檸檬酸對草魚生長性能、營養(yǎng)物質(zhì)利用、血清生化指標(biāo)和腸道組織形態(tài)的影響

程 卓 張國奇 周 陸 徐 禛 楊 航 李小勤 冷向軍*

(1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，水產(chǎn)科學(xué)國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部魚類營養(yǎng)與環(huán)境生態(tài)研究中心，上海 201306；3.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 201306；4.上海市松江區(qū)水產(chǎn)良種場，上海 201203)

隨著抗生素在飼料中的禁用，替代抗生素的添加劑備受關(guān)注。檸檬酸作為一種無殘留且不產(chǎn)生抗藥性的有機(jī)酸，可以有效地替代抗生素。目前，在水產(chǎn)飼料中補(bǔ)充檸檬酸的報(bào)道已見于虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[1]、凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)[2]、大黃魚(Larimichthyscrocea)[3]、大菱鲆(ScophthalmusmaximusL.)[4]、異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)[5]、羅非魚(Oreochromsmossambcus)[6]、真鯛(Pagrusmajor)[7]、黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)[8]等水產(chǎn)動(dòng)物，這些研究結(jié)果表明，檸檬酸提高了水產(chǎn)動(dòng)物對營養(yǎng)物質(zhì)的消化利用率，促進(jìn)了水產(chǎn)動(dòng)物生長。其原因，一方面可能與檸檬酸能降低飼料pH、提高飼料適口性、增強(qiáng)消化酶活性有關(guān)；另一方面可能與檸檬酸是三羧酸循環(huán)中的初級代謝產(chǎn)物，能在異檸檬酸脫氫酶的作用下生成大量ATP，為機(jī)體提供能量有關(guān)。然而，在不同水產(chǎn)動(dòng)物上，檸檬酸的添加量和作用效果并不一致。

草魚(Ctenopharyngodonidella)是我國主要的淡水養(yǎng)殖品種，但在高密度集約化養(yǎng)殖過程中易感染疾病，從而造成損失。有關(guān)檸檬酸在草魚上的研究鮮有報(bào)道。尚衛(wèi)敏等[9]在飼料中添加0.21%的檸檬酸顯著提高了草魚的增重率，但對飼料系數(shù)沒有顯著影響，但該研究中僅設(shè)置了1個(gè)添加梯度(0.21%)，是否是草魚飼料中檸檬酸的最適添加量尚無法確定。此外，檸檬酸對營養(yǎng)物質(zhì)特別是磷的利用以及對腸道組織形態(tài)的影響均不清楚。因此，本試驗(yàn)以草魚為研究對象，在飼料中添加不同水平的檸檬酸，飼養(yǎng)草魚60 d，考察其對草魚生長性能、營養(yǎng)物質(zhì)利用、血清生化指標(biāo)和腸道組織形態(tài)的影響，以期為檸檬酸在水產(chǎn)飼料中的合理使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼料配方

以魚粉、豆粕、菜籽粕和棉籽粕為主要蛋白質(zhì)源，配制蛋白質(zhì)水平為30%的基礎(chǔ)飼料，在基礎(chǔ)飼料中分別添加0(對照)、0.15%、0.30%和0.45%的檸檬酸(純度≥99.5%)，配制成4種等氮等脂的試驗(yàn)飼料。配制試驗(yàn)飼料時(shí)，所添加的檸檬酸量以減少等量麩皮的方式來維持各組分平衡。飼料中添加0.05%的三氧化二釔(Y2O3)作為指示劑，用于測定營養(yǎng)物質(zhì)的表觀消化率。

主要飼料原料用粉碎機(jī)粉碎后，過40目篩，準(zhǔn)確稱量各飼料原料，逐級混勻，加入豆油和水后，充分混勻，用單螺桿擠壓機(jī)(SLP-45，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院漁業(yè)機(jī)械儀器研究所研制)制成直徑為2 mm的沉性顆粒飼料(制粒溫度90～95 ℃)，自然風(fēng)干備用。試驗(yàn)飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。飼料pH隨檸檬酸添加量的增加而降低，依次為5.75、5.67、5.48、5.42。

