丙硫菌唑和肟菌酯混劑產品高效液相色譜分析方法

高 翀，王 怡，龐懷林

(1.上海泰禾化工有限公司，上海 201615；2.南通泰禾化工股份有限公司，南通 226407)

丙硫菌唑(prothionazole)，化學名稱為2-[2-(1-氯環丙基)-3-(2-氯苯基)-2-羥基丙基]-2,4-二氫-3H-1,2,4-三唑-3-硫酮，其結構式見圖1，是拜耳公司研制的一種新型廣譜三唑硫酮類殺菌劑，主要用于谷物、大豆、油菜、水稻、花生、甜菜和蔬菜等，殺菌譜廣。該劑不僅能高效防治小麥赤霉病，而且能有效抑制赤霉病菌產生毒素；同時，還表現出良好的保綠防衰作用，增產效果明顯[1]。

肟菌酯(trifloxystrobin)，化學名稱為(2Z)-2-甲氧基亞氨基-2-[2-[[1-[3-(三氟甲基)苯基]亞乙基氨基]氧甲基]苯基]乙酸甲酯，其結構式見圖1，是先正達公司研制，德國拜耳公司開發的甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，是以天然產物strobilurins作為先導化合物成功開發的一類新的含氟殺菌劑。它能被植物蠟質層很好地吸附，對植物表面提供優異的保護性，對幾乎所有真菌綱(子囊菌綱、擔子菌綱、卵菌綱和半知菌類)病害均有良好的活性。此產品具有高效、廣譜、保護、治療、鏟除、滲透、內吸活性，耐雨水沖刷、持效期長等特性，主要用于葡萄、蘋果、小麥、花生、香蕉、蔬菜等進行莖葉處理[2-3]。

圖1 丙硫菌唑(左)和肟菌酯(右)的結構式

325 g/L丙硫菌唑·肟菌唑懸浮劑為低毒內吸性殺菌劑，由新型廣譜三唑硫酮類殺菌劑丙硫菌唑和甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑肟菌酯復配而成，既具有保護作用又具有治療作用。該產品殺菌活性較高、內吸性較強、持效期較長、用于多種作物防治主要真菌病害，對黃瓜、番茄、大白菜和水稻的主要病害防效明顯，尤其對小麥赤霉病效果顯著。丙硫菌唑和肟菌酯的混配劑，既可以延緩病原菌抗藥性的產生，擴大抗菌譜、提高藥效，又可以減少用藥量，降低成本[4]。

目前有關丙硫菌唑和肟菌酯單劑的分析方法有較多的文獻記載，例如NY/T 3575—2020肟菌酯懸浮劑，T/CCPIA 027—2020丙硫菌唑懸浮劑2項行業標準，但對于二者復配制劑的分析方法尚少報道。本文旨在建立一種可同時對丙硫菌唑·肟菌唑懸浮劑中2種有效成分進行有效分離和定量的高效液相色譜法。該分析方法分離效果好，操作簡單快速，適用于懸浮劑等混劑中丙硫菌唑和肟菌唑的定量分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀，具可調波長的紫外檢測器：島津 SPD-M20A二級管陣列檢測器(日本島津公司)，及島津配套色譜工作站Labsolution；MS205DU型電子天平(瑞士梅特勒托利多集團)；2200T型超聲波清洗儀(上海安譜科學儀器有限公司)；Direct 8純水超純水一體機(德國默克集團)；濾膜：0.45 μm (有機相，上海安譜實驗科技股份有限公司)。

甲醇：色譜純(上海安譜實驗科技股份有限公司)；磷酸：分析純(國藥集團)；丙硫菌唑標樣：已知質量分數99.6% (上海泰禾化工有限公司提供，先正達定值)；肟菌酯標樣：已知質量分數 99.2% (上海泰禾化工有限公司提供，沈陽化工研究院有限公司定值)；試樣：325 g/L丙硫菌唑·肟菌唑懸浮劑(實驗室自制)。

1.2 色譜條件

色譜柱：Agilent XDB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm i.d.不銹鋼柱，內裝5 μm填充物)；流動相：甲醇-0.1%磷酸水溶液(體積比70∶30)，經濾膜過濾，并進行脫氣；流速：1.0 mL/min；檢測波長：254 nm；柱溫：(35 ±2) ℃；進樣體積：5 μL。在上述色譜操作條件下，丙硫菌唑的保留時間：約17.8 min；肟菌酯的保留時間：約26.1 min。丙硫菌唑和肟菌酯標樣及試樣的高效液相色譜圖如圖2、圖3所示。

圖2 丙硫菌唑·肟菌酯標樣的高效液相色譜圖

圖3 混劑的高效液相色譜圖

1.3 溶液的配置

1.3.1 標樣溶液的配制

分別稱取0.05 g (精確至0.000 01 g)丙硫菌唑和肟菌酯標樣于100 mL容量瓶中，加入約30 mL甲醇，超聲波振蕩10 min，冷卻至室溫，用流動相稀釋至刻度，搖勻。

1.3.2 試樣溶液的制備

稱取約0.32 g (精確至0.000 01 g)丙硫菌唑和肟菌酯混劑于100 mL容量瓶中，加入約10 mL純水，震蕩分散，再加入約30 mL甲醇至溶液澄清，超聲波振蕩10 min，冷卻至室溫，用流動相稀釋至刻度，搖勻。

1.4 測定

在上述操作條件下，待儀器基線穩定后，連續注入數針標樣溶液，待相鄰2針的峰面積相對變化小于1.0%，按照標樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標樣溶液的順序進行測定。

