麻苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷、花椒毒素的含量，提高原制劑質量標準，為開發治療咽痛咳喘的中藥新藥風訶止咳顆粒奠定基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695 型高效液相色譜儀、Waters 2489 型紫外檢測器（美國沃特世），KQ-300DB 超聲清洗機（昆山超聲儀器有限公司），BP211D 型電子天平（德國Sartorius 公司），HWS26 型水浴鍋（上海一恒科技有限公司）。

1.2 試藥

甘草對照藥材（批號：120904-201519，中國食品藥品檢定研究院）；訶子（批號：DZYC-K-003）、山楂（批號：DZYC-S-022）對照藥材（成都彼斯特生物科技有限公司）；甘草苷（批號：G-009-161230）、梔子苷（批號：RFS-Z00311802022）、升麻苷（批號：S-004-150421）、5-O-甲基維斯阿米醇苷（批號：J-002-150420）、升麻素（批號：S-007-150421）、亥茅酚苷（批號：H-027-150915）、花椒毒素（批號：H-035-150729）（對照品，純度＞98%，成都彼斯特生物科技有限公司）；硅膠G 薄層板（青島海洋化工廠）；甲醇為色譜純（德國默克），水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 訶子的薄層鑒別[1-2]

取本品8 g，加無水乙醇30 mL，超聲處理30 min（功率250 W，頻率40 kHz），濾過，濾液蒸干，殘渣加無水乙醇1 mL 溶解，作為供試品溶液。按處方制備不含訶子藥材的陰性樣品，取該陰性樣品粉末8 g，同法制成陰性樣品溶液。另取訶子對照藥材1 g，同法制備對照藥材溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗，吸取上述2 種溶液10 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（3∶2∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置顯相同顏色的斑點（見圖1）。

圖1 訶子薄層色譜Fig 1 TLC chromatogram of Terminalia chebula Retz.

2.2 甘草的薄層鑒別[3-5]

取本品10 g，加乙醚60 mL，加熱回流1 h，濾過，棄去乙醚液，殘渣加甲醇60 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加水40 mL 使溶解，以正丁醇震搖提取3 次，每次20 mL，合并正丁醇液，用水洗滌3 次，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘渣加5 mL 甲醇使溶解，置中性氧化鋁柱（100～200 目，15 g，內徑為1.5 cm），用40%甲醇150 mL 洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，作為供試品溶液。按處方制備不含甘草藥材的陰性樣品，取該陰性樣品粉末10 g，同法制成陰性樣品溶液。另取甘草對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。再取甘草苷對照品，加甲醇制成每l mL 含2 mg 的溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗，吸取供試品溶液、甘草對照藥材、甘草對照品溶液上述4 種溶液各10 μL，對照品溶液5 μL 分別點于同一塊硅膠G 薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15∶1∶1∶2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜和對照藥材色譜相應的位置顯相同顏色的斑點（見圖2）。

圖2 甘草薄層色譜Fig 2 TLC chromatogram of Glycyrrhiza uralensis Fisch.

2.3 梔子的薄層鑒別

取本品10 g，加50%甲醇25 mL，超聲處理40 min（功率250 W，頻率40 kHz），濾過，取濾液作為供試品溶液。按處方制備不含梔子藥材的陰性樣品，取該陰性樣品粉末10 g，同法制成陰性樣品溶液。取梔子對照藥材l g，同法制成對照藥材溶液。另取梔子苷對照品，加乙醇制成每1 mL 含4 mg 的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗，吸取上述4 種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水（5∶5∶1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，結果見圖3。

圖3 梔子薄層色譜Fig 3 TLC chromatogram of Gardenia jasminoides Elli

2.4 山楂的薄層鑒別

取本品10 g，加水60 mL，加熱回流2.5 h，濾過蒸干，殘渣加甲醇1 mL 溶解，作為供試品溶液。按處方制備不含山楂藥材的陰性樣品，取該陰性樣品粉末10 g，同法制成陰性樣品溶液。取梔子對照藥材l g，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗，吸取上述供試品溶液、對照藥材溶液及陰性樣品溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G 板，以正己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯（5∶2.5∶6）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇試液，在105℃加熱，至呈紫紅斑點，結果見圖4。

圖4 山楂薄層色譜Fig 4 TLC chromatogram of Crataegus pinnatifida Bge.

