復合菌系發(fā)酵改性對豆渣膳食纖維結構及物化特性的影響

張艷莉 王 穎,2 王 迪 佐兆杭劉淑婷 張 裕 李志芳

(黑龍江八一農墾大學食品學院1， 大慶 163319)(國家雜糧工程技術研究中心，糧食副產物加工與利用教育部工程研究中心，黑龍江省農產品加工與質量安全重點實驗室2，大慶 163319)

豆渣是常見的食品加工副產物，常被當做飼料或廢棄物丟棄。最常見的豆渣原料為大豆，近些年來因雜豆加工業(yè)得到重視，以蕓豆、紅豆、綠豆等為主的雜豆豆渣被作為研究對象。蕓豆是我國主要的小宗雜豆之一，作為黑龍江[1]主產雜糧之一，成為飲料[2]、豆沙[3]等食品的加工原料。

豆渣中富含膳食纖維(DF)[4]，按其溶解性可分為可溶性膳食纖維(SDF)和不可溶性膳食纖維(IDF)。研究表明，DF中SDF含量超過10%的可稱為優(yōu)質膳食纖維[5]。改性能夠較好地改善、提高DF的物化特性。DF的物化特性直接決定其功能價值，因其較好的持水力、持油性起到控制體重、預防肥胖癥[6]的功效；較好的吸附性[7]、離子交換能力[8]能夠降血糖、血脂[9]進而預防糖尿病[10]、心血管疾病[11]等營養(yǎng)慢性??；特有的發(fā)酵性、溶解性能夠改善腸道菌群[12]。改性常作為提高DF中SDF含量的手段，常見的改性方法包括以酸堿法為主的化學改性[13]；以雙螺桿擠壓[14]、超微粉碎[15]為主的物理改性；以酶法[16]、發(fā)酵[17]為主的生物改性及聯(lián)合兩種單一改性方法的復合改性法。發(fā)酵改性可提高DF中SDF的含量，亦可增加這些可溶性成分原本不存在的功能性質，或增強已經存在的弱功能性質[18]。研究表明植物乳桿菌[19]、嗜酸鏈球菌[20]、雙歧桿菌[21]、鼠李糖乳桿菌[22]能產生多種生物活性酶，具有提高DF中可溶性成分含量的功能，植物乳桿菌是活性最強的纖維素酶菌株之一，其中纖維素酶對IDF有顯著的降解作用。復合菌系[23]能夠更好地提高SDF的含量并改善DF的功能特性，目前研究常以單一菌種進行發(fā)酵改性，復合菌系發(fā)酵鮮有研究。

本研究利用復合菌系對豆渣進行發(fā)酵，提取發(fā)酵膳食纖維(FDF)并分離發(fā)酵可溶性膳食纖維(FSDF)和發(fā)酵不可溶性膳食纖維(FIDF)，通過響應面試驗確定最佳發(fā)酵提取工藝，并探究改性前后的FSDF和FIDF基本結構及物化特性，旨在為蕓豆膳食纖維的功能性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種、材料與試劑

植物乳桿菌LactobaciLLuspLantarumCGMCC 1.569、嗜酸鏈球菌StreptococcusacidophiLusCGMCC 1.2919、雙歧桿菌BifidobacteriumCGMCC 1.5090、鼠李糖乳桿菌LactobaciLLusrhamnosusCGMCC 1.576；奶白花蕓豆豆渣；95%乙醇、氫氧化鈉、鹽酸、水楊酸、亞硝酸鈉、膽固醇等均為分析純；堿性蛋白酶(酶活200 000 U/g)、耐高溫α-淀粉酶(酶活200 000 U/mL)。

1.2 儀器與設備

LABSJB-450型數(shù)顯型實驗室攪拌機，DL-360B型超聲波清洗機，C-04B型高速超微粉碎機，DGG-9140A型電熱恒溫干燥箱，LMQ.C-50E型高壓滅菌鍋，LHS-350HC型恒溫培養(yǎng)箱，JIDI-18D型臺式多用途高速離心機，F(xiàn)TIR-1500型傅里葉變換紅外光譜儀，UV759型紫外分光光度計，SU7000型掃描電鏡.

