乳酸菌發(fā)酵降鎘處理對大米淀粉結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)的影響

張永蘭 林利忠,2

(中南林業(yè)科技大學食品科學與工程學院；稻谷及副產(chǎn)物深加工國家工程實驗室1，長沙 410000)(金健米業(yè)股份有限公司2，常德 415001)

鎘是地殼中的自然元素，通過自然和人為的行為釋放出來，是一種有毒元素[1]。同時，鎘以多種方式進入人體，除了呼吸和皮膚接觸，飲食攝入被認為是鎘暴露的主要方式[2]。大米及其制品是鎘的主要攝入來源之一，Shi等[3]評估了全球精米市場供應鏈中的鎘濃度，并與歐洲標準進行了比較，全球供應鏈的5%超過了200 μg/kg。我國三分之二左右的人口以大米為主食，但是部分區(qū)域受到重金屬鎘污染，嚴重威脅糧食和食品安全。

乳酸菌發(fā)酵可以有效去除稻米中的鎘。劉也嘉等[4]研究了乳酸發(fā)酵脫除大米重金屬鎘的工藝，在加水量120%、強化菌種添加量0.08‰、發(fā)酵溫度32 ℃的條件下，降鎘率可達79.24%。Zhai等[5]通過研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌中菌株CCFM 8610具有較高的鎘去除率，在加水量120%、菌種添加量1%、37 ℃發(fā)酵24 h的條件下，鎘的去除率可達93.37%。Zhu等[6]通過混合乳酸菌發(fā)酵大米米粉，優(yōu)化后的最佳工藝是用8%的混合乳酸菌種在35 ℃下發(fā)酵28 h，可使米粉中鎘的含量降低87.6%。這些研究表明，乳酸菌發(fā)酵是一種有效的方法，這也意味著用乳酸菌發(fā)酵從大米中去除鎘，是開發(fā)安全大米食品的一種策略。

大米淀粉是人類飲食中碳水化合物的主要來源[7]，也是影響大米可加工性中最重要的成分[8]。與其他淀粉相比，大米淀粉具有小顆粒形態(tài)，無異味，口感順滑，低過敏性等獨特的特性[9]。堿溶酸沉法提取的大米淀粉分為白淀粉與黃淀粉，且黃淀粉中含有的蛋白質(zhì)與淀粉之間可能通過特殊化學鍵緊密結(jié)合，也可能被包埋在淀粉顆粒間[10]，故不能用堿液輕易去除其中的蛋白質(zhì)[11]。從鎘在大米各組分分布比例來看，淀粉鎘累積量占稻谷鎘總量的比例平均為18.34%；蛋白鎘累積量所占比例平均為 53.21%；黃淀粉鎘累積量所占比例平均為18.83%；廢液中鎘的累積量所占比例平均為10.37%[12]。可見，大米中的鎘富集在蛋白質(zhì)中，而在淀粉中積累較少，故大米淀粉產(chǎn)品的制備有望成為含鎘大米加工利用的有效途徑之一。近年的關注點大多聚集于大米鎘結(jié)合蛋白，鮮有研究乳酸菌發(fā)酵對大米淀粉的影響。本實驗以乳酸菌發(fā)酵降鎘后的大米為原料，研究分析了乳酸菌發(fā)酵降鎘處理對大米淀粉結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)的影響，為大米低蛋白產(chǎn)品的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

發(fā)酵液(乳酸菌濃度約108～109cfu/mL)，鎘含量約0.9 mg/kg的大米(早秈稻，2019年生產(chǎn)，常溫儲存，市購)，植物乳桿菌(1×1010cfu/g)，鹽酸、硫酸、乙醚、葡萄糖、3,5-二硝基水楊酸、亞硫酸鈉、醋酸鉛等化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

K9840半自動凱氏定氮分析儀，JUPITER-B微波消解儀，700P石墨爐原子吸收光譜儀，SpectraMax i3X酶標儀，HAQ-C空氣浴振蕩器，Q2000差示掃描量熱儀，RVA-Super3快速黏度分析儀，Tescan Mira3掃描電子顯微鏡，Rigaku Ultimate IV X-衍射儀。

