飼用凝結芽孢桿菌對感染產腸毒素大腸桿菌K88斷奶仔豬生長性能和腸道健康的影響

柳成東 肖明霞 趙 平 李琦華 白華毅 程志斌

(云南農業大學動物科學技術學院，昆明 650201)

產腸毒素大腸桿菌(enterotoxigenicEscherichiacoli,ETEC)破壞腸道菌群平衡，損傷腸道正常形態，引發炎癥反應，是斷奶仔豬高腹瀉率和較差生長性能的主要原因之一，給養豬業造成了巨大的經濟損失[1]。飼糧添加土霉素等抑制ETEC的飼用抗生素，顯著降低了斷奶仔豬腹瀉，一定程度上改善了仔豬生長性能[2]。然而，隨著我國農業農村部發布第194號公告，規定于2020年7月1日起全面禁止促生長藥物飼料添加劑的使用，研發替代抗生素的功能性安全飼料添加劑迫在眉睫。

飼用益生菌是一類用以維持動物腸道微生態平衡和改善動物機體生理生化的功能性添加劑[3]。已有報道證明，飼用益生菌凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)具有高效抑制ETEC等多種腸道有害菌、維持腸道微生態平衡的作用，且凝結芽孢桿菌具有良好的耐熱性，適合顆粒飼料添加[4-5]，因此成為近年來研究與生產推廣的熱點[6-7]。大量試驗報道[7-9]，衛生條件控制較好的科學試驗條件下，飼用凝結芽孢桿菌能夠顯著改善正常斷奶仔豬的生長性能。然而，實際上我國生豬養殖衛生條件差異較大，以往的試驗數據與結論是否能夠支撐飼用凝結芽孢桿菌在斷奶仔豬料中的普遍性推廣，值得深入探討。目前，只有Pu等[10]的1篇報道模擬較差的養殖衛生環境，采用ETEC K88感染仔豬模型發現，飼糧添加復合功能性添加劑(0.2×107CFU/g凝結芽孢桿菌及苯甲酸、牛至油)，能夠顯著改善ETEC K88感染仔豬的腹瀉和生長性能。鑒于此，為了符合養豬生產多樣的衛生條件，本研究首次采用體內、體外相結合的2個試驗，驗證飼糧單一添加凝結芽孢桿菌對ETEC K88感染斷奶仔豬生長性能和腸道的作用效果，為飼用凝結芽孢桿菌在仔豬養殖生產中的推廣提供更多的科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用凝結芽孢桿菌制劑(菌株編號YNAU 5517，總菌數0.91×1010CFU/g)由云南農業大學提供[11]；ETEC K88標準菌株(CGMCC1.2385)購買于北納生物科技有限公司；土霉素由昆明三正生物科技(集團)有限公司購買。

1.2 抑菌試驗

試驗設計陰性對照組(無菌蒸餾水組)和陽性對照組(土霉素組)，采用經典牛津杯抑菌試驗評估法[12]，對比該株凝結芽孢桿菌對ETEC K88的抑制作用及效果，為后續飼用凝結芽孢桿菌改善口服ETEC K88感染仔豬生長性能及腸道健康奠定基礎。土霉素配制成400 mg/L溶液，依據《飼料藥物添加劑使用規范》中全價配合飼料允許添加量范圍的上限。

牛津杯法評估與分析該株凝結芽孢桿菌抑制ETEC K88的方法參考李靜舒等[13]最新報道。抑菌圈直徑測定與數據統計簡述如下：用游標卡尺測定3個處理的抑菌圈直徑(含所用牛津杯的外徑值7.8 mm)最大值和最小值，并計算平均值，以確定抑菌圈直徑數據。為了對3個處理的抑菌直徑進行方差分析，將沒有抑制作用的抑菌圈直徑值，定義為7.8 mm[13]。此外，依據本次試驗所用牛津杯的直徑值(7.8 mm)，將牛津杯外徑的約2倍16.0 mm區分為“敏感”與“高敏感”，因此抑菌作用判定標準如下：“不敏感”，抑菌圈直徑=7.8 mm，無抑制作用；“敏感”，7.8 mm<抑菌圈直徑≤16.0 mm，有一定抑制作用；“高敏感”，抑菌圈直徑>16.0 mm，有較強抑制作用。

