兼具水稻紋枯病拮抗功能的生物水稻育苗基質效果研究①

戚秀秀，魏 暢，張林利，劉曉丹，楊艷霞，姜 瑛*，馬 超

兼具水稻紋枯病拮抗功能的生物水稻育苗基質效果研究①

戚秀秀1，魏 暢1，張林利1，劉曉丹1，楊艷霞2，姜 瑛1*，馬 超3*

(1 河南農業大學資源與環境學院，鄭州 450002；2 西平縣農業技術推廣中心，河南西平 463900；3安徽農業大學資源與環境學院，農田生態保育與污染防控安徽省重點實驗室，合肥 230036)

水稻紋枯病是水稻上常見的土傳病害之一，為了研發出可防治水稻紋枯病兼具促生效果的功能型生物水稻育苗基質，本研究選用前期篩選出具有固氮解磷功能的根際促生菌：LY5枯草芽孢桿菌()、LY11解淀粉芽孢桿菌()、X2摩拉維亞假單胞菌()、X3沙芬西芽孢桿菌()、X8綠針假單胞菌()，首先探索該5株促生菌對水稻紋枯病病原菌的抑菌率，再將其與水稻紋枯病病原菌混合，在實驗室已篩選出的最適配比基質基礎上，研發功能型生物水稻育苗基質。在盆栽條件下，與市售水稻育苗基質對比，驗證功能型生物水稻育苗基質對水稻紋枯病發病率、水稻幼苗生長和體內抗性相關酶類的影響。結果表明：①5株根際促生菌對水稻紋枯病病原菌均具有拮抗作用，抑菌率達到35.31% ～ 40.20%。②5株拮抗促生菌能夠降低水稻紋枯病的發病率，其中添加LY11菌株的處理較對照處理的每盤出苗數顯著增加了110.41%，而發病率顯著降低了89.32%。③在含有水稻紋枯病病原菌的育苗基質中添加拮抗促生菌后，水稻幼苗的莖粗、百株地下部干物質重、百株全株干物質重、根系活力、根總表面積、根平均直徑、根總體積、根尖數等方面均有所提高，其中添加LY11菌株的處理比市售水稻育苗基質處理分別顯著提高3.13%、4.21%、4.97%、68.02%、26.77%、16.67%、44.44%、7.82%。④添加拮抗促生菌顯著促進了水稻幼苗對地上和地下部氮磷鉀的吸收。⑤水稻幼苗體內超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶的活性以及丙二醛的含量均顯著高于市售水稻育苗基質處理，提高幅度為27.08% ～ 122.72%、16.09% ～ 48.15%、53.33% ～ 233.85%、110.24% ～ 511.71%。因此，本研究研發出5種對水稻紋枯病具有較好的拮抗效果，同時可以顯著促進水稻幼苗生長的功能型高效生物水稻育苗基質，其中添加了菌株LY11的育苗基質綜合效果最優，為功能型高效生物水稻育苗基質的研制與應用奠定了理論與實踐基礎。

水稻紋枯病；拮抗促生菌；育苗基質；根系活力；酶活性

水稻是我國主要的種植作物之一[1]。近年來，隨著農業科技的進步和機械化生產的發展，我國水稻生產效率不斷提高，水稻生產中面臨的問題也日益突出，除了育苗過程取土困難以及育苗技術不完善外，水稻病害也日益加劇，其中水稻紋枯病在我國的發生最為廣泛[2]，導致我國水稻產量和品質下降。