1.3 菌種活化與培養(yǎng)基制備

菌種活化：取植物乳桿菌、嗜酸鏈球菌、雙歧桿菌和鼠李糖乳桿菌(1∶1∶1∶1混合菌種)接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)(培養(yǎng)基采用高壓濕熱滅菌121 ℃、15 min，接種量是從固體培養(yǎng)基里取2環(huán)到3環(huán)至液體培養(yǎng)基)，于37 ℃條件培養(yǎng)24 h，用菌落總數(shù)計數(shù)法，使菌數(shù)含量>1×107CFU/mL[11]，即為培養(yǎng)基發(fā)酵調節(jié)。

培養(yǎng)基制備：取預處理的豆渣粉，按料液比加脫脂奶粉2%、白砂糖1.5%，料液攪拌、混合均勻，調節(jié)pH后滅菌后，接菌發(fā)酵后提取DF。

1.4 響應面優(yōu)化膳食纖維制備工藝

脫脂豆渣→接菌發(fā)酵→熱水(70 ℃)漂洗至中性→烘干→超微粉碎→酶解脫蛋白去淀粉→控溫

1.5 IDF持水力、持油力、膨脹力測定

稱取0.5 g樣品計m1于50 mL離心管中，加入30 mL蒸餾水，攪拌30 min后靜置1 h，4 000 r/min，離心10 min，傾倒出上清液，用濾紙吸干離心管壁殘留水分，殘渣計m2，按式(1)計算持水力。稱取0.5 g樣品計m1于50 mL離心管中，加入30 mL食用油，攪拌30 min后靜置1 h，4 000 r/min，離心10 min，傾倒出上清液，用濾紙吸干離心管壁殘留油滴，殘渣計m2，按式(2)計算持油力。稱取1.0 g樣品mo于10 mL量筒中測定其初始體積V1，加入足量蒸餾水，振蕩均勻，室溫下靜置18 h后觀察量筒中物料的自由膨脹體積V2，按式(3)計算其膨脹力。

(1)

式中：m1為樣品質量/g，m2為殘渣質量/g。

(2)

其中m1為樣品質量/g，m2為殘渣質量/g。

(3)

其中V1為初始體積，V2為膨脹后體積/mL，m0為樣品質量/g。

1.6 IDF吸附能力測定

稱取0.5 g樣品于錐形瓶中，加入膽酸溶液20 mL，37 ℃水浴振搖2 h，4 000 r/min，15 min。準確量取上清液1.0 mL測定殘余膽酸的量，根據反應前后的濃度差別計算吸附量，按式(4)計算。稱取1.0 g樣品于250 mL的三角瓶中，加入0.1 mg/mL的膽固醇溶液100 mL，調節(jié)體系pH值至2.0和7.0，置搖床中，37 ℃振蕩，反應一段時間4 000 r/min下離心20 min，吸取0.4 mL上清液，采用鄰苯二甲醛法測定膽固醇含量，按式(5)計算。

(4)

式中：n1為吸附前膽汁酸的量，n2為吸附后膽汁酸的量，m1為樣品質量/g。

(5)