1.3 ETEC K88感染試驗

1.3.1 試驗設計

試驗選用32頭25日齡斷奶的健康“杜×長×大”商品公豬，按照初始體重一致原則分成4個組，每組8個重復，單籠飼養。ETEC K88感染前7 d(試驗第1～7天)，2個組飼喂基礎飼糧(BD組)，另外2個組飼喂在基礎飼糧中添加1.0×107CFU/g凝結芽孢桿菌的飼糧(PD組)。第8天起，開展2×2雙因素試驗(因素1，口服ETEC K88感染處理；因素2，飼用凝結芽孢桿菌處理)，4個組設計如下：1)NCH+BD組，口服生理鹽水、飼喂基礎飼糧；2)NCH+PD組，口服生理鹽水、飼喂添加凝結芽孢桿菌飼糧；3)CH+BD組，口服ETEC K88、飼喂基礎飼糧；4)CH+PD組，口服ETEC K88、飼喂添加凝結芽孢桿菌飼糧。第8～10天，每天08:00，試驗豬口服5 mL ETEC K88(活菌數1.0×109CFU/mL)或5 mL 0.9%生理鹽水，每天1次[10]。

1.3.2 試驗飼糧

參照NRC(2012)豬營養需要量標準配制基礎飼糧，其組成及營養水平見表1，基礎飼糧中不添加任何飼用抑菌藥物及其他益生菌。凝結芽孢桿菌制劑依據課題組前期報道[9,14]，在基礎飼糧中添加1.1 kg/t，添加量為1.0×107CFU/g。所有飼糧經80 ℃制粒。

表1 基礎飼糧組成及營養水平(風干基礎)

1.3.3 飼養管理

試驗在云南省玉溪市正和豬場完成。試驗豬代謝籠(長×寬×高=1.1 m×0.4 m×0.9 m)單籠飼養，保育舍溫度保持26～28 ℃。試驗全程自由采食和飲水，24 h光照。飼養試驗周期10 d。

1.3.4 樣品采集

試驗第11天08:00所有試驗豬稱重后屠宰，取空腸和盲腸食糜樣品，放置-80 ℃冰箱中保存待測大腸桿菌和乳酸桿菌數量。空腸和回腸組織取樣并固定后(4%多聚甲醛)，用于絨毛高度和隱窩深度測定。刮取空腸黏膜，放置-80 ℃冰箱中保存待測細胞因子表達量。

1.3.5 指標測定

1.3.5.1 生長性能

試驗第1、8和11天08:00仔豬稱重，分別統計ETEC K88感染前和感染3 d期間的平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)、料重比(F/G)和腹瀉指數。腹瀉指數計算方法參考蒲俊寧[15]的報道。

1.3.5.2 腸道細菌數量

采用平板計數法[16-17]，檢測空腸和盲腸食糜中大腸桿菌和乳酸桿菌數量。空腸和盲腸食糜中凝結芽孢桿菌數量測定參考柳成東等[11]的報道。檢測數據用lg(CFU/g)表達。

1.3.5.3 腸道形態

腸道形態學檢測參考Nosworthy等[18]報道的蘇木精-伊紅染色法，簡述如下：甲醛固定后的腸組織樣品修剪成1 cm3大小的樣品塊，經二甲苯漂洗，并石蠟包埋。每個包埋好的樣品切出4個5 μm厚的切片，用蘇木精-伊紅染色。切片在尼康雙筒目鏡(Warsaw公司，波蘭)下測定腸絨毛高度和隱窩深度，每張切片至少連續觀測30根絨毛。

1.3.5.4 細胞因子表達量

參考Che等[19]報道的實時熒光定量法，檢測空腸黏膜細胞因子白細胞介素-6(IL-6)和白細胞介素-10(IL-10)mRNA表達量，簡述如下：提取空腸黏膜IL-6和IL-10的總RNA，反轉錄后進行PCR定量。選取磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)基因作為內參基因，引物序列見表2。

