高壓靜電場處理對甘薯采后愈傷的促進效應(yīng)

成紀予 舒志建 金佳平 路興花 陸國權(quán) 龐林江

(浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江省農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)改良技術(shù)研究重點實驗室，杭州 311300)

甘薯皮薄質(zhì)嫩，含水量高，不耐貯藏，在采收和貯運中易受到機械損傷，而損傷是造成甘薯采后損耗的主要因素。高溫處理(29～38 ℃)可有效促進甘薯采后愈傷[1]，但貯存空間、能源消耗及經(jīng)濟投入大[2]。據(jù)報道，外源乙烯、一氧化氮、赤霉素(GA3)、脫落酸(ABA)、苯丙氨酸、殼聚糖、水楊酸(SA)、苯丙噻重氮(BTH)等化學(xué)物質(zhì)處理能提高采后馬鈴薯或甘薯的苯丙烷代謝[3-7]，促進代謝產(chǎn)物木質(zhì)素的積累，具有加快愈傷效果，但化學(xué)方法具有操作不便、潛在危害和環(huán)境污染等缺點，在實際應(yīng)用上會受到較大的限制。因此，研究與開發(fā)新型實用的甘薯愈傷技術(shù)對于促進甘薯采后愈傷效果，提高耐貯性和貯藏品質(zhì)具有重要意義。

高壓靜電場屬于電磁微能，作為一種物理技術(shù)，具有操作簡便、無毒無害、對環(huán)境無殘留無污染等優(yōu)點，可用于食品保鮮領(lǐng)域[8]。空間磁場的改變會造成植物體的細胞分裂[9]、細胞增殖[10]、基因表達[11]、抗病性[12]及酶活性[13]等方面發(fā)生變化。丹陽等[14]研究發(fā)現(xiàn)短時間的高壓靜電場處理可以抑制黃瓜細胞膜透率的上升；曹學(xué)成等[15]表明高壓靜電場處理能夠提高黃瓜種子中過氧化氫酶(CAT)的活性，清除細胞內(nèi)多余的H2O2，減輕由氧化帶來的傷害；趙劍等[16]認為靜電場預(yù)處理大豆種子可以修復(fù)膜損傷部位。高壓靜電場對海棠[17]、煙草[18]、銀杏[19]等愈傷組織的生長和再分化具有促進作用。可見，施加高壓靜電場可以調(diào)控植物生理代謝，但是，不同的高壓靜電場處理參數(shù)對生物體的作用效應(yīng)影響各異。

本研究以‘心香’甘薯為材料，進行人工機械損傷，通過單因素和響應(yīng)面法優(yōu)化高壓靜電場愈傷條件，以木質(zhì)素含量為考察指標，建立可信的數(shù)學(xué)模型，獲得電場促進甘薯愈傷的最佳電場強度、處理時間及處理溫度參數(shù)；并監(jiān)測電場處理對損傷甘薯愈傷效率的影響程度。以期為高壓靜電場在甘薯采后愈傷和貯藏保鮮中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮食型甘薯品種：心香。挑選無機械損傷、無病蟲害、無發(fā)芽霉變、大小均勻(單個質(zhì)量約50 g)的薯塊為實驗材料。無水乙醇、鹽酸、硫酸、三氯乙酸(TCA)、硫代巴比妥酸(TBA)、氫氧化鈉，均為分析純。

1.2 儀器設(shè)備

HWS-250FT智能恒溫恒濕實驗箱(控溫范圍0～50 ℃，精度為±0.5 ℃；控濕范圍50%～90%RH，精度為±2%；外形尺寸為550 mm×610 mm×1 760 mm)。高壓靜電場發(fā)生儀(包含主機和2塊發(fā)射板，實驗時將電場發(fā)射板平行安裝于智能恒溫恒濕實驗箱的頂部和底部，兩塊發(fā)射板間距離可調(diào)，可形成30～1 500 kV/m的負高壓靜電場)，T6新世紀紫外可見分光光度計，DGG-9053AD電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，3K15型離心機，KQ 5200B型超聲波清洗器，BCD-212(KK21E68T1)冰箱。