水稻紋枯病是由立枯絲核菌()侵染引起的一種病害，大多發生在高溫、多雨的氣候條件下，是主要的土傳病害之一[3]。病原菌以菌核的形式在土壤中或附著在植株上越冬，春播或插秧后附著于水稻植株近水面的葉鞘部位，在適宜的溫度、濕度等條件下再生菌絲可在水稻葉片或葉鞘表面萌發、生長，然后侵入水稻內部，最后菌絲體在水稻組織內延伸、蔓延[4]；隨著病害的發展，到達水稻根莖周圍，會使根莖的感染部分變黑，最終導致水稻根莖組織壞死，甚至根莖斷裂，造成嚴重的穗枯萎[5]，降低水稻的產量和品質。且當環境濕度較高時，白蜘蛛絲狀菌絲體會出現在感染部位，并逐漸聚集成簇，終形成新的蘿卜種子狀菌核[6]。此外，真菌細胞在生長和分化之間的過渡時期會產生·OH、O2–·、1O2、H2O2和其他活性氧，用來削減水稻體內抗氧化作用。當細胞內活性氧過度積累，可形成菌核，抵抗活性氧的毒性，保持真菌的活力[7]，同時當水稻體內的活性氧含量過高會對植物本身產生危害，SOD、CAT、POD等抗氧化酶可以水解H2O2，降低活性氧的含量，維持植物體內的活性氧產生與清除之間的平衡[8]，降低真菌的活力，提高水稻的抗病性。

現今植物病害主要防治方式仍然是化學農藥，而化肥、農藥的大量施用對病害的防治、作物產量的提高雖然起到了重要的作用，但同時也帶來了諸多生態問題[9]。近兩年利用有益微生物進行生物防治的相關研究逐漸成為植物保護領域的研究熱點之一，例如研發兼具促生及生防功能的高效生物育苗基質[10]。研究發現植物根際促生菌在促進植物生長發育、防治病害、改良土壤微生物生態環境等方面十分重要，可部分替代化肥、農藥[11]，降低有害成分對環境及人類健康造成的危害，實現農業的可持續發展。

植物根際促生菌(plant growth promoting rhizoba-cteria，PGPR)是指生存于植物根圈范圍內的土壤中或植株根系表層能夠促進植物生長、防治病害、增加作物產量的有益細菌的統稱[12-13]。研究發現根際促生菌能夠改變土壤中難溶性元素的形態，合成植物生長素，同時防止淋失來提高根際周圍養分的生物有效性(如固氮、解磷等)，從而促進植物對養分的吸收[14]，同時還能夠在土壤中大量繁殖，與有害微生物產生競爭，并產生次生代謝產物[15-16]抑制病原菌菌絲、寄生病原菌菌絲生長，誘導水稻產生抗性以及定植在水稻莖稈上減少菌絲對葉鞘的侵染等[17-18]。目前已有相關研究將根際促生菌與育苗基質相結合，從而制成兼具促生及生防功能的水稻育苗基質，如張揚等[10]和文春燕等[18]從西瓜和辣椒根際分離得到的根際促生菌可產吲哚乙酸(IAA)和NH3且對尖孢鐮刀菌和茄科勞爾氏菌均有生防效果，與普通育苗基質相結合而制成生物育苗基質在苗期及移栽至大田后均可明顯促進黃瓜、番茄、辣椒等秧苗的生長。但針對水稻的功能型生物育苗基質的研究還未見報道，故本研究將在前人的研究基礎上對可防治水稻紋枯病兼具促生效果的功能型生物水稻育苗基質進行探索，并為其在農業上的應用提供理論與實踐基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試基質和稻種 基質為本實驗室前期篩選出的優勢配比水稻育苗基質[19]，即(酒糟+秸稈)堆肥60%+蛭石30%+珍珠巖10%，以1.5% 的硫酸水溶液調節至pH 5.0左右。水稻種子是由廣西恒茂農業科技有限公司提供，品種為兩優1號。

1.1.2 供試菌株 菌株為本實驗室前期篩選出的具有固氮解磷能力的菌株，分別為：LY5枯草芽孢桿菌()，LY11解淀粉芽孢桿菌()，X2摩拉維亞假單胞菌()，X3沙芬西芽孢桿菌()，X8綠針假單胞菌()，水稻紋枯病病原菌由河南農業大學植保學院提供。

1.1.3 LB 培養基 蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，去離子水1 000 ml，pH 7.2 ～ 7.4，121 ℃ 高壓滅菌20 min。

1.2 試驗設計

水稻催芽：室內晾曬2 ～ 3 d的水稻種，用20% 鹽水選種，去除秕子及雜物，清水洗去種子表面的鹽分。水浸催芽，定期換水。待種子吸水膨脹出芽2 mm時，攤晾，備用。