表1 試驗(yàn)飼料組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.2 試驗(yàn)魚和飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)用草魚購于浙江省湖州市南潯區(qū)菱湖鎮(zhèn)宸浩水產(chǎn)經(jīng)營部，在上海海洋大學(xué)濱海基地養(yǎng)殖車間暫養(yǎng)2個(gè)月。暫養(yǎng)期間，用商品飼料(粗蛋白質(zhì)含量≥30%)進(jìn)行投喂，每天投喂2次(08:00、15:00)，使之適應(yīng)養(yǎng)殖環(huán)境。正式試驗(yàn)開始時(shí)，選擇平均體重為(17.0±0.2)g、體質(zhì)健壯、規(guī)格整齊的草魚240尾，隨機(jī)分為4組，每組3個(gè)重復(fù)(網(wǎng)箱)，每個(gè)重復(fù)20尾。養(yǎng)殖試驗(yàn)在水泥池(5.0 m×3.0 m×1.2 m)里的網(wǎng)箱(1.5 m×1.0 m×1.2 m，網(wǎng)箱箱體網(wǎng)孔直徑3 mm，箱底網(wǎng)孔直徑1 mm)中進(jìn)行，養(yǎng)殖期為60 d。每日投喂3次(07：00、12:00、17:00)，日投喂量為魚體質(zhì)量的3.0%～5.0%，并根據(jù)天氣、水溫和攝食情況進(jìn)行調(diào)整，每次投飼以10 min內(nèi)無殘餌為宜，并且各網(wǎng)箱的投喂量保持基本一致。試驗(yàn)期間，養(yǎng)殖水體24 h連續(xù)供氧，供氧設(shè)施為鼓風(fēng)增氧機(jī)(HG710-38BS7，YASHIBA，浙江)，每個(gè)網(wǎng)箱中央用氣管懸掛1個(gè)氣石，保證各網(wǎng)箱氣石的深度一致，每隔5 d換水1次，每隔10 d吸污1次，每次換水量約為總水體的1/3。每天監(jiān)測水質(zhì)指標(biāo)，水溫為(28±2)℃，pH為7.5～8.0，溶解氧濃度>5.0 mg/L，總氨氮濃度<0.2 mg/L，亞硝酸鹽濃度<0.1 mg/L。

1.3 樣品采集和處理

正式試驗(yàn)開始前，隨機(jī)取9尾魚置于-20 ℃冰箱中冷凍保存，用于初始全魚常規(guī)營養(yǎng)成分測定。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，饑餓24 h后對各個(gè)網(wǎng)箱的試驗(yàn)魚進(jìn)行計(jì)數(shù)稱重，計(jì)算增重率(WGR)、特定生長率(SGR)、飼料系數(shù)(FCR)和存活率(SR)。每個(gè)網(wǎng)箱隨機(jī)取3尾魚，置于-20 ℃冰箱中冷凍保存，用于終末全魚常規(guī)營養(yǎng)成分測定。每個(gè)網(wǎng)箱再隨機(jī)取3尾魚，逐條稱重并測量體長，尾靜脈采血，離心(4 ℃、3 000 r/min，10 min)，取上清液，-80 ℃冷凍保存，用于血清生化指標(biāo)測定。試驗(yàn)魚采完血后立即解剖，分離內(nèi)臟團(tuán)、肝臟和腸脂并稱重，計(jì)算肥滿度(CF)、臟體比(VSI)、肝體比(HSI)和腸脂比(MSI)。取出腸道，排空食糜，截取1 cm的前腸(根據(jù)前中腸結(jié)點(diǎn)確定)，用生理鹽水沖洗，Bouin氏液固定，用于制作腸道組織切片。每個(gè)網(wǎng)箱另隨機(jī)取3尾魚，抽血后立即解剖，分離出腸道，剝離腸脂，排空食糜，截取完整的前腸，-80 ℃冷凍保存，用于腸道消化酶活性測定。

1.4 測定指標(biāo)與方法

1.4.1 生長性能和形體指標(biāo)