1.3 處理方法

1.3.1 甘薯人工損傷處理

將甘薯用濃度為0.2%的次氯酸鈉溶液清洗消毒，自然晾干后隨機分組，每組30個甘薯，甘薯的損傷方式為沿著赤道橫向切開兩半[20]。在愈傷過程中甘薯的擺放呈平鋪無堆疊的狀態(tài)，以保證溫度的均勻分布和各個樣品的受熱均勻性。

1.3.2 高壓靜電場處理單因素實驗

以電場強度、處理時間和處理溫度為考察因素，用木質(zhì)素含量評價高壓靜電場處理對甘薯愈傷的影響。

電場強度對甘薯愈傷的影響：將人工損傷后甘薯分別置于0、200、400、600、800、1 000 kV/m電場環(huán)境中作用8 h，作用溫度25 ℃，RH為85%～90%，在愈傷第4天取出檢測，篩選出較適宜的電場施加強度。同時與常規(guī)的高溫愈傷處理(35 ℃，RH為85%～90%作對比。

處理時間對甘薯愈傷的影響：將人工損傷后甘薯在25 ℃、RH為85%～90%、800 kV/m的電場環(huán)境中分別作用4、8、12、16、20 h，在愈傷第4天取出檢測，篩選出較適宜的電場處理時間。

處理溫度對甘薯愈傷的影響：將人工損傷后甘薯分別置于10、15、20、25、30、35 ℃的800 KV/m電場環(huán)境中作用12 h，在愈傷第4 d取出檢測，篩選出較適宜的電場處理溫度。

1.3.3 高壓靜電場處理響應(yīng)面優(yōu)化

在單因素基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-behnken實驗設(shè)計原理，進行響應(yīng)面優(yōu)化，以木質(zhì)素含量為指標，考察電場強度、處理時間及處理溫度對甘薯愈傷效應(yīng)的影響，因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面實驗設(shè)計因素與水平表

1.4 測定方法

1.4.1 木質(zhì)素含量

愈傷后用切取甘薯傷口部位及皮下3 mm厚的薯肉組織用于木質(zhì)素含量檢測。稱取5.0 g甘薯樣品M0與15 mL 72% H2SO4于25 ℃靜置1 h，再加345 mL蒸餾水將硫酸濃度稀釋至3%，100 ℃水浴回流3 h后過濾懸浮液，并用50 ℃左右的溫水將木質(zhì)素連同濾紙M1一起洗滌至中性，將木質(zhì)素連同濾紙一并移入稱量瓶，105 ℃烘干至恒重M2。計算公式為：木質(zhì)素質(zhì)量分數(shù)=(M2-M1)/M0×100%。

1.4.2 間苯三酚染色

在甘薯傷口表面滴加2～3滴1 mol/L鹽酸，然后滴加2～3滴5%～10%間苯三酚的85%酒精溶液，根據(jù)染色區(qū)域和顏色深淺檢驗愈傷程度[7]。

1.4.3 相對電導(dǎo)率

切取相同甘薯愈傷部位圓片(直徑×厚度，Ф20 mm×2 mm)，在50 mL去離子水中輕微振蕩3 h，測定并記錄電導(dǎo)率P1，然后沸水水浴30 min，冷卻后測定并記錄電導(dǎo)率P2[21]。計算公式為：相對電導(dǎo)率=P1/P2×100%。

1.4.4 丙二醛(MDA)含量

取樣方法與木質(zhì)素含量檢測一致。稱取1.0 g甘薯樣品與5 mL 100 g/L三氯乙酸(TCA)溶液，充分研磨成勻漿，于4 ℃、10 000×g離心15 min，收集上清液備用。取1 mL上清液，加入2 mL 0.67%硫代巴比妥酸(TBA)溶液，混勻并煮沸30 min，冷卻后取上清液分別在532、600、450 nm測定吸光值[21]。上清液MDA含量計算公式為：MDA含量(μmol/L)=6.45×(OD532 nm-OD600 nm)，再計算出愈傷組織樣品的MDA含量，單位以μmol/gFW計。