1.3 方法

1.3.1 大米發(fā)酵降鎘工藝

在潔凈的塑料桶中依次加入120%的超純水、0.08‰的植物乳桿菌、2%的米粉發(fā)酵液和0.8%的食鹽(均以大米質(zhì)量計)，攪拌均勻后加入一定量的大米，繼續(xù)攪拌均勻，于32 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)靜置發(fā)酵20 h。待發(fā)酵結(jié)束，舍棄上清液，用自來水將發(fā)酵米樣沖洗4～5遍，瀝干，平鋪于大培養(yǎng)皿中，于50 ℃鼓風干燥箱中烘干12 h以上。再將干燥完成后的大米進行粉碎后過80目篩，裝于密封袋，保存于干燥器中備用。

1.3.2 提取大米淀粉

參照陳青[13]的方法，將鎘超標大米進行乳酸菌發(fā)酵后作為研究對象，并以未發(fā)酵的鎘大米作為對照，采用分級提取的方法提取大米蛋白，將提取后的沉淀加入純水進行水洗離心2次，可見淀粉分為上下兩層，其中上層為大米白淀粉，下層為大米黃淀粉，將白、黃淀粉分離開再各自離心水洗3次，并將白淀粉上層淡黃色糊狀物質(zhì)去除，于45 ℃鼓風干燥箱中烘干至少12 h，-粉碎后過80目篩，即可得大米白淀粉和大米黃淀粉，裝于密封袋，保存于干燥器中備用。

1.3.3 基本成分測定

根據(jù)GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質(zhì)的測定》中的凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)；采用DNS法測大米淀粉質(zhì)量分數(shù)，標準曲線為y=0.294x+0.000 3，R2=0.999 8；根據(jù)GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》中的索氏抽提法測定脂肪質(zhì)量分數(shù)；采用水分快速測定儀測定水分含量；用直鏈淀粉質(zhì)量分數(shù)檢測試劑盒測定直鏈淀粉質(zhì)量分數(shù)：取樣品0.01 g，將樣品進行脫糖、脫脂并溶解后離心，調(diào)節(jié)雙波長至550 nm和485 nm，離心取上清液測吸光度值，根據(jù)試劑盒的相應公式計算直鏈淀粉質(zhì)量分數(shù)，每個樣品做3個平行。

1.3.4 鎘含量

參照陳青[13]的方法，采用微波消解-石墨爐原子吸收光譜法測定大米鎘含量。

1.3.5 大米淀粉微觀結(jié)構(gòu)

參照陳青[13]的掃描電鏡方法，將干燥后的大米淀粉通過導電雙面膠固定于樣品載體片上，氣流吹去未穩(wěn)定黏合的樣品，噴鍍鉑金粉后放置于掃描電子顯微鏡下觀察并拍攝有代表性的顆粒形貌。觀察時放大倍率為5 000，壓力10.0 kV。

1.3.6 大米淀粉結(jié)晶度

在Zhang等[14]方法上稍加修改，取適量大米淀粉放入干燥器中，平衡水分48 h，然后把平衡好水分的大米淀粉放入玻璃片的凹槽內(nèi)壓平，且使樣品表面光滑，且與玻璃片表面保持水平。采用石墨單色器，銅靶選用Cu-Ka，管壓設置為40 kV，電流為40 mA，發(fā)射狹縫為1°，防散射狹縫為1°，接受狹縫為0.3 mm，2θ掃描區(qū)間3°～50°，掃描速度2°/min。得到的結(jié)果通過Origin 2020軟件作圖并用JADE 9.0軟件進行結(jié)晶度的計算。

1.3.7 大米淀粉熱特性

在Zhang等[14]方法上稍有改變。在鋁DSC坩堝中稱2 mg樣品(干基質(zhì)量)，然后加入7.5 μL的超純水形成懸浮液，用壓片機對坩堝進行壓片密封，室溫下平衡2 h。樣品升溫速率為10 ℃/min(25～100 ℃)，以空密封坩堝為參照。記錄4個熱參數(shù)：起始溫度、峰值溫度、糊化終止溫度和吸熱焓。每個樣品做3個平行。