存活率(%)=100×終末魚總數(shù)(尾)/初始魚總數(shù)(尾)；增重率(%)=100×[終末體重(g)-初始體重(g)]/初始體重(g)；特定生長率(%/d)=100×[ln終末體重(g)-ln初始體重(g)]/養(yǎng)殖天數(shù)(d)；飼料系數(shù)=總投喂量(g)/[終末體重(g)-初始體重(g)]；肥滿度(g/cm3)=100×體重(g)/體長(cm)3；臟體比(%)=100×內(nèi)臟重(g)/體重(g)；肝體比(%)=100×肝臟重(g)/體重(g)；腸脂比(%)=100×腸脂重(g)/體重(g)。

1.4.2 飼料、全魚、糞便常規(guī)營養(yǎng)成分含量和營養(yǎng)物質(zhì)沉積率

飼料、糞便和全魚常規(guī)營養(yǎng)成分含量測定方法如下：水分含量的測定采用105 ℃烘干法；粗蛋白質(zhì)含量的測定采用凱氏定氮法；粗脂肪含量的測定采用氯仿-甲醇抽提法；粗灰分含量的測定采用馬弗爐灰化法；總磷含量的測定采用磷鉬酸法(試劑盒購買于南京建成生物工程研究所)。飼料的pH參考Radecki等[10]的方法，稱量20 g飼料放入燒杯中，加入40 mL去離子水，用玻璃棒攪拌形成漿液后，用電子pH計(jì)(便攜pH計(jì)，AS700，日本)測定pH。根據(jù)上述的測定值計(jì)算營養(yǎng)物質(zhì)沉積率，計(jì)算公式如下：

某營養(yǎng)物質(zhì)沉積率(%)=100×[終末體重(g)×終末全魚該營養(yǎng)物質(zhì)含量(%)-初始體重(g)×初始全魚該營養(yǎng)物質(zhì)含量(%)]/該營養(yǎng)物質(zhì)攝入量(g)。

1.4.3 營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率

養(yǎng)殖試驗(yàn)的后2周，用撈網(wǎng)收集每個(gè)網(wǎng)箱糞便(投飼2 h后)，取包膜完整的糞便，-20 ℃保存?zhèn)溆茫瑴y定粗蛋白質(zhì)和總磷含量。飼料、糞便中Y2O3含量采用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(ICAP Q-MS電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，Thermo iCAP Q，美國)測定。根據(jù)上述數(shù)據(jù)，計(jì)算各營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率，計(jì)算公式如下：

干物質(zhì)表觀消化率(%)=100×(1-b/B)；蛋白質(zhì)表觀消化率(%)=100×[1-(A/a)×(b/B)]；磷表觀消化率(%)=100×[1-(C/c)×(b/B)]。

式中：a、A分別表示飼料和糞便中粗蛋白質(zhì)含量；b、B分別表示飼料和糞便中Y2O3含量；c、C分別表示飼料和糞便中總磷含量。

1.4.4 血清生化指標(biāo)

血清中葡萄糖(GLU)、總蛋白(TP)、甘油三酯(TG)和總膽固醇(TC)含量采用全自動(dòng)生化分析儀測定；血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性與丙二醛(MDA)含量采用相應(yīng)的試劑盒(購買于南京建成生物工程研究所)測定。

1.4.5 腸道組織切片

腸道組織經(jīng)乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片(厚度5 μm，Leika RM 2235切片機(jī)，德國)，再經(jīng)蘇木精-伊紅(HE)染色，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡(Nikon YS100顯微攝影系統(tǒng))下進(jìn)行拍照，測量絨毛高度(VH)、絨毛寬度(VW)和肌層厚度(MT)。