1.5 數(shù)據(jù)處理

實驗重復(fù)3次，實驗結(jié)果以平均值±SD表示。采用OriginPro 2018軟件繪圖；用SPSS 17.0軟件進行差異顯著性分析，數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用Duncan’s統(tǒng)計分析，P<0.05表明差異顯著，P<0.01表示差異極顯著；用Design-Expert 8.0軟件進行響應(yīng)面設(shè)計與方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 電場強度對甘薯愈傷的影響

木質(zhì)素是創(chuàng)傷次生周皮的主要組成物質(zhì)，其含量的合成和積累反映植物細胞壁木質(zhì)化的進程[22]。由圖1可知，不同強度的高壓靜電場處理對甘薯損傷部位木質(zhì)素含量的影響不同， 0～800 kV/m木質(zhì)素含量隨電場強度的增大而升高，800～1 000 kV/m木質(zhì)素含量反而略有降低，這可能是因為過強的電場處理反而削弱木質(zhì)素的合成代謝。800 kV/m電場強度下，甘薯損傷部位的木質(zhì)素含量顯著高于其他處理組(P<0.05)，表明常溫下電場強度達800 kV/m時利于甘薯的愈傷，且較高溫處理具有更好的愈傷效果。

2.1.2 處理時間對甘薯愈傷的影響

由圖1可見，電場處理時間長短影響甘薯損傷部位木質(zhì)素的合成量。從0～12 h，木質(zhì)素含量隨時間的增加而上升；從12～20 h，木質(zhì)素含量隨時間的增加略有下降，這說明過長的電場處理時間反而會減弱木質(zhì)素的合成，推測可能是因為電場強度對木質(zhì)素合成代謝相關(guān)酶活性的影響存在閾值，超過一定強度會改變相關(guān)酶的功能，導(dǎo)致木質(zhì)素合成量減少，其具體機理有待更深入的研究。處理12 h時甘薯損傷部位的木質(zhì)素含量顯著高于其他處理組(P<0.05)，表明處理時間為12 h利于甘薯愈傷組織的形成。

2.1.3 處理溫度對甘薯愈傷的影響

由圖1可知，電場作用溫度不同，甘薯損傷部位木質(zhì)素的合成量亦有所不同。隨溫度增加，木質(zhì)素含量呈先上升后下降的趨勢。10～25 ℃木質(zhì)素含量顯著增加(P<0.05)，25～35 ℃的電場作用下，木質(zhì)素含量顯著降低(P<0.05)，推斷可能是溫度過高會導(dǎo)致合成木質(zhì)素的一些酚類前體物質(zhì)氧化速度加快，從而造成合成量減少。25 ℃下電場處理甘薯愈傷部位的木質(zhì)素含量最高，且與其他溫度下處理均差異顯著(P<0.05)，表明處理溫度為25 ℃時利于甘薯愈傷組織的形成。

注：圖中相同字母表示不同條件之間無顯著性差異(P>0.05)；不同字母表示不同條件之間有顯著性差異(P<0.05)。圖1 不同處理條件下甘薯愈傷部位的木質(zhì)素含量

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

響應(yīng)面分析方案及結(jié)果如表2所示。通過多元回歸擬合，得到木質(zhì)素含量對電場強度(A)、作用時間(B)和作用溫度(C)的二次多項回歸模型為：y=4.62+0.11A-0.45B+0.59C+0.17AB+0.082AC-0.24BC-0.66A2-0.53B2-1.12C2。由表3可知，該模型極顯著(P<0.001)，方程失擬項不顯著(P>0.05)，且實驗?zāi)Ｐ偷臎Q定系數(shù)RAdj2為0.950 6，說明該模型擬合程度較好，可用于高壓靜電場促進甘薯的愈傷處理條件的分析與預(yù)測。