拮抗促生菌懸液的制備：將已活化的拮抗促生菌接種于LB液體培養基，30 ℃、170 r/min振蕩培養36 h，4 000 r/min離心10 min，用無菌水重懸–離心洗滌3次后，重懸于無菌水中，調節其濃度為108/ml。

病原菌懸液的制備：將已經活化的病原菌接種于PDA平板上，28 ℃ 靜置培養5 d，待菌絲布滿平板用無菌涂布棒將菌絲刮下并充分攪碎，用無菌水調節其濃度為105/ml。

本試驗分別設置以下7個處理，T1(最適配比基質+病原菌)、T2(最適配比基質+菌LY5+病原菌)、T3(最適配比基質+菌LY11+病原菌)、T4(最適配比基質+菌X2+病原菌)、T5(最適配比基質+菌X3+病原菌)、T6(最適配比基質+菌X8+病原菌)、T7(普通商品基質+病原菌)，將菌懸液等量均勻噴灑于相應處理中，每盤50 ml，對照處理噴灑等量無菌水；3 d后噴灑病原菌懸液于相應處理中，每盤80 ml，每個處理重復3次。按照常規生產方式裝盤育苗，均勻撒種。用育苗盤為580 mm′280 mm′30 mm帶孔育苗盤，將基質均勻平鋪于盤中，每盤播種芽谷130 g，均勻噴水保持基質含水量達到飽和狀態并維持厚度約3 cm播種后覆土，覆土厚度0.11 cm。濕潤覆土后覆膜保溫保濕。各處理隨機擺放，保持生長環境一致。生長第22天采樣。

1.3 測試指標與測定方法

1)采用平板對峙法確定5株根際促生菌對水稻紋枯病病原菌的抑菌率。挑取5株促生菌落于LB培養基進行純化，后用無菌涂布器均勻涂于PDA培養基培養待用，取已活化的病原菌接于PDA平板中央，28 ℃ 培養24 h，采用對峙法將該5株根際促生菌的菌株點接在距病原菌菌片20 mm處，每皿接種1個菌株，對稱放于兩側。同時設對照(不接菌)，28 ℃ 培養6 d。每個梯度設3個重復。

抑菌率(%)=(對照病原菌直徑–與拮抗菌對峙的病原菌直徑)/對照病原菌直徑′100%

2)植株農藝性狀：株高、莖粗用直尺測量；地上地下部干重采用烘干法測定；壯苗指數= 莖粗/株高′全株干重。

3)根系測定：根系總長、根系總面積、根系平均直徑、根系總體積和根尖總數用根系掃描儀(EPSON EXPERSSION 1680型)測定；根系活力的測定采用Leagene植物根系活力定性檢測液(TTC法)檢測[20]；SPAD值采用SPAD-502葉綠素儀測定。

4)植株氮磷鉀含量測定參照《土壤農化分析》[21]：用濃硫酸-H2O2消煮，分別用凱氏定氮法、鉬藍比色法和火焰光度計法測定氮磷鉀的含量。

5)植株超氧化物歧化酶(SOD)測定參考Fridovich[22]方法，過氧化物酶(POD)測定參考Liang 等[23]方法，過氧化氫酶(CAT)測定參考Aebi[24]方法，丙二醛(MDA)酶活性采用南京建成生物工程研究所提供的酶試劑盒進行測定。

1.4 數據處理及分析

采用Excel 2003和 Origin 8.5軟件進行數據計算及作圖；采用IBM SPSS Statistics 20進行數據統計分析，LSD和Duncan法進行差異顯著性檢驗(< 0.05)；各指標間采用Pearson法進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 五株根際促生菌對水稻紋枯病病原菌的抑菌率

采用平板對峙法確定5株根際促生菌對水稻紋枯病的抑菌率，如表1可知，5株促生菌對水稻紋枯病均有抑制作用，其中LY11的抑菌率最高，與其他4株促生菌相比，提高了1.23%、3.08%、3.85%、4.89%，其次是LY5；X8的抑菌率相對較低，為35.31%。