1.4.6 腸道消化酶活性

將冷凍的腸道組織4 ℃解凍，按重量(g)：體積(mL)為1∶4加入4倍體積的生理鹽水，勻漿，4 ℃離心10 min(2 500 r/min)，取上清液，24 h內(nèi)測定蛋白酶和淀粉酶活性。蛋白酶活性采用福林酚法測定，以2%酪蛋白溶液為底物，每微克組織蛋白在pH 7.2、37 ℃條件下每分鐘分解酪蛋白生成1 μg酪氨酸定義為1個(gè)蛋白酶活性單位。淀粉酶活性采用淀粉-碘比色法(試劑盒購買于南京建成生物工程研究所)測定，每毫克組織蛋白質(zhì)在37 ℃與底物作用30 min，水解10 mg淀粉定義為1個(gè)淀粉酶活性單位。蛋白質(zhì)濃度采用考馬斯亮藍(lán)法(試劑盒購買于南京建成生物工程研究所)測定。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)先用Excel 2017進(jìn)行整理，再采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05表示差異顯著，若差異顯著，則用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。除存活率外，其他數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。

2 結(jié) 果

2.1 生長性能和形體指標(biāo)

各組草魚的生長性能和形體指標(biāo)見表2。養(yǎng)殖期間，各組草魚的存活率均為100%。與對照組相比，飼料中添加0.30%檸檬酸使草魚的增重率提高了11.37%(P<0.05)，特定生長率提高了5.68%(P<0.05)，飼料系數(shù)降低了10.34%(P<0.05)；0.15%和0.45%檸檬酸組草魚的生長性能較對照組有改善趨勢，但未達(dá)到顯著水平(P>0.05)。0.45%檸檬酸組草魚的臟體比顯著低于其他組(P<0.05)，0.15%和0.30%檸檬酸組的肝體比以及0.15%檸檬酸組的腸脂比均顯著高于對照組(P<0.05)。各組草魚在肥滿度上無顯著差異(P>0.05)。

表2 檸檬酸對草魚生長性能和形體指標(biāo)的影響

2.2 全魚營養(yǎng)成分含量和營養(yǎng)物質(zhì)沉積率

各組草魚全魚營養(yǎng)成分含量和營養(yǎng)物質(zhì)沉積率見表3。與對照組相比，飼料中添加0.15%、0.30%檸檬酸顯著降低了全魚水分含量(P<0.05)，顯著提高了全魚粗脂肪含量(P<0.05)。各組草魚全魚粗蛋白質(zhì)、粗灰分和磷含量均無顯著差異(P>0.05)。在營養(yǎng)物質(zhì)沉積率方面，0.30%檸檬酸組的蛋白質(zhì)沉積率較對照組顯著升高(P<0.05)；各檸檬酸添加組的脂肪和磷沉積率均顯著高于對照組(P<0.05)，其中以0.30%檸檬酸組的脂肪和磷沉積率最高。

表3 檸檬酸對草魚全魚營養(yǎng)成分含量和營養(yǎng)物質(zhì)沉積率的影響

2.3 營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率和腸道消化酶活性

各組草魚營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率和腸道消化酶活性見表4。與對照組相比，在飼料中添加不同水平的檸檬酸均顯著提高了總磷表觀消化率(P<0.05)，其中0.30%檸檬酸組的總磷表觀消化率最大；此外，飼料中添加0.30%檸檬酸還顯著提高了干物質(zhì)和粗蛋白質(zhì)表觀消化率(P<0.05)。在腸道消化酶活性方面，與對照組相比，各檸檬酸添加組腸道蛋白酶活性均顯著提高(P<0.05)，其中0.30%檸檬酸組的數(shù)值最高；0.30%和0.45%檸檬酸組腸道淀粉酶活性顯著高于對照組(P<0.05)。

表4 檸檬酸對草魚營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率和腸道消化酶活性的影響

2.4 血清生化指標(biāo)

各組草魚血清生化指標(biāo)見表5。與對照組相比，0.15%和0.30%檸檬酸組血清SOD活性、TP含量顯著增加(P<0.05)，MDA含量顯著降低(P<0.05)；此外，0.30%和0.45%檸檬酸組血清GLU含量也顯著升高(P<0.05)。各組血清TG和TC含量以及ALT、AST、AKP和CAT活性均無顯著差異(P>0.05)。

表5 檸檬酸對草魚血清生化指標(biāo)的影響

2.5 腸道組織形態(tài)

由表6可知，各檸檬酸添加組的腸道絨毛高度和肌層厚度均顯著高于對照組(P<0.05)，而絨毛寬度則表現(xiàn)為各組間無顯著差異(P>0.05)。各組腸道組織切片見圖1。