表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計與結(jié)果

表3 回歸模型方差分析

由表4可知，模型一次項A差異不顯著，B和C差異極顯著(P<0.01)；交互項AB和BC差異顯著，AC差異不顯著；二次項A2、B2和C2差異均極顯著。各因素的主效應(yīng)關(guān)系為：處理溫度>處理時間>電場強度。由回歸方程模型分析各因素間與響應(yīng)值的交互效應(yīng)，結(jié)果顯示三者兩兩交互作用響應(yīng)面曲線圖均為球形，等高線均為橢圓性，反映三因素兩兩交互作用明顯，且電場強度、處理時間及處理溫度的增加到一定程度時，木質(zhì)素含量反而降低，說明高壓靜電場施加作用過于強烈反而不利于甘薯愈傷組織的形成。

表4 回歸模型系數(shù)顯著性檢驗表

結(jié)合二次回歸模型的分析結(jié)果，得到高壓靜電場促進甘薯愈傷的最佳處理參數(shù)為：電場強度為808.5 kV/m、處理時間為10.1 h、作用溫度為26.6 ℃，在此條件下獲得甘薯損傷部位木質(zhì)素質(zhì)量分數(shù)的理論值為4.83%。為檢驗優(yōu)化結(jié)果的可靠性，同時考慮實際操作方便性，將各參數(shù)修正為：電場強度為800 kV/m、處理時間為10.0 h、作用溫度為26.0 ℃，在此條件下進行愈傷處理，木質(zhì)素質(zhì)量分數(shù)為4.82%，與理論值僅相差0.2%，說明該模型可靠，經(jīng)優(yōu)化得到的電場處理條件可靠。

2.3 電場處理對甘薯愈傷的促進作用

2.3.1 間苯二酚染色情況

間苯三酚染色染色區(qū)域越大、顏色越深表明甘薯切面愈合程度越高[23]。染色結(jié)果顯示，愈傷期間，靜電場處理和高溫處理組的甘薯切口處染色后顏色均比對照處理組的深，愈傷4 d后，甘薯切面?zhèn)谟铣潭让黠@好于對照組。在愈傷1、2 d，靜電場處理組甘薯傷口處的染色深度和染色面積均比高溫處理組更為明顯，反映出愈傷前期靜電場處理更快地誘導(dǎo)木質(zhì)素的生成。

2.3.2 相對電導(dǎo)率的變化

細胞膜透性是評價細胞組織完整性的重要指標[24]，細胞膜透性的大小可用相對電導(dǎo)率衡量；相對電導(dǎo)率越大，表示電解質(zhì)的滲透量越多，細胞膜完整性遭到破壞的程度就越大。由圖2可知，甘薯切口部位的相對電導(dǎo)率總體呈上升的變化趨勢，高溫處理組和電場處理組的上升幅度與上升速度均顯著低于對照組(P<0.05)。愈傷4 d后，高溫處理組和電場處理組的甘薯細胞膜透率分別為4.0%和3.5%左右，顯著低于對照組(P<0.05)，兩組之間無顯著性差異(P>0.05)。可見，高溫處理和電場處理促進了傷口愈合的速度，從而大大減輕損傷給甘薯帶來的細胞物質(zhì)交換失衡現(xiàn)象，緩解細胞液滲漏現(xiàn)象。

注：圖中相同字母表示同一時間下不同條件之間無顯著性差異(P>0.05)；不同字母表示同一時間下不同條件之間有顯著性差異(P<0.05),下同。圖2 愈傷期間損傷甘薯相對電導(dǎo)率的變化