表1 分離菌株對水稻紋枯病病原菌生長的抑制作用

2.2 不同處理對植株病情防治的效果

從表2可得，不同處理對水稻基質育苗效果影響顯著。T3處理較T1處理的每盤出苗數顯著增加了110.41%，而發病率顯著降低了89.32%；T3處理較T7處理在每盤出苗數、發病率方面雖無顯著差異，但每盤出苗數增加了4.16%，而發病率降低了12.53%。其次是T4處理，在每盤出苗數、發病率方面與T3、T7處理差異均不顯著。

2.3 不同處理對植株農藝性狀及干物質重的影響

不同處理的水稻幼苗的農藝性狀及干物質重見表3。由表3可知，與T1處理相比，其他處理的株高、莖粗、SPAD值、干物質重以及壯苗指數均顯著增加(<0.05)。其中，T2 ～ T7處理的水稻株高比T1處理顯著增加6.43% ～ 13.00%，莖粗比T1處理顯著增加3.97% ～ 17.86%，SPAD值增加了57.71% ～ 121.19%，植株壯苗指數增加了15.73% ～ 19.10%。與T1處理相比，T3、T6處理的植株百株地上部干重、百株地下部干重、百株全株干重分別顯著增加了34.80%、28.81%，7.92%、5.74% 和 25.83%、21.19%。T3處理的莖粗、百株地下部干重、百株全株干重以及T6處理的株高均顯著高于T7市售育苗基質處理(<0.05)。

表2 不同處理對植株病情防治的效果

注：同列小寫字母不同表示處理間差異顯著(<0.05)，下同。

表3 不同處理對植株農藝性狀及干物質重的影響

2.4 不同處理對植株根系的影響

不同處理對植株根系各指標的影響如表4所示。T2 ～ T7處理的植物根系的各指標顯著高于T1處理(<0.05)，增幅分別為36.62% ～ 147.01%、108.52% ～ 216.71%、94.12% ～ 158.82%、10.77% ～ 37.31%、50.00% ～ 133.33%、97.39% ～ 284.92%，且T3處理效果最好，T6處理次之。與T7處理相比，T3、T6處理的根系活力、根系總表面積、根系平均直徑以及根系總體積均顯著增加，增幅分別為16.67% ～ 68.02%、6.21% ～ 66.61%，且T3處理的根尖數顯著高于T7處理。與T2、T4、T5、T6處理相比，T3處理的植物根系各項指標均有所提高，部分指標達到顯著水平。T6處理的植物根系各項指標顯著高于T2處理，根系活力、根系總表面積、根系平均直徑以及根系總體積均顯著高于T4、T5處理。

2.5 不同處理對植株養分含量的影響

不同處理對植株養分含量各指標的影響如圖1所示。植株地上部氮、鉀含量高于地下部，與T1處理相比，T2 ～ T7處理的植株地上和地下部的氮磷鉀含量均增加，且地上部和地下部的氮含量以及地上部磷含量差異達到顯著水平(<0.05)。其中T3處理的植株地上和地下部氮鉀含量最優，T6處理次之，均高于T7處理。與T7處理相比，T3、T6處理植株地上和地下部氮含量分別增加了13.99%、5.66% 和26.21%、12.40%，植株地上和地下部鉀含量分別增加了6.54%、2.69% 和0.13%、0.07%，且T3處理植株地上部氮鉀含量以及T3、T6處理地下部氮含量與T7處理間差異達顯著水平(<0.05)。在植株地上部和地下部磷含量方面，T2、T3、T6處理均顯著高于T7處理，分別提高32.25%、45.75%，49.44%、58.17% 和87.20%、68.88%。

表4 不同處理對植株根系的影響

2.6 不同處理對植株體內酶的影響

不同處理對植株體內酶活性的影響如表5所示，由表可知T1 ～ T6處理的SOD、POD、CAT酶的活性均顯著高于T7處理，提高幅度為27.08% ～ 122.72%、16.09% ～ 48.15%、53.33% ～ 233.85%，且POD、SOD和CAT活性在T3處理最高，并顯著高于其他6個處理，其中POD活性在T1和T4處理之間差異不顯著，T5和T6處理之間差異不顯著。對MDA含量，T1處理為最高，T7處理為最低，與T7處理相比，T1 ～ T6處理的MDA含量增加了1.1 ～ 5.1倍，其中T3處理顯著低于T2、T4、T5，與T6處理差異不顯著。