式中：n1為吸附前膽汁酸的量，n2為吸附后膽汁酸的量，m1為樣品質量/g。

1.7 IDF離子交換能力測定

稱取干燥樣品，用0.1 mol/L HCl進行酸化處理，之后用蒸餾水清洗，用AgNO3溶液滴定去除氯離子，干燥。將干燥后樣品均勻分散于15% NaCl溶液中，以酚酞作指示劑，用0.02 mo1/L NaOH溶液滴定微紅時停止，搖勻再滴直至不再變色。記錄消耗NaOH的體積V，按式(6)計算其陽離子交換能力(CEC)。確稱取0.5 g樣品于250 mL錐形瓶中，加入濃度100 μmol/L的NaNO2溶液100 mL，調節(jié)體系pH至2.0和7.0，于37 ℃下恒溫磁力攪拌，反應一定時間，準確移取0.1 mL樣液，之后加入2 mL 0.4%氨基苯磺酸，靜置5 min后再加入1 mL 0.2%鹽酸萘乙二胺，顯色穩(wěn)定后在分光廣度計上測538 nm處吸光度，按式(7)計算其陰離子交換能力(AEC)[24]。

(6)

式中：CNaOH為NaOH濃度；V為消耗NaOH的體積；m為樣品質量/g。

(7)

式中：n1為吸附前NO2-的量，n2為吸附后NO2-的量，m為樣品質量/g。

1.8 SDF抗氧化能力測定

配制9 mmoL/L水楊酸-乙醇，9 mmoL/L FeSO4溶液，8.8 mmoL/L的H2O2溶液，按順序加入到試管中，在37 ℃溫育30 min，于510 nm處測吸光值。每個濃度組平行測定3次，求其平均值，測定清除·OH的能力，測定結果以清除率表示，按式(8)計算。ABTS溶于水中配成7 mmoL/L的ABTS溶液，該溶液與2.45 mmoL/L過硫酸鉀在室溫下避光反應12 h，后用pH 7.4，0.2 mmoL/L的PBS稀釋60倍。在2.5 mL不同濃度的可溶性膳食纖維溶液中加入2 mL ABTS溶液，避光反應6 min，以蒸餾水為空白，在734 nm波長下測定其吸光度Asample。同時測定2.5 mL蒸餾水與2.0 mL ABTS溶液的吸光度(Acontrol)，計算清除率，按式(9)計算[25]。

(8)

式中：AX為樣品吸光度值，A0為模型對照組的吸光度值，AX0為模型對照組的吸光度值。

(9)

式中：Acontrol為模型對照組的吸光度值，Asample為樣品吸光度值，Aj為模型對照組的吸光度值。

1.9 DF的顯微結構測定

掃描電鏡(SEM)研究方法[26]：試樣干燥至恒重，取少量用雙面膠固定在樣品座上，表面噴金處理后進行電鏡觀察并拍照。電鏡掃描條件：電壓15 kV，放大倍數(shù)1 000、2 500倍。

1.10 DF的紅外光譜測定

傅里葉紅外光譜(FTIR)的測定方法[27]：取1～2 mg干燥至恒重的DF于研缽中，加入100 mg左右的干燥的光譜純嗅化鉀，研磨混勻至細微的粉末狀，裝入并使其均勻平鋪于壓片模具中，抽氣加壓，保持3 min左右，將制成的透明薄片迅速放入儀器進行分析掃描，掃描次數(shù)：32次，分辨率：4 cm-1，掃描范圍：500～4 000 cm-1。

1.11 數(shù)據統(tǒng)計與分析

數(shù)據以平均值±標準偏差(SD)表示，并通過t檢驗和Tukey-Kramer的進行多重比較測試，SPSS 20和Origin 8.0軟件進行數(shù)據分析及圖表繪制。

2 結果與討論

2.1 發(fā)酵前后膳食纖維含量

由表1可看出發(fā)酵后的蕓豆豆渣IDF含量較未發(fā)酵的蕓豆豆渣降低了2%，發(fā)酵后的蕓豆豆渣SDF含量較未發(fā)酵的蕓豆豆渣提高了11.84%，發(fā)酵后DF質量分數(shù)提高了2.81%。發(fā)酵過程中利用細菌等微生物，消耗原料中的碳源、氮源，以消除原料中的植酸，減少蛋白質、淀粉等成分，最后得到膳食纖維。植物乳桿菌等菌類會在發(fā)酵過程中產生半纖維素酶等酶類物質，從而將IDF中的大分子物質轉化成SDF中的小分子單糖類物質。