1.5 計算

將測得的2針試樣溶液以及試樣前后2針標樣溶液中丙硫菌唑/肟菌酯峰面積分別進行平均。試樣中丙硫菌唑/肟菌酯的質量分數按式(1)計算：

式中：X為試樣中丙硫菌唑/肟菌酯的質量分數，以%表示；為試樣溶液中丙硫菌唑/肟菌酯峰面積的平均值；m1為丙硫菌唑/肟菌酯標樣的質量的數值，單位為克(g)；P為標樣中丙硫菌唑/肟菌酯的質量分數，以%表示；為標樣溶液中丙硫菌唑/肟菌酯峰面積的平均值；m2為試樣的質量的數值，單位為克(g)。

2 結果和分析

2.1 方法與討論

經試驗，在島津SPD-M20A二級管陣列檢測器液相色譜的全波長數據采集功能中，可以清晰的獲得丙硫菌唑和肟菌酯在 190～600 nm的紫外吸收光譜信息。經驗證，兩者在254nm附近均有較大的紫外吸收，且能獲得良好地峰型，同時最大限度地避免了雜質的干擾。因此本試驗選定254 nm為檢測波長。

為了保障快速準確地分離、檢測2個有效成分，選擇使用了不同生產商、多種填料和長度的色譜柱進行了充分比較，并嘗試了乙腈-碳酸銨緩沖體系、乙腈-甲醇-水體系、甲醇-水體系、乙腈-乙酸水體系等，最終確認在甲醇-0.1%磷酸水體系中丙硫菌唑、肟菌酯有效成分、懸浮劑獨有添加助劑和雜質組分均可以有效分離，不存在其他干擾因素，且在體積比70∶30并柱溫恒定35 ℃時獲得最佳分析效果[5-11]。

在試驗中，丙硫菌唑和肟菌酯的保留時間仍需20 min以上，在快速分析方面還有著很大地探索空間，有條件的可嘗試采用3.5 μm填料的色譜柱、提高流動相流速至1.5 mL/min或分離效果更好地特定官能團分析柱等方案進一步提升分析效率。

2.2 分析方法特異性

本試驗采用 HPLC-DAD峰純度分析法來鑒別丙硫菌唑和肟菌酯。

丙硫菌唑標樣、肟菌酯標樣和混劑樣品中的丙硫菌唑、肟菌酯主要成分的最小峰純度相似度均為1.000 0，最小峰純度閾值均為0.999 9，最小峰純度指數均為 0，說明以上所述色譜峰中均不含有干擾成分。且標樣與試樣的色譜峰保留時間差在1.0%以內，如圖2和圖3所示。標樣和試樣的峰純度圖如圖4-圖7所示。

圖4 丙硫菌唑標樣中目標峰純度

圖5 混劑試樣中丙硫菌唑目標峰純度

圖6 肟菌酯標樣中目標峰純度

圖7 混劑試樣中肟菌酯目標峰純度

2.3 分析方法的線性相關性的測定

分別稱取6個不同質量的丙硫菌唑、肟菌酯標樣，配制6個不同濃度的線性溶液。按照1.2、1.3節的色譜分析條件，試驗可見：當丙硫菌唑質量濃度在298～809 μg/mL時，丙硫菌唑的質量濃度與其峰面積響應值之間呈現出良好的線性關系，其線性方程為y=9 711.4x+12 341，相關系數R2=0.999 7；當肟菌酯質量濃度在300～806 μg/mL時，肟菌酯的質量濃度與其峰面積響應值之間亦呈現出良好的線性關系，其線性方程為y=11 102x+6 627.9，相關系數R2=0.999 9，均完全可以滿足定量分析要求。以丙硫菌唑、肟菌酯質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，結果見圖8。

圖8 丙硫菌唑/肟菌酯峰面積與質量濃度關系圖

2.4 分析方法的精密度試驗

對同一混劑準確連續稱取6個試樣，在上述色譜操作條件下進行分析，分別測得丙硫菌唑、肟菌酯的質量分數，試驗結果詳見表 1。由表 1可見，得到丙硫菌唑和肟菌酯的標準偏差都為 0.02，二者的變異系數都為0.2%，說明該方法精密度良好，能滿足日常的定量分析。

表1 丙硫菌唑和肟菌酯混劑的精密度試驗結果

2.5 分析方法的準確度試驗

準確稱取6個丙硫菌唑和肟菌酯混劑試樣，加入一定量的丙硫菌唑和肟菌酯標樣，按 1.2節的高效液相色譜操作條件分別進行分析，測得丙硫菌唑的回收率為99.2%～100.3%，平均回收率為99.6%；肟菌酯的回收率為 100.5%～101.3%，平均回收率為100.9%(表2)。這說明該方法準確度良好，能滿足日常的定量分析。

表2 丙硫菌唑和肟菌酯混劑的準確度試驗結果

2.6 非分析物干擾試驗

制劑空白為不含有效成分的樣品空白，按 1.2節的高效液相色譜操作條件進行分析，采用4倍量20 μL進樣，其高效液相色譜圖如圖9所示，與圖2、圖3對比可見，制劑空白中不含有效成分的干擾物質[12]。

圖9 丙硫菌唑和肟菌酯混劑的空白高效液相色譜圖

3 結 論

本文建立了采用高效液相色譜法快速測定丙硫菌唑和肟菌酯混劑中有效成分丙硫菌唑與肟菌酯的方法。采用XDB-C18不銹鋼色譜柱(150 mm×4.6 mm i.d.×5 μm)和紫外檢測器，以甲醇-0.1%磷酸水溶液(體積比70∶30)為流動相，測得有效成分的精密度和準確度高、線性關系良好。該方法具有操作簡便，檢測過程穩定，結果準確，分離效果好等特點，可用于丙硫菌唑和肟菌酯混劑生產過程中產品的檢測。