表5 不同處理對植株體內酶活性的影響

3 討論

近年來，隨著生態農業的不斷發展，關于根際促生菌促進植物生長及防治土傳病害的研究開始被報道[13]。本試驗處理中的5株促生菌對水稻紋枯病均具有較高的抑制率，其中LY11的抑菌率最高，這與盧鈺升[25]等人研究結果相類似。植物根際促生菌不僅能防治病害、改良土壤微生物生態環境，其生長代謝活動也能促進或調節植物生長，提高植物的出苗率[11]。本研究結果發現，添加根際促生菌的處理對水稻紋枯病在實際育苗中有明顯的抑制作用，且提高了水稻的出苗率，水稻紋枯病發病率降低可能是因為根際促生菌能夠競爭生態位或底物[15]，同時誘導植物產生防御反應，使其產生抗菌活性物質，包括酶類、細菌素、脂肽類、揮發性物質[16]抑制病菌分生孢子萌發和附著胞形成[17]，阻止病原菌侵入。

其中防御酶體系是植株在受到外界傷害如高溫、干旱、鹽堿化、病原菌入侵等時，植物細胞自發形成的抵御外界傷害的主要酶保護系統[26]。近年來的諸多研究結果均表明，超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)等抗氧化酶活性與植株的抗病性密切相關[27]。本研究中添加病原菌之前先添加本研究所篩選出的拮抗促生菌的相應處理的抗氧化酶活性顯著增加，可能是因為SOD能夠將真菌細胞在生長和分化之間的過渡時期產生部分活性氧發生歧化反應，形成H2O2和O2，H2O2進一步被CAT和POD等分解[8]，抑制菌核的形成，降低病原菌的活力，提高水稻的抗性，同時削減水稻體內氧化作用，維持活性氧的平衡，防止過量的活性氧導致水稻體內的膜脂過氧化，減少膜系統損傷。丙二醛(MDA)作為膜脂過氧化的主要產物之一，可與膜上蛋白質結合，導致蛋白質分子間和分子內產生交聯，嚴重損失和破壞細胞膜系統，MDA含量高低反映了膜脂的損傷程度[28]，其在機體內的積累會對細胞產生毒害作用。本研究中，添加病原菌使植株細胞膜受到損害，從而促使植株體內MDA含量升高，而添加菌株LY11等拮抗促生菌使植株體內抗氧化酶活性提高從而降低了其相應處理植株體內的MDA含量。

同時相關研究發現根際促生菌通過抑制病原菌的生長，減少植物病害的發生，從而間接促進植物生長。如朱震等人[29]的研究結果表明，菌株XZ-173，對番茄青枯病具有較好的拮抗效果，同時可以顯著促進番茄幼苗生長。本研究結果發現，添加根際促生菌的處理在株高、莖粗、SPAD值、百株全株干物質重、壯苗指數、根系活力、根系總長、根平均直徑、根尖數等方面的作用效果高于對照組。可能因為根際促生菌除了通過在植物幼根表面定殖時形成一層均勻的保護層，保護了病原菌的侵染位點，減低了侵染機會[18]，間接促進植物生長外，還能分泌外源激素物質，增加植物初生根、次生根和不定根的數量來改變植物的根系形態結構[30]，為作物地上部的生長打下基礎。此外，水稻根際促生菌分泌的生長素、赤霉素、鐵載體等植物生長促生物質[14]能夠提高對鐵鎂等中微量元素的吸收，有利于作物葉綠素的形成并促進光合作用的進行，增加有機物質的積累，為水稻固氮和吸收養分提供能量。同時本實驗室前期研究表明促生菌能夠提高植物碳氮代謝過程中的關鍵酶，具有固氮解磷作用，從而使株高、莖粗等明顯增加。其中T3處理效果最顯著，這可能是因為根際促生菌對土壤中非寄生性根際有害微生物與有害病原微生物起到生防作用，促進植物礦質元素的吸收和利用，可產生利于植物生長的代謝產物，從而促進植物生長發育。