表1 發(fā)酵前后豆渣膳食纖維質量分數(shù)

2.2 IDF持水力、持油力、膨脹力

由表2可知，經過發(fā)酵改性處理后的IDF持水力、持油力和膨脹力都有顯著改善，F(xiàn)IDF的持水力較未改性提高了2倍，F(xiàn)IDF的持油力較未改性提高了6倍，改性后IDF的膨脹力較未改性提高了1.9倍。經改性后的IDF，其分子間有大部分極性和非極性基團暴露出來，改變了其與水和油的相互作用[28]，因此FIDF的持水力及持油力顯著提高。

表2 發(fā)酵前后IDF持水力、持油力及膨脹力

2.3 IDF吸附能力

由圖1可知，F(xiàn)IDF吸附膽酸鈉能力顯著優(yōu)于未處理的IDF，隨吸附時間增加，發(fā)酵前后IDF的吸附能力都在升高，這是因為IDF表面有很多活性基團，能吸附鰲合膽汁酸等有機化合物。腸腔內，IDF與膽汁酸可能是通過靜電力、氫鍵力或疏水鍵間的相互作用，其中氫鍵力結合也許是主要的作用形式[18]。圖2可看出，在不同pH環(huán)境下，F(xiàn)IDF對膽固醇的吸附能力都顯著高于未處理的IDF，pH 2條件下IDF對膽固醇吸附能力優(yōu)于pH 7條件下，pH 2條件下FIDF對膽固醇吸附能力顯著優(yōu)于pH 7條件下。說明IDF對膽固醇的吸附作用除了物理作用以外還表現(xiàn)出一定的化學吸附。FIDF粒徑減小，吸附表面積增大，吸附效果變好，粒徑變化還會影響到膽固醇分子滲入纖維其內部的路徑長度[29]。

圖1 發(fā)酵前后IDF吸附膽酸鈉能力

圖2 發(fā)酵前后IDF吸附膽固醇能力

2.4 IDF離子交換能力

由圖3可知，發(fā)酵前后的IDF在pH 2時對陰離子的吸附能力皆顯著高于在pH 7時，在pH 2的條件下發(fā)酵前后的IDF的吸附能力較強，大約在吸附后3 h，2種pH條件下IDF的吸附均基本達到飽和。圖4可看出發(fā)酵改性前后IDF對陽離子交換能力均有影響，且皆成上升趨勢，F(xiàn)IDF陽離子交換能力明顯高于IDF，因為豆渣膳食纖維結構中的一些羥基側鏈基團和羧基基團可以通過和腸道內有機陽離子進行可逆性的交換，不但能使之隨食物殘渣排出，而且可以改變離子的瞬間濃度，在起到稀釋作用的同時延緩了它們轉換的時間，從而造成腸道內氧化還原電位、滲透壓以及pH值發(fā)生改變，形成一個更易于吸收的緩沖環(huán)境[30]。

圖3 發(fā)酵前后IDF陰離子交換能力

圖4 發(fā)酵前后IDF陽離子交換能力

2.5 SDF抗氧化能力

圖5可看出，豆渣SDF對·OH有一定的清除能力，發(fā)酵后的SDF對·OH的清除能力明顯增強，這可能是因為發(fā)酵豆渣SDF后多糖的一級結構上的部分羥基被硫酸基取代后影響多糖對·OH清除力，也可能是取代的硫酸基影響了多糖空間結構或支鏈類型，從而增加了其清除·OH能力。豆渣SDF對ABTS有一定的清除能力，直接提取的SDF清除能力在SDF濃度達到20 mg/mL時被抑制，開始下降，F(xiàn)SDF的清除能力顯著優(yōu)于直接提取的。因為豆渣SDF