表2 引物序列

1.4 數據統計分析

體外抑菌試驗的抑菌圈直徑采用SPSS 17.0進行單因素方差分析和Duncan氏法多重比較；ETEC感染前生長性能數據采用t檢驗統計分析；口服ETEC感染試驗模型數據采用2×2雙因素方差分析，分別統計ETEC感染處理效應、飼用凝結芽孢桿菌處理效應及其二者互作效應。結果以平均值和均值標準誤表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 凝結芽孢桿菌對ETEC K88的抑制效果

由圖1可知，凝結芽孢桿菌對ETEC K88的抑制作用達到“敏感”(抑菌圈直徑=15.2 mm)，其抑制效果顯著小于土霉素(抑菌圈直徑=17.0 mm，“高敏感”)(P<0.05)。此外，陰性對照組無菌蒸餾水對ETEC K88沒有抑制作用(“不敏感”)。

Ⅰ組，無菌蒸餾水組；Ⅱ組，土霉素組；Ⅲ組，凝結芽孢桿菌組。數據柱標注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同小寫字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。下圖同。

2.2 飼用凝結芽孢桿菌對ETEC K88感染斷奶仔豬生長性能的影響

由表3可知，ETEC K88感染前7 d，與BD組(飼喂基礎飼糧)相比，PD組(飼喂添加凝結芽孢桿菌的飼糧)斷奶仔豬平均日增重和平均日采食量顯著提高(P<0.05)，料重比和腹瀉指數顯著降低(P<0.05)。

表3 飼用凝結芽孢桿菌對ETEC K88感染前斷奶仔豬生長性能的影響

由表4可知，口服ETEC K88持續感染3 d顯著降低斷奶仔豬平均日增重和平均日采食量(P<0.05)，顯著提高料重比和腹瀉指數(P<0.05)；飼糧添加凝結芽孢桿菌顯著提高斷奶仔豬平均日增重和平均日采食量(P<0.05)，顯著降低料重比和腹瀉指數(P<0.05)。除腹瀉指數外，ETEC K88感染處理與飼用凝結芽孢桿菌處理之間對其他生長性能指標均無顯著互作效應(P>0.05)。

表4 飼用凝結芽孢桿菌對ETEC K88感染3 d斷奶仔豬生長性能的影響

2.3 飼用凝結芽孢桿菌對ETEC K88感染斷奶仔豬腸道菌群的影響

由表5可知，ETEC K88感染處理顯著增加斷奶仔豬空腸和盲腸食糜中大腸桿菌數量(P<0.05)，顯著減少空腸和盲腸食糜中乳酸桿菌數量(P<0.05)；飼糧添加凝結芽孢桿菌顯著減少空腸和盲腸食糜中大腸桿菌數量(P<0.05)，顯著增加空腸和盲腸食糜中乳酸桿菌數量(P<0.05)。此外，ETEC K88感染處理與飼用凝結芽孢桿菌處理之間對以上腸道細菌測定指標均無顯著互作效應(P>0.05)。

表5 飼用凝結芽孢桿菌對ETEC K88感染斷奶仔豬腸道菌群的影響

由圖2可知，NCH+PD組仔豬空腸食糜中凝結芽孢桿菌數量顯著高于CH+PD組(P<0.05)。然而，NCH+PD組與CH+PD組之間盲腸食糜中凝結芽孢桿菌數量無顯著差異(P>0.05)。此外，飼糧未添加凝結芽孢桿菌的NCH+BD組和CH+BD組未檢測出凝結芽孢桿菌。

圖2 斷奶仔豬空腸和盲腸食糜中凝結芽孢桿菌的數量

2.4 飼用凝結芽孢桿菌對ETEC K88感染斷奶仔豬腸道形態的影響

由表6可知，ETEC K88感染處理顯著降低斷奶仔豬空腸和回腸的絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度值(P<0.05)，顯著提高空腸和回腸的隱窩深度(P<0.05)；飼糧添加凝結芽孢桿菌顯著提高空腸和回腸的絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度值(P<0.05)，顯著降低空腸的隱窩深度(P<0.05)，且對回腸的隱窩深度有降低的趨勢(P=0.068)。此外，ETEC K88感染處理與飼用凝結芽孢桿菌處理之間以上腸道形態指標均無顯著互作效應(P>0.05)。