1.3.8 大米淀粉糊化特性

參照呂佩霞[15]的測定方法，采用快速黏度測定儀(RVA)測定：以12%含水量為基準，量取(25.0±0.1) mL蒸餾水移入樣品筒中，稱取(3.00±0.01) g已知含分量的粉碎大米淀粉試樣轉(zhuǎn)移到樣品筒內(nèi)的水面上。將攪拌器置于樣品筒中，并用攪拌器上漿葉在試樣中上下劇烈攪動。再將攪拌器插入樣品筒中并將樣品筒插接到儀器上，按下塔帽，啟動測量循環(huán)。設置程序為：起始溫度50 ℃，保持1min，然后以18 ℃/min速率升溫到95 ℃，保持2.5 min，然后溫度再以12 ℃/min的速率降至50 ℃，保持1 min。測試結(jié)束后，取下樣品簡。總共大約13 min，得到糊化特性曲線，記錄其峰值黏度、熱糊黏度、崩解值、最終黏度、回生值和糊化溫度。每個樣品做3個平行。

1.3.9 大米淀粉溶解度與膨脹力

參照陳季旺等[16]方法，將干燥皿于105 ℃下烘干至恒重(m0)，將使用前的50 mL干燥離心管稱重(y0),取0.5 g大米淀粉于50 mL離心管中，加入25 mL超純水，混勻30 s，在室溫靜置平衡5 min，再放入恒溫空氣浴振蕩器中60 ℃，180 r/min，振蕩30 min后，取出放于冰水中冷卻1 min，于室溫冷卻平衡5 min，用離心機3 000 r/min，20 min，24 ℃進行離心分層，取出后，將上清液倒入恒重的干燥皿中，于105 ℃烘干至恒重后稱重(m1)，將離心后有沉淀物的離心管進行稱量(y1)，每個樣品3個平行，計算溶解度(s%)和膨潤力(sp)。

(1)

(2)

式中：m為樣品質(zhì)量：w為樣品含水量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行平均值、ANOVA方差分析及顯著性分析，并用Origin 2020軟件繪圖。

2 結(jié)果與結(jié)論

2.1 基本成分

從表1(均以干基計)可以看出，原料大米的淀粉質(zhì)量分數(shù)高達91.43%，蛋白含量和脂肪質(zhì)量分數(shù)都較低，發(fā)酵后，大米的基本成分含量均有所下降，淀粉質(zhì)量分數(shù)仍然高達91.35%，故該鎘超標大米在發(fā)酵前后均適宜提取大米淀粉，發(fā)酵后的大米鎘含量明顯下降，乳酸菌發(fā)酵鎘消減率達75.4%。從表2(均以干基計)可以看出，大米白淀粉、大米黃淀粉的直鏈淀粉質(zhì)量分數(shù)經(jīng)發(fā)酵后均下降，黃淀粉的蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)高于白淀粉，且鎘含量較高，印證了大米中的鎘主要與蛋白質(zhì)結(jié)合[17，18]。

表1 原料大米和發(fā)酵大米基本成分

表2 大米淀粉基本指標

2.2 乳酸菌發(fā)酵降鎘對大米白、黃淀粉微觀結(jié)構(gòu)的影響

如圖1所示，原料白淀粉顆粒大體呈平滑的不規(guī)則的多邊形和球形，淀粉直徑大約3～8 μm，有少量小塊的淀粉顆粒，少量纖維素或者蛋白質(zhì)附著在淀粉顆粒上，淀粉顆粒表面較光滑。且有少數(shù)淀粉里上有裂紋、凹痕和小孔，說明堿提的方式會對淀粉顆粒有輕微的損害。發(fā)酵后的大米白淀粉小顆粒較未發(fā)酵前的白淀粉增多，淀粉直徑約3～8 μm，其表面附著極少的纖維素和蛋白質(zhì)，且淀粉顆粒上還有凹槽、小孔、裂紋等較未發(fā)酵白淀粉加重，部分淀粉顆粒不完整，說明在乳酸菌發(fā)酵降鎘的過程中，蛋白質(zhì)可能從與淀粉的包裹結(jié)構(gòu)中釋放出來[13]。

圖1 原料和發(fā)酵米白、黃淀粉掃描電鏡圖(5 000倍)

