陜西省楊凌區蔬菜基地土壤中抗生素污染評價

李國秀，崔利輝，劉穎沙

(楊凌職業技術學院生物工程分院，陜西 楊凌 712100)

0 引言

隨著社會經濟的快速發展，人們對高品質食品尤其是有機食品的需求日益增加。目前全球有上百個國家開展有機農業生產，我國自21世紀以來也大力發展有機農業，有機農業面積達300萬hm2，為全球第3大有機食品生產國和消費國[1]。與傳統農業模式不同，有機農業禁用農藥、化肥等合成品，提倡使用有機肥并對產地環境質量有嚴格要求。因此，大多有機農場均直接或間接地使用禽畜糞便作為肥料，并導致其中污染物大量進入土壤[2-4]。

抗生素是禽畜糞便中的主要污染物之一，施用禽畜糞肥或用養殖廢水灌溉可導致抗生素大量進入農田土壤，進而被農作物吸收積累，并威脅人類健康[5-7]。蔬菜是人們日常生活中必不可少的食物，也是十分重要的經濟作物，其安全性是政府及老百姓十分關注的問題，也是農產品提質增效及可持續發展所面臨的重要問題。大量研究表明，蔬菜可從土壤中吸收并積累抗生素[8-10]。本研究對陜西省楊凌區及其周邊蔬菜基地土壤中的抗生素污染狀況進行了全面的檢測分析，可為本地區蔬菜的安全生產、保障蔬菜的質量安全提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

AB4500型三重四極桿液質聯用儀(美國AB Sciex公司)；OSJ-UP-V型超純水機(山東博科科學儀器有限公司)；RE-52C型旋轉蒸發儀(鄭州市亞榮儀器有限公司)；水浴恒溫振蕩器(上海啟前電子科技有限公司)；MD-200型氮吹儀(杭州奧盛儀器有限公司)；Mixplus型旋渦混合器(合肥艾本森科學儀器有限公司)；KQ-AS1000GVDE型超聲波清洗機(昆山市超聲儀器有限公司)；DZF-6090型真空干燥箱(濟南歐萊博科學儀器有限公司)；TG1650-WS型臺式高速離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司)；AR2140型電子天平(美國奧豪斯)；SPE-12型固相萃取裝置(天津艾維歐科技發展有限公司)。

19種抗生素(表1)標準溶液(100 μg/mL，購自北京壇墨質檢科技有限公司)；甲醇和乙腈為色譜純；85%磷酸、36%冰醋酸、檸檬酸、正己烷、鹽酸、無水硫酸鈉、十二水合磷酸氫二鈉、乙酸銨和乙二胺四乙酸二鈉均為分析純，試驗用水均為超純水。

表1 4類抗生素質譜條件參數

1.2 樣品采集與預處理

楊凌位于陜西關中平原中部，屬陜西省咸陽市轄區，是全國農業高新技術產業示范區。2018年10月—2019年9月，在楊凌示范區及周邊的扶風縣絳帳鎮、武功縣武功鎮、周至啞柏鎮等共選取20個蔬菜生產基地進行采樣，按照HJ/T 166—2004《土壤環境監測技術規范》進行土壤樣品采集[11]。

每個采樣基地均采用5點采樣法，采取0～20 cm表層土壤樣品進行混合，將待測土壤樣品平鋪在風干盤上，去除土壤中的雜物，放于通風陰涼處自然風干，研磨后過60目篩，置于冰箱密閉避光保存，待測。

1.3 土壤樣品前處理

參考文獻報道的方法，對不同種類抗生素分別進行以下不同預處理[12-14]。

1.3.1 喹諾酮類抗生素前處理

準確稱取1.00 g土壤樣品，置于10 mL離心管中，加入50%硝酸鎂-10%氨水(96/4，v/v)5 mL，振蕩5 min，超聲提取15 min，以4 500 r/min離心10 min，收集上清液。殘渣用上述方法反復提取2次，合并上清液，再過HLB固相萃取小柱(先后過6 mL甲醇和6 mL水)萃取富集。用6 mL高純水清洗小柱，真空干燥10 min，再用3 mL 1%乙酸-乙腈洗脫小柱。洗脫液在40 ℃下用氮氣吹至近干，用乙腈-水(20/80，v/v)定容至1 mL，溶液過0.22 μm濾膜，收集于樣品瓶中待測。