表6 飼用凝結芽孢桿菌對ETEC K88感染斷奶仔豬腸道形態的影響

2.5 飼用凝結芽孢桿菌對ETEC K88感染斷奶仔豬空腸黏膜細胞因子表達量的影響

由圖3可知，ETEC K88感染處理顯著提高斷奶仔豬空腸黏膜IL-6 mRNA表達量(P<0.05)，顯著降低空腸黏膜IL-10 mRNA表達量(P<0.05)；飼糧添加凝結芽孢桿菌顯著降低空腸黏膜IL-6 mRNA表達量(P<0.05)，顯著提高空腸黏膜IL-10 mRNA表達量(P<0.05)。此外，ETEC K88感染處理與飼用凝結芽孢桿菌處理之間對以上細胞因子指標均無顯著互作效應(P>0.05)。

圖3 飼用凝結芽孢桿菌對ETEC K88感染斷奶仔豬空腸黏膜細胞因子表達量的影響

3 討 論

3.1 牛津杯法評估凝結芽孢桿菌對ETEC K88的抑制作用

本試驗中，陰性對照組無菌蒸餾水對ETEC K88沒有抑制作用，陽性對照組土霉素對ETEC K88的抑制達到“高敏感”。以上結果表明，本次體外抑菌試驗可用于比較評估凝結芽孢桿菌對ETEC K88的抑菌效果。本試驗結果顯示，試驗所用凝結芽孢桿菌(菌株編號YNAU 5517)對ETEC K88的抑菌圈直徑為15.2 mm，抑制作用判定為“敏感”，抑制效果統計分析略低于土霉素。汪攀等[4]報道，凝結芽孢桿菌(菌株編號NJ102)對ETEC K88有較強的抑制作用。同年，張韻等[5]評估的4株凝結芽孢桿菌(菌株編號BC147、BC235、BC310和BC303)對ETEC K88均有顯著抑制作用。ETEC K88感染是斷奶仔豬腹瀉的主要原因之一，因此這一體外抑菌試驗結果為本研究后續構建口服ETEC K88感染仔豬試驗模型，驗證該株飼用凝結芽孢桿菌能否改善斷奶仔豬腸道健康與生長性能奠定了良好的研究基礎。

3.2 飼用凝結芽孢桿菌對感染ETEC K88斷奶仔豬生長性能的影響

大量綜述文章提示，包括凝結芽孢桿菌在內的芽孢桿菌屬飼用益生菌，一般以芽孢體的形式添入飼糧，在畜禽胃腸內需要一定時間活化為營養體，并增殖、增生，才能更有效地發揮益生促生長作用[6,20-21]。為了更貼近我國養豬生產不同衛生狀況的實際需求，突出飼用凝結芽孢桿菌的預防效果，本研究將仔豬飼養試驗分成2個階段實施：階段1，不感染ETEC K88條件下，開展預飼凝結芽孢桿菌7 d的對比試驗；階段2，隨后實施3 d持續口服ETEC K88感染處理及飼用凝結芽孢桿菌處理的2×2雙因素試驗。該試驗設計與前人[1,22-23]報道其他飼用益生菌在斷奶仔豬上應用的試驗設計相似。本試驗結果顯示，ETEC K88感染仔豬的腹瀉指數和料重比顯著提高，平均日增重和平均日采食量顯著降低。這與前人報道的ETEC K88感染仔豬模型結果[10,19,23-25]一致，表明本研究建立的口服ETEC K88感染仔豬模型合理。

本試驗結果顯示，無論是否ETEC K88感染處理，飼用凝結芽孢桿菌處理均能顯著降低斷奶仔豬的料重比，顯著提高平均日增重和平均日采食量；且ETEC K88感染處理與飼用凝結芽孢桿菌處理之間對上述生長性能指標無顯著互作效應。本課題組前期試驗結果[9,14]證明：與基礎飼糧組相比，1.0×107CFU/g飼用凝結芽孢桿菌能顯著降低正常斷奶仔豬腹瀉率和料重比，顯著提高平均日增重。Pu等[10]進一步采用ETEC K88感染仔豬模型試驗發現，飼糧添加凝結芽孢桿菌(0.2×107CFU/g)、苯甲酸和牛至油的組合添加劑，能夠顯著降低ETEC K88感染仔豬的腹瀉指數和料重比，顯著提高平均日增重和平均日采食量。以上報道與本研究結果基本一致。