原料黃淀粉顆粒大小比較均勻，淀粉顆粒直徑在3～8 μm，淀粉顆粒大體呈現(xiàn)不規(guī)則的多面形和球形，大部分淀粉表面平滑，少數(shù)淀粉顆粒上有小洞及凹痕及破損，與白淀粉相比較，黃淀粉表面附著的纖維素網(wǎng)和蛋白質(zhì)。發(fā)酵后，黃淀粉顆粒直徑2～10 μm，淀粉顆粒表面凹痕、小孔、裂紋較未發(fā)酵黃淀粉增多，小顆粒淀粉增多，且淀粉表面黏附著纖維素和蛋白質(zhì)，使顆粒表面變得不平滑，顆粒完整性被破壞。整體來看，乳酸菌發(fā)酵降鎘不僅在米粒表面進行，在米粒內(nèi)部對大米中的白、黃淀粉都有輕微的損害[6,19]。但大米淀粉的整體結(jié)構(gòu)未被破壞，表明乳酸菌發(fā)酵降鎘對淀粉的損害程度低，這對開發(fā)淀粉類產(chǎn)品是有利的[20]。

2.3 乳酸菌發(fā)酵降鎘對大米白、黃淀粉結(jié)晶度的影響

如圖2所示，發(fā)酵前后的白、黃淀粉顆粒在衍射角度2θ為15.3°、17.1°、18.2°和23.5°上有明顯的衍射峰，峰位未發(fā)生明顯偏移，均屬于標準的A型結(jié)晶體，與具有典型A型結(jié)晶結(jié)構(gòu)的正常秈米晶體相比，鎘超標大米在發(fā)酵前后，大米白、黃淀粉的晶體結(jié)構(gòu)沒有改變。

圖2 原料米和發(fā)酵米的白、黃淀粉衍射圖

淀粉顆粒中包含結(jié)晶區(qū)和無定形區(qū)，結(jié)晶區(qū)主要由支鏈淀粉外鏈與直鏈淀粉組成的雙螺旋結(jié)構(gòu)構(gòu)成[21]。從表3可以看出，原料白淀粉結(jié)晶度為43.40%，黃淀粉的結(jié)晶度為43.03%；發(fā)酵白淀粉結(jié)晶度為36.82%，黃淀粉的結(jié)晶度為38.24%；鎘超標大米經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵降鎘后白淀粉和黃淀粉的結(jié)晶面積均減少。從表2中可以看出，發(fā)酵后大米白淀粉和黃淀粉的直鏈淀粉質(zhì)量分數(shù)均減小，說明發(fā)酵降鎘使淀粉的直鏈淀粉質(zhì)量分數(shù)減小，使得由支鏈淀粉外鏈與直鏈淀粉構(gòu)成的非結(jié)晶區(qū)增加，結(jié)晶區(qū)減少，從而導致發(fā)酵后淀粉結(jié)晶度下降，使宏觀品質(zhì)發(fā)生細微改變[5,22]，表明淀粉結(jié)晶度與直鏈淀粉質(zhì)量分數(shù)和結(jié)構(gòu)有關，且直鏈淀粉質(zhì)量分數(shù)與結(jié)晶度呈正相關，這與Kong等[23]研究結(jié)論相反。另一方面，淀粉顆粒的裂紋也可能導致結(jié)晶度的喪失，結(jié)晶區(qū)結(jié)構(gòu)較松散，使結(jié)晶面積減少[24]，這與上述掃描電鏡的分析相符。

表3 原料米和發(fā)酵米白、黃淀粉的X射線衍射結(jié)晶結(jié)構(gòu)

2.4 乳酸菌發(fā)酵降鎘對大米白淀粉、大米黃淀粉熱特性的影響

從表4中可以看出，乳酸菌發(fā)酵降鎘后的大米白、黃淀粉的糊化開始溫度高于鎘超標大米白、黃淀粉，說明經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵降鎘后的大米白、黃淀粉不易糊化。發(fā)酵降鎘后的大米白、黃淀粉吸熱焓也比鎘超標大米的低，吸熱焓表示的是淀粉結(jié)構(gòu)從有序轉(zhuǎn)變到無定形所需的能量。有研究表明，經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵降鎘后的大米的熱特性與正常秈米的相似，具有不易糊化和吸熱焓低等特點，發(fā)酵后吸熱焓降低與淀粉的結(jié)晶度減小有關，需要轉(zhuǎn)化的結(jié)晶區(qū)減少，所需能量也減少[15]。從整體來看，黃淀粉的峰值溫度和糊化終止溫度均高于白淀粉，其中峰值溫度差異與淀粉-蛋白結(jié)合體是否被破壞有關，由于黃淀粉中有更多的蛋白體黏附在淀粉顆粒四周，阻止了糊化過程中水分的進入，于是需要更多的初始能量來破壞這一結(jié)合體，故黃淀粉的峰值溫度高；而糊化終止溫度差異可能與黃淀粉中淀粉-蛋白結(jié)合體更多相關，這影響了米粒中的脂類同淀粉顆粒中直鏈淀粉復合物的形成，從而導致糊化終止溫度的下降[25]。