2.3.3 丙二醛含量的變化

丙二醛(MDA)是膜脂過氧化作用的最終產(chǎn)物，也是衡量細胞膜膜透性的重要指標之一[25]。由圖3可知，機械損傷造成甘薯細胞結(jié)構(gòu)的破壞，使得膜脂的過氧化作用加劇，MDA含量上升。甘薯損傷1 d時，對照組、高溫處理組和電場處理組的MDA含量分別增加4.4倍、4.6倍和3.8倍，3個處理間無顯著差異(P>0.05)。但隨著愈傷時間延長，電場處理組的MDA含量則明顯低于對照組和高溫處理組(P<0.05)。對照組傷口愈合速度慢，使得受損細胞的膜脂過氧化作用時間也增加；而高溫處理雖然傷口可以得到較好愈合，但是高溫下會加速過氧化反應(yīng)的速度。實驗結(jié)果表明，電場處理能抑制因機械損傷導(dǎo)致的膜脂過氧化反應(yīng)，減少膜脂過氧化物的積累，使MDA含量在愈傷期間維持在較低水平。

圖3 愈傷期間損傷甘薯MDA含量變化情況

3 討論

木質(zhì)素作為植物細胞壁的主要成分之一，其含量高低反映細胞壁木質(zhì)化程度，與植物抗病性密切相關(guān)[26]。綜合本研究結(jié)果進行分析，不同電場愈傷條件對甘薯受損部位木質(zhì)素的積累表現(xiàn)出不同的影響，電場強度為800 kV/m、處理時間為10.0 h和處理溫度為26.0 ℃時表現(xiàn)出更高的木質(zhì)素的生長速率和合成量，且對受損細胞膜的修復(fù)能力更為明顯。通過外源處理促進愈傷組織的木質(zhì)素大量積累，加速細胞壁木栓化，可以提高受損組織的愈傷效果，本研究與王連平等[4]研究結(jié)果相類似。丹陽等[27]、岑劍偉等[28]的研究也表明高壓靜電場處理能更好地維持黃瓜、羅非魚貯藏期間細胞的完整性，減緩品質(zhì)的劣變速度。因此，選擇合適的高壓靜電場處理參數(shù)對提高甘薯采后愈傷效應(yīng)具有重要意義。木質(zhì)素的合成與植物體的苯丙烷代謝密切相關(guān)[29]，通過誘導(dǎo)調(diào)節(jié)苯丙烷代謝中PAL、C4H和4CL等關(guān)鍵酶的活性和基因表達，可增加木質(zhì)素及其他抗菌物質(zhì)的合成[30-32]，抑制病原菌侵染。已有研究表明一定劑量的高壓靜電場處理可提高植物組織的SOD酶活性、降低POD酶和IAA氧化酶活性，誘導(dǎo)植物愈傷組織的生長和形成[18，19]。由此，可推測高壓靜電場處理可能通過增強甘薯愈傷組織苯丙烷代謝促進木質(zhì)素的沉積，但其對木質(zhì)素積累的生物學(xué)調(diào)控機制尚不清楚，有待進一步研究。

4 結(jié)論

通過比較對照、高溫處理與高壓靜電場處理對機械損傷甘薯切口部位木質(zhì)素合成的影響，發(fā)現(xiàn)高壓靜電場處理具有促進甘薯采后愈傷的潛在效應(yīng)。本實驗在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化電場處理參數(shù)，探究適宜的電場強度、處理時間和處理溫度，對促進甘薯采后愈傷作用具有指導(dǎo)意義。結(jié)果表明，高壓靜電場處理的最佳處理參數(shù)為：電場強度為800 kV/m、處理時間為10.0 h、作用溫度為26.0 ℃，在此條件下進行愈傷處理，木質(zhì)素合成含量較高。同時，在愈傷期間，高壓靜電場處理組受損薯塊的相對電導(dǎo)率和MDA含量均低于對照組；且較高溫處理相比，高壓靜電場處理作用下可降低膜脂過氧化程度。表明適宜的電場處理可在一定程度上減輕機械損傷對細胞組織帶來的傷害，保護細胞膜的完整性，促進甘薯愈傷，從而增強甘薯貯藏期間的抗病性。