2.5 HPLC 法測定

2.5.1 色譜條件 色譜柱：Kromasil 100-5C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：以水為流動相A，甲醇為流動相B，梯度洗脫（0～15 min，65%A；15～25 min，65%～45%A；25～35 min，45%A；35～40 min，45%A）；檢測波長為254 nm；柱溫30℃；流速1.0 mg·mL－1；進樣量10 μL。

2.5.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取對照品升麻苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷、花椒毒素，加甲醇配制成質量濃度依次為4000、2800、640、720、80 μg·mL－1的混合對照品溶液。

2.5.3 供試品和陰性樣品溶液的制備 取本品粉末1 g，精密稱定，加入甲醇25 mL，稱定重量，回流提取40 min，取出，放至室溫，稱重，以甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。按處方制備不含防風藥材的陰性樣品，取該陰性樣品粉末1 g，同法制成陰性樣品溶液。

2.5.4 專屬性試驗 分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，在“2.5.1”項色譜條件下，5 種成分能較好分離，且陰性樣品溶液無干擾，結果見圖5。

圖5 風訶止咳顆粒的高效液相色譜圖Fig 5 HPLC chromatogram of 5 batches of Fenghe zhike granules

2.5.5 線性關系考察 按“2.5.2”項下方法配制混合對照品溶液，升麻苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素、亥茅酚苷、花椒毒素的系列質量濃度作為線性溶液，在“2.5.1”項色譜條件下進樣測定，記錄峰面積，以峰面積積分值Y為縱坐標，以質量濃度X（μg·mL－1）為橫坐標，進行回歸分析，回歸方程及線性范圍見表1。

表1 線性關系Tab 1 Linearity

2.5.6 精密度試驗 取“2.5.3”項下供試品溶液，按“2.5.1”項下色譜條件連續進樣6 次，以峰面積計算升麻苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素、亥茅酚苷及花椒毒素的RSD值分別為0.48%、1.4%、1.1%、0.90%、1.3%，表明儀器精密度良好。

2.5.7 重復性試驗 取本品6 份，按“2.5.3”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，結果升麻苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素、亥茅酚苷及花椒毒素RSD分別為0.73%、1.6%、1.0%、0.85%、1.8%，結果顯示方法重復性良好。

2.5.8 穩定性試驗 精密吸取同一供試品溶液10 μL，按“2.5.1”項下色譜條件分別于0、2、4、8、12、24 h 測定峰面積，結果升麻苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素、亥茅酚苷及花椒毒素RSD值分別為0.20%、0.46%、1.4%、0.85%、2.1%，表明供試品溶液在24 h 內穩定。

2.5.9 加樣回收試驗 取已知含量樣品6 份，按含量1∶1，分別精密加入升麻苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素、亥茅酚苷及花椒毒素對照品溶液，按“2.5.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.5.1”項條件下測定，計算平均回收率分別為96.8%、97.9%、95.1%、96.5%、95.8%，RSD值分別為2.2%、2.0%、1.3%、2.7%、2.7%。

2.6 樣品含量測定

取3 批樣品精密稱定，按“2.5.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.5.1”項下色譜條件進行檢測，記錄峰面積，計算樣品含量，升麻苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素、亥茅酚苷及花椒毒素平均含量分別為0.88、0.21、0.03、0.09及0.0067 mg·g－1。

3 討論

3.1 制劑中訶子薄層研究

預試驗按照2020年版《中國藥典》一部訶子項下薄層條件，以甲苯-冰醋酸-水（12∶10∶0.4）為展開劑，分別于日光及紫外365 nm 下檢視，特征斑點不明顯且陰性樣品有干擾；經摸索將展開劑調整為三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（3∶2∶1），噴以10%硫酸乙醇溶液，對照藥材主斑點顯色清晰Rf值適中，供試品溶液相應位置斑點達到較好分離且陰性樣品無干擾。

3.2 制劑中甘草薄層研究

前期預試驗發現，復方中甘草藥材的薄層鑒別方法較難除去背景干擾，采用正丁醇提取后上中性氧化鋁柱，對照藥材、對照品及供試品色譜相應位置顯相同亮黃色特異性斑點且陰性樣品無干擾，分離度好且Rf值適中，方法簡便易操作且，專屬性強，可供其他復方中甘草藥材質量標準建立提供參考。

3.3 制劑中防風成分相關研究

防風通過其疏風解表之功達清熱利咽之效，宣肺散風止咳。升麻苷、升麻素和5-O-甲基維斯阿米醇苷具有顯著的解熱、鎮痛、抗炎及抗凝作用，亥茅酚苷也具有一定的鎮痛作用[6-8]。李悅悅等[9-10]通過RRLC-TOF/MS 分析防風入血、尿液成分發現，防風中含量高的升麻苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷入血量很少，反而在血漿和尿液中含量最高的成分是升麻素，推測升麻素為防風主要代謝形式，升麻苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷等苷類物質主要轉化為升麻素（苷元）后才能入血被吸收，因此升麻素在防風藥效發揮中的作用也相當重要，對其含量測定具有一定意義?；ń范舅厥欠里L香豆素類化合物中的一種，具有抗炎、抗菌、抗過敏、抗凝、止血、祛痰等作用，在防風主要功效的發揮中也有一定作用，因此對以上5種成分進行含量測定。

本文針對所有藥材建立質量標準，采用薄層及液相色譜針對每味藥材進行質量控制，以提高復方質量標準。