表4 原料米和發(fā)酵米白、黃淀粉的DSC結(jié)果分析表

2.5 乳酸菌發(fā)酵對大米白、黃淀粉糊化特性的影響

從表5可以看出，乳酸菌發(fā)酵降鎘后，大米白、黃淀粉的糊化溫度和達到峰值黏度的時間較原料淀粉增加，峰值黏度較原料淀粉減少，說明發(fā)酵后更不易糊化，這與DSC的結(jié)果一致，一方面可能與發(fā)酵后直鏈淀粉質(zhì)量分數(shù)增加，導致淀粉顆粒分子結(jié)構(gòu)改變有關；另一方面可能與發(fā)酵后淀粉顆粒崩解值減小，使淀粉更加穩(wěn)定有關。回生值主要體現(xiàn)的是淀粉受熱冷卻后老化的難易程度，可以看出乳酸菌發(fā)酵降鎘促進了白淀粉的回生，使其更易老化，抑制了黃淀粉的回生，使其更不易老化，可能與鎘大米陳放時間過久有關。從整體來看，黃淀粉的回生值顯著高于白淀粉，這可能與淀粉中的蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)有關[11]。崩解值與淀粉的耐剪切性能呈負相關關系，發(fā)酵降鎘后，大米白、黃淀粉的崩解值較原料淀粉下降，說明發(fā)酵降鎘使淀粉穩(wěn)定性更強，且白淀粉的崩解值顯著高于黃淀粉，說明蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)高，其與淀粉之間的相互作用，使崩解值減小[26]。發(fā)酵降鎘使淀粉的最終黏度稍有降低，說明發(fā)酵對大米品質(zhì)有所改善[18]，而發(fā)酵降鎘對大米白、黃淀粉的最低黏度沒有較大影響。

表5 原料米和發(fā)酵米淀粉的RVA特性分析表

2.6 乳酸菌發(fā)酵降鎘對大米白、黃淀粉溶解度和膨潤力的影響

從表6中可以看出，發(fā)酵降鎘后，鎘大米白淀粉和黃淀粉的溶解度和膨潤力都有小幅度的增加。溶解度主要反應的是在一定溫度下淀粉與水的結(jié)合力[27]，說明鎘大米經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵降鎘后，在60 ℃下，大米白、黃淀粉更易與水結(jié)合。膨潤力主要發(fā)生在無定形區(qū)，反應的是直鏈淀粉的水合作用[28]，說明鎘大米經(jīng)過乳酸發(fā)酵降鎘，直鏈淀粉質(zhì)量分數(shù)減小，形成的結(jié)晶區(qū)減小，結(jié)晶度減小，無定形區(qū)增加，直鏈淀粉對淀粉顆粒的抑制作用減小，淀粉粒之間結(jié)合變松，所以膨潤力增加，這與前面的淀粉X射線衍射結(jié)果相符。

表6 原料米和發(fā)酵米白、黃淀粉溶解度和膨潤力的變化

3 結(jié)論

在本實驗中，乳酸菌發(fā)酵降鎘率達到75.4%，發(fā)酵降鎘后，大米基本成分含量均有所降低。乳酸菌發(fā)酵降鎘不僅發(fā)生在大米顆粒表面，也深入了顆粒內(nèi)部：對大米白淀粉、大米黃淀粉顆粒表面結(jié)構(gòu)均有一定的改善；大米白、黃淀粉的晶型都為A型，結(jié)晶度降低；糊化初始溫度增加，吸熱焓降低，這與正常秈米的熱特性相似；糊化溫度和峰值時間的增加、崩解值的減小，這表明發(fā)酵后不易糊化；溶解度和膨潤力均有小幅度增加，這與淀粉的結(jié)晶度趨勢相符。這不僅為微生物發(fā)酵降鎘的機理提供了更細致的理論基礎，也為進一步研究利用大米淀粉制作低蛋白產(chǎn)品提供參考。