1.3.2 四環素類抗生素前處理

準確稱取1.00 g土壤樣品置于10 mL離心管中，加入Na2EDTA-Mcllvaine緩沖液/甲醇(1/1，v/v)5 mL，振蕩5 min，超聲提取15 min，以4 500 r/min離心10 min，收集上清液。殘渣按上述方法反復提取2次，合并上清液。旋轉蒸發至體積不變，再過HLB固相萃取小柱(先后過6 mL甲醇和6 mL Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液)萃取富集。用6 mL高純水清洗小柱，真空干燥10 min，再用3 mL甲醇洗脫小柱。洗脫液在40 ℃下用氮氣吹至近干，用甲醇-水(3/2，v/v)定容至1 mL，溶液過0.22 μm濾膜，收集于樣品瓶中待測。

1.3.3 磺胺類和大環內酯類抗生素前處理

準確稱取1.00 g左右土壤樣品置于10 mL離心管中，加入檸檬酸-MgCl2緩沖液/乙睛(1/1，v/v)5 mL，振蕩5 min，超聲提取15 min，以4 500 r/min離心10 min，收集上清液。殘渣按上述方法反復提取2次，合并上清液。旋轉蒸發至體積不變，再過HLB固相萃取小柱(先后過6 mL甲醇和6 mL水)萃取富集。用6 mL高純水清洗小柱，真空干燥10 min，再用3 mL甲醇洗脫小柱。洗脫液在40 ℃下用氮氣吹至近干，用甲醇-水(3/2，v/v)定容至1 mL，溶液過0.22 μm濾膜，收集于樣品瓶中待測。

1.4 抗生素檢測方法

采用高效液相色譜-串聯質譜法(HPLC-MS/MS)對土壤樣品中4大類19種抗生素(表1)進行檢測。

1.4.1 色譜條件參數

色譜柱：Kinetex Bipheny C18(50 mm×30 mm，2.6 μm)；流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為0.1%甲酸乙腈溶液；梯度洗脫程序(B%)：0～5 min 20%～90%，5～7 min 90%；流速：0.4 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：5 μL。

1.4.2 質譜條件參數

相關質譜參數如表1所示。質譜分析離子流如圖1所示。

圖1 質譜分析離子流Fig.1 Ion flow analyzed by mass spectrometry

1.5 數據處理

采用Excel 2013及SPSS 17.0軟件進行數據處理與分析。

2 結果與分析

2.1 土壤中喹諾酮類抗生素含量特征

土壤樣品中喹諾酮類抗生素含量特征如表2所示。在檢測的20個土壤樣本中，4種喹諾酮類抗生素總含量(ΣQNs)在14.64～103.37 μg/kg，平均含量為51.76 μg/kg。總含量分布情況如圖2所示，<30 μg/kg的占20%，30～60 μg/kg的占45%，60～90 μg/kg的占25%，>90 μg/kg的占10%。諾氟沙星、環丙沙星和恩諾沙星的檢出率均為100%，洛美沙星的檢出率為85%，且其中小部分(15.4%)低于定量限。4種化合物的平均含量從高到低依次為諾氟沙星>環丙沙星>恩諾沙星>諾美沙星。土壤中喹諾酮類化合物組成以諾氟沙星為主，其次為環丙沙星和恩諾沙星，而洛美沙星的含量很低。大部分土壤樣品能同時檢出4種喹諾酮類化合物，但各化合物的含量主要在50 μg/kg以下。本研究區域蔬菜基地土壤中喹諾酮類抗生素含量低于鄒慧云等[7]的報道(平均含量161.07 μg/kg)，與邰義萍[12]、趙慧男[15]、段夏珍[16]的報道結果相近。

表2 土壤中喹諾酮類抗生素含量特征

圖2 土壤中喹諾酮類抗生素總含量區間分布Fig.2 Range distribution of total quinolone antibiotics content in soil