圖5 發(fā)酵前后SDF抗氧化能力

組成成分為多糖類物質，由于多糖分子構象中羥基包裹于分子內部，大部分為分子內強鍵，因此直接提取的SDF對ABTS有一定的清除作用但清除力有限，F(xiàn)SDF由于引入了硫酸基，多糖分子空間非共價鍵重新分布，糖鏈及空間結構舒展，較多羥基被暴露在外面，此外，硫酸基的存在也使得多糖分子極性增強，因此對ABTS清除力增大[6]。

2.6 DF微觀結構

由圖6a、圖6b可看出FIDF空間結構明顯發(fā)生改變，由原來的致密狀態(tài)變成松散的空間結構，圖6c、圖6d可以看出與直接提取的SDF相比，F(xiàn)SDF表面褶皺更明顯，結構疏松，帶有明顯的片狀結，其原因可能IDF經改性后，大分子物質發(fā)生降解，分子鏈被切斷，分子量相對降低，使得聚合度下降，顆粒變小，微觀結構和分子大小發(fā)生了變化。由圖6e、圖6f可看出，經發(fā)酵后豆渣，SDF含量明顯提高，可能因為發(fā)酵過程中產酶的作用，其結構形態(tài)與直接提取的SDF不同，由圖6g、圖6f FSDF顆粒明顯較小，形狀不規(guī)則、結構緊簇且呈密集的蜂窩狀，直接提取的SDF顆粒較大，形狀規(guī)則，呈松散的蜂窩狀結構，說明發(fā)酵過程能使SDF的微觀結構和分子大小發(fā)生改變。這可能是因為發(fā)酵過程復合菌種會產生纖維素酶、半纖維素酶等酶類物質，使DF內部發(fā)生水解作用，導致IDF轉換成SDF，豆渣中原有SDF的直鏈和支鏈結構被纖維素酶等酶類水解，使得分子質量下降，聚合度降低，顆粒變小[31]。

圖6 發(fā)酵前后IDF、SDF掃描電鏡圖

2.7 DF紅外光譜圖

由圖7可看出發(fā)酵前后的IDF各組分吸收峰無明顯差別，在3 500～3 400 cm-1和2 900～2 800 cm-1附近分別出現(xiàn)纖維素和半纖維素分子內或分子間羥基、亞甲基相應的伸縮振動峰，1 200～1 000 cm-1處為纖維素、半纖維素C—O—C基的伸縮振動，可表明IDF主要由纖維素、半纖維素和木質素組成。說明發(fā)酵產生的纖維素酶對樣品中的纖維素和半纖維素起到了一定的水解作用，并且促進了羥基基團的暴露[32]。發(fā)酵前后的SDF紅外光譜圖大致相同，為典型的多糖特征紅外圖譜，在3 500 cm-1左右吸收峰更寬更強，表明處于締合狀態(tài)的氫鍵較多，在1 700 cm-1的吸收峰是羰基吸收峰，存在糖醛酸，在900 cm-1處有弱小尖峰，是β-吡喃糖C—H變角振動的特征吸收峰，在750～674 cm-1附近出現(xiàn)的弱的吸收峰，表明多糖中存在α-D-吡喃木糖[26, 33]，可推斷豆渣SDF很可能含有酸性多糖或氨基多糖，并同時由β-D-吡喃葡萄糖，β-D-半乳糖，D-脫氧鼠李糖等成分組成。

圖7 發(fā)酵前后IDF、SDF紅外光譜圖

3 結論

采用發(fā)酵法制備豆渣膳食纖維，結果表明，發(fā)酵改性能顯著提高豆渣中SDF含量；發(fā)酵后DF的微觀結構顯著改善，且具備IDF及SDF特有的組分；FIDF的物化特性顯著提高，發(fā)酵后SDF的抗氧化能力較好，發(fā)酵能夠較好地改善DF的表征結構并提高其物化特性。