4 結論

5株拮抗促生菌與所篩選出的最適配比水稻育苗基質相結合，之后再添加水稻紋枯病病原菌，進行水稻育苗，所得水稻幼苗體內的抗氧化酶活性提高，發病率降低，同時提高了水稻農藝性狀及干物質重、壯苗指數，明顯改善根系活力和形態結構，提高了水稻的養分含量，且(酒糟+秸稈)堆肥60%+蛭石30%+珍珠巖10%+解淀粉芽孢桿菌()作為高效生物水稻育苗基質效果最優。

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Study on Effect of Biological Rice Breeding Substrate with Antagonistic Function of Rice Sheath Blight

QI Xiuxiu1, WEI Chang1, ZHANG Linli1, LIU Xiaodan1, YANG Yanxia2, JIANG Ying1*, MA Chao3*

(1 College of Resources and Environmental Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China; 2 Xiping Agricultural Technology Extension Center, Xiping, Henan 463900, China; 3 Anhui Key Laboratory of Farmland Ecological Conservation and Pollution Control, College of Resources and Environment, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China)

Rice sheath blight is one of the common soil-borne diseases of rice. To develop a biological rice breeding substrate to prevent and control rice sheath blight and promote rice growth, 5 rhizosphere growth-promoting bacteria with nitrogen fixation and phosphorus removal functions were selected, including LY5 (), LY11 (), X2 (), X3 () and X8 (). Based on the determination of the inhibition rate, the 5 bacteria were mixed with pathogenic bacteria of rice sheath blight, and then the functional biological rice breeding substrates were developed on the basis of the most suitable substrates screened in the laboratory, and a pot experiment was conducted to verify the effects of the developed 5 substrates on the incidence rate of rice sheath blight, growth of rice seedlings and in vivo resistance-related enzymes in rice by comparing with a commercial rice breeding substrate (CK). The results showed that the 5 rhizosphere growth-promoting bacteria all had the antagonistic effect on the pathogen of rice sheath blight with the inhibition rate from 35.31% to 40.20%. Compared with CK, the 5 rhizosphere growth-promoting bacteria all reduced the incidence rate of rice sheath blight, among of which, LY11 treatment significantly reduced the incidence rate by 89.32% and increased the number of emergence per plate by 110.41%. The 5 rhizosphere growth-promoting bacteria increased rice stem diameter, underground dry matter weight of 100 plants, dry matter weight of 100 plants, root activity, total root surface area, average root diameter, total root volume and root tip number, among of them, compared with CK, LY11 treatment significantly increased the above indexes by 3.13%, 4.21%, 4.97%, 68.02%, 26.77%, 16.67%, 44.44% and 7.82%, respectively. Compared with CK, the 5 rhizosphere growth-promoting bacteria significantly promoted the uptake of nitrogen, phosphorus and potassium by rice seedlings, increased significantly the activities of superoxide dismutase, peroxidase and catalase and the content of malondialdehyde in rice seedlings by 27.08%-122.72%, 16.09%-48.15%, 53.33%-233.85% and 110.24%-511.71%, respectively. Therefore, the 5 rhizosphere growth-promoting bacteria have good antagonistic effect against rice sheath blight pathogens andhas the best comprehensive effect, it lays a theoretical and practical basis for developing the high efficient biological rice breeding substrate with growth-promoting and bio-control functions.

Rice sheath blight; Antagonistic growth-promoting rhizobacteria; Nursery substrate; Root activity; Enzyme activity

S435.111

A

10.13758/j.cnki.tr.2021.03.009

戚秀秀, 魏暢, 張林利, 等. 兼具水稻紋枯病拮抗功能的生物水稻育苗基質效果研究. 土壤, 2021, 53(3): 505–511.

國家自然科學基金項目(42077050)和安徽省重大科技專項(18030701188)資助。

(JY27486@163.com；chaoma@ahau.edu.cn)

戚秀秀(1995—)，女，河南永城人，碩士研究生，主要從事資源利用與植物保護研究。E-mail: qixiuxiu0318@163.com