2.2 土壤中四環素類抗生素含量特征

由表3可知，四環素類抗生素總含量(ΣTCs)在2.41～36.96 μg/kg，平均值為12.77 μg/kg，全部低于50 μg/kg。總含量分布情況如圖3所示，<10 μg/kg的占40%，10～30 μg/kg的占55%，30～50 μg/kg的占5%。4種四環素類化合物的檢出率均高于80%，平均含量分別為6.62、1.15、3.91和1.09 μg/kg。土壤中4環素類化合物組成以土霉素為主，其次為金霉素，而四環素和強力霉素的含量較低。大部分土壤樣品能同時檢出4種四環素類化合物，但各化合物的含量主要在10 μg/kg以下。本研究區域蔬菜基地土壤中四環素類化合物含量低于張蘭河等[17]、邰義萍等[18]、李彥文等[19]、郎朗等[20]的報道，污染程度較低。

表3 土壤中四環素類抗生素含量特征

圖3 土壤中四環素類抗生素總含量區間分布Fig.3 Range distribution of total content of tetracycline antibiotics in soil

2.3 土壤中磺胺類抗生素含量特征

土壤樣本中磺胺類抗生素的含量特征如表4所示。8種磺胺類化合物的總含量(ΣSAs)在0.10～2.94 μg/kg，平均值為1.14 μg/kg。僅磺胺二甲嘧啶(SM2)全部檢出，最高含量為2.61 μg/kg，其余7種磺胺類化合物均<1 μg/kg。單個化合物平均含量順序為磺胺二甲基嘧啶(SM2)>磺胺甲惡唑(SMZ)>磺胺對甲氧嘧啶(SM)>磺胺嘧啶(SD)>磺胺吡啶(SPD)>磺胺間二甲氧嘧啶(SDM)>磺胺甲基嘧啶(SMl)>磺胺噻唑(ST)。因此，土壤中磺胺類抗生素以磺胺二甲嘧啶(平均值0.69 μg/kg)為主。成玉婷等[21]研究得出，廣州市典型有機蔬菜基地土壤中磺胺類抗生素總含量在0.73～973 μg/kg，平均含量為116 μg/kg。張蘭河等[17]研究得出，菜田溫室土壤中磺胺類抗生素含量為4.13～34.70 μg/kg，平均含量為13.41 μg/kg，均高于本研究區域蔬菜基地土壤樣本中磺胺類抗生素的含量，說明本研究區域污染水平較低。

表4 土壤中磺胺類抗生素含量特征

表5 土壤中大環內酯類抗生素含量特征

2.4 土壤中大環內酯類抗生素含量特征

土壤樣本中大環內酯類抗生素含量特征如表5所示。總含量在0(低于檢測限)～10.13 μg/kg，平均含量為1.23 μg/kg。螺旋霉素、紅霉素和羅紅霉素檢出率均很低，分別為20%、40%和15%。3個化合物平均含量從高到低依次為紅霉素>螺旋霉素>羅紅霉素，以紅霉素為主。

3 結論

對楊凌區及其周邊20個蔬菜生產基地的土壤樣品中喹諾酮類、四環素類、磺胺類、大環內酯類4大類19種抗生素的含量進行檢測分析，結果表明，研究區域蔬菜基地土壤中喹諾酮類、磺胺類、四環素類3類抗生素均100%檢出，大環內酯類抗生素的檢出率為62%。

4類抗生素平均含量由高到低依次為喹諾酮類(51.76 μg/kg)>四環素類(12.77 μg/kg)>磺胺類(1.14 μg/kg)>大環內酯類(1.23 μg/kg)，分別以諾氟沙星、土霉素、磺胺二甲基嘧啶和紅霉素為主。

目前，國內尚無土壤中抗生素的限量要求，根據獸藥國際協調委員會(VICH)籌劃指導委員會提出的土壤中抗生素生態毒害效應的觸發值(100 μg/kg)，研究區域土壤中4大類抗生素的含量均小于該觸發值，生態風險較小[21-22]。與國內其他地區的研究報道相比，本研究區域的蔬菜基地抗生素污染程度也處于相對較低的污染水平。

研究區域蔬菜基地土壤中4大類典型抗生素均有檢出，說明土壤受到抗生素一定程度的污染。由于土壤中抗生素的積累會影響到土壤中正常微生物菌群的生長繁殖，而且會進一步遷移到種植的作物中，因此會危害生態環境安全和食品安全[5，23]。土壤中的抗生素主要來源于污水灌溉和畜禽糞便的直接施用，蔬菜生產從業人員應建立農產品質量安全意識，不用污水灌溉，合理施用有機肥，避免土壤中抗生素的積累。