然而，Wu等[26]報道，飼糧添加2×106和2×107CFU/g凝結芽孢桿菌，對21日齡正常斷奶仔豬的平均日增重和平均日采食量無顯著影響。分析Wu等的[26]報道，本課題組推測生長性結果造成差異的原因，包括：1)不同凝結芽孢桿菌菌株的益生作用有差異。張韻等[5]篩選的4株凝結芽孢桿菌(菌株編號BC147、BC235、BC310和BC303)雖然對ETEC K88均有抑制作用，但抑菌圈直徑值統計有顯著差異，這提示不同凝結芽孢桿菌的菌株對ETEC K88的抑菌效果有明顯差異。據此推測，抑菌效果不同的凝結芽孢桿菌加入飼糧，其在腸道中發揮的益生作用可能有一定差異，最終導致生產性能的結果不同。2)試驗動物的個體差異，包括仔豬斷奶的日齡、體重及健康狀況等。Wu等[26]課題組使用了21日齡體重6.04 kg較小的斷奶仔豬，在10 d的試驗期間，對照組仔豬平均日增重和平均日采食量的組內數據變異系數分別達到23.7%和35.4%，且2個添加飼用凝結芽孢桿菌組仔豬的平均日增重和平均日采食量變異系數也較大。據此推測，Wu等[26]試驗仔豬生長性能數據的組內變異較高，可能是數據統計未能體現凝結芽孢桿菌改善生長性能效果的主要原因。這也充分凸顯本研究結合了體外抑菌試驗來評估單株飼用凝結芽孢桿菌益生效果的合理性。

3.3 飼用凝結芽孢桿菌對感染ETEC K88斷奶仔豬腸道菌群的影響

腸道菌群平衡是腸道健康的重要指標之一，能夠保障仔豬斷奶的生長性能[27]。大腸桿菌是仔豬腸道的主要致病菌，不利于生長性能[28]；乳酸桿菌是仔豬腸道的優勢有益菌，對仔豬生長性能和腸道健康具有重要意義[29]。本試驗中，ETEC K88感染處理導致斷奶仔豬空腸和盲腸食糜中大腸桿菌數量顯著增加，乳酸桿菌數量顯著減少，這與前人的報道[10,23,30]基本一致。本試驗結果顯示，飼用凝結芽孢桿菌處理顯著降低了ETEC K88感染斷奶仔豬空腸和盲腸食糜中大腸桿菌數量，顯著提高空腸和盲腸食糜中乳酸桿菌數量。Pu等[10]使用飼用凝結芽孢桿菌及苯甲酸、植物精油的組合添加劑，在ETEC K88感染仔豬試驗模型上獲得了與本試驗相似的結果。

為了進一步證明飼喂該株凝結芽孢桿菌能夠在斷奶仔豬腸道發揮平衡菌群、改善生長性能的作用，本研究首次檢測了所有組仔豬空腸和盲腸食糜中凝結芽孢桿菌的數量，這在以往的文獻中沒有報道。結果顯示：飼喂添加凝結芽孢桿菌飼糧的NCH+PD組和CH+PD組斷奶仔豬空腸食糜中凝結芽孢桿菌數量分別為4.7×105和3.6×105CFU/g，盲腸食糜中凝結芽孢桿菌數量分別為9.3×105和8.3×105CFU/g；且未飼喂添加凝結芽孢桿菌飼糧的NCH+BD組和CH+BD組斷奶仔豬空腸和盲腸食糜中未檢測出凝結芽孢桿菌。

3.4 飼用凝結芽孢桿菌對ETEC K88感染斷奶仔豬腸道形態的影響

腸黏膜絨毛高度、隱窩深度的測定是表征腸道形態的最直觀指標[31]。完整且較長的絨毛高度和適當的隱窩深度有利于營養物質的充分吸收；相反，腸黏膜上皮細胞破損會顯著降低絨毛高度，且提高隱窩深度，這是隱窩干細胞增殖、增生對腸絨毛上皮細胞的損傷修復作用[19,31]。本試驗結果顯示：感染ETEC K88斷奶仔豬空腸和回腸絨毛高度顯著降低，隱窩深度顯著提高，且絨毛高度/隱窩深度值顯著降低，這與前人報道結果[19,22,24]一致，表明ETEC K88及所產毒素破壞了仔豬腸道形態，不利于營養物質吸收和生長性能發揮。

本試驗結果還顯示：飼用凝結芽孢桿菌處理恢復了ETEC K88感染斷奶仔豬空腸和回腸絨毛高度，降低了隱窩深度，且絨毛高度/隱窩深度值得到提升。Che等[19]研究表明，飼用酵母菌恢復了感染ETEC K88斷奶仔豬空腸和回腸絨毛高度，降低了隱窩深度。Pan等[24]報道，飼糧添加地衣芽孢桿菌和酵母菌提高了感染ETEC K88斷奶仔豬空腸和回腸絨毛高度，降低了隱窩深度。以上結果表明，飼用益生菌通過拮抗有害菌及毒素的入侵，維持腸道菌群平衡，從而有利于腸道正常形態的維護。

3.5 飼用凝結芽孢桿菌對ETEC K88感染斷奶仔豬腸道黏膜IL-6和IL-10 mRNA表達量的影響

促炎細胞因子IL-6主要由活化的巨噬細胞、淋巴細胞和腸上皮細胞分泌，正常情況下濃度很低。腸上皮細胞受到有害菌及其分泌內毒素的刺激后，IL-6迅速表達，因此IL-6是腸道炎癥的重要指標之一[32]。IL-10是由活化的單核細胞、巨噬細胞和腸上皮細胞產生，作為公認的抗炎細胞因子，能夠顯著抑制機體及相關組織的炎癥反應[33]。本試驗結果顯示：感染ETEC K88斷奶仔豬空腸黏膜IL-6 mRNA表達量顯著上升，IL-10 mRNA表達量顯著降低。周棟[34]檢測ETEC K88感染仔豬的小腸T淋巴細胞，發現空腸表達抗炎細胞因子IL-10的T淋巴細胞百分率顯著下降。Zhu等[35]報道，ETEC K88感染仔豬回腸促炎細胞因子IL-6 mRNA表達量顯著上升。以上結果均表明，口服ETEC K88造成了斷奶仔豬小腸炎癥反應。

本試驗結果顯示：飼用凝結芽孢桿菌處理顯著降低了感染ETEC K88斷奶仔豬空腸黏膜促炎因子IL-6 mRNA表達量，顯著提高了抗炎因子IL-10 mRNA表達量。Li等[36]報道，飼用丁酸梭菌能夠顯著增加ETEC K88感染仔豬空腸抗炎因子IL-10 mRNA表達量。Zhu等[35]研究表明，飼用鼠李糖乳酸桿菌能夠顯著增加ETEC K88感染仔豬回腸抗炎因子IL-10 mRNA表達量。以上結果表明，飼用益生菌屏蔽有害菌及毒素對腸上皮細胞的免疫刺激，具有降低腸道炎癥反應的作用。

此外，除腹瀉指數外，飼用凝結芽孢桿菌處理與ETEC K88感染處理之間對主要生長性能以及腸道菌群、腸道形態和腸細胞因子等指標均無顯著互作效應。這表明，無論是否ETEC K88感染處理，飼用凝結芽孢桿菌均能發揮改善斷奶仔豬生長性能及腸道健康的效果。

4 結 論

結合單株凝結芽孢桿菌對ETEC K88顯著抑制的體外抑菌試驗數據，本研究進一步采用口服ETEC K88感染斷奶仔豬試驗模型證明：無論是否ETEC K88感染處理，飼糧添加該株凝結芽孢桿菌在腸道內均能顯著抑制大腸桿菌，平衡腸道菌群，進而通過維持腸道正常形態與緩解腸道炎癥反應，改善斷奶仔豬生長性能。

致謝：

感謝云南農業大學動物科學技術學院葛長榮教授對文稿所提的寶貴意見。