A：對照組 control group；B：0.15%檸檬酸組 0.15% citric acid group；C：0.30%檸檬酸組0.30% citric acid group；D：0.45%檸檬酸組 0.45% citric acid group。

3 討 論

3.1 檸檬酸對草魚生長性能和營養(yǎng)物質(zhì)利用的影響

在飼料中添加檸檬酸的作用效果受到飼料系酸力、檸檬酸添加量、魚的種類及生長階段等多方面因素影響。檸檬酸的作用首先是對飼料的酸化作用，同時(shí)檸檬酸帶有一定的芳香氣味，具有誘食效果[11]。Xie等[12]研究發(fā)現(xiàn)，適宜添加量的檸檬酸能有效刺激羅非魚的攝食行為。Kohbara等[13]發(fā)現(xiàn)L-乳酸能刺激褐菖鲉(Sebastiscusmarmoratus)的味覺感受器。本次試驗(yàn)重在研究飼料質(zhì)量的效果，故各組的投喂量基本保持一致，關(guān)于檸檬酸對草魚的誘食效果有待進(jìn)一步研究。

檸檬酸對草魚的促生長作用與其提高消化酶活性、提高營養(yǎng)物質(zhì)利用有關(guān)。對于無胃魚類來說，檸檬酸不可能通過激活胃蛋白酶對其產(chǎn)生作用，但檸檬酸可以使食糜呈酸性，進(jìn)而刺激腸道消化腺分泌更多的消化液，提高營養(yǎng)物質(zhì)的消化率。研究表明，檸檬酸能提高羅非魚的胃蛋白酶和腸道胰蛋白酶活性[14,17]。在紅鼓魚(Sciaenopsocellatus)[18]幼魚飼料中添加1.50%的檸檬酸提高了腸道胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性。王紀(jì)亭等[19]在飼料中添加0.30%的復(fù)合酸顯著提高了鯉魚(Cyprinuscarpio)腸道蛋白酶活性，淀粉酶和脂肪酶活性也有上升的趨勢。本試驗(yàn)在飼料中添加適量的檸檬酸對草魚腸道消化酶活性有促進(jìn)作用，同時(shí)干物質(zhì)、蛋白質(zhì)和磷的表觀消化率也得到了提高；但當(dāng)檸檬酸添加量過高時(shí)，腸道消化酶活性和營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率開始降低，說明過量的有機(jī)酸可能超過了腸道的中和作用，破壞腸道pH環(huán)境，導(dǎo)致腸道消化酶活性下降。過量酸化劑使腸道消化酶活性降低的報(bào)道也見于凡納濱對蝦[2]和羅非魚[17]。

檸檬酸對草魚的促生長作用還與磷等礦物元素利用率提高有關(guān)。一些礦物元素在堿性環(huán)境中易形成不溶性的鹽，難以被消化吸收。在酸性條件下，檸檬酸可以與一些礦物元素發(fā)生螯合作用，形成生物效價(jià)很高的螯合物而易被吸收。在低磷飼料中添加檸檬酸可以提高真鯛[7]、大口黑鱸(Micropterussalmoides)[20]和虹鱒[21]對磷的利用率，從而改善生長性能。Khajepour等[22]試驗(yàn)表明，檸檬酸能提高歐洲鰉(Husohuso)的磷表觀消化率。Pandey等[23]發(fā)現(xiàn)，檸檬酸可以提高虹鱒對氮和磷的保留率。本試驗(yàn)中，飼料中添加不同水平的檸檬酸均能顯著提高草魚的磷表觀消化率和沉積率，當(dāng)檸檬酸添加量為0.30%時(shí)，磷的表觀消化率和沉積率達(dá)到最大，但草魚的全魚磷含量各組之間沒有顯著差異，說明基礎(chǔ)飼料中的磷已能滿足生長的需要，磷沉積率的提高主要來自體增重的提高。

魚體脂肪的沉積受脂肪合成和分解代謝的影響。在肝臟中，脂肪由甘油-3-磷酸和脂肪酸合成，甘油-3-磷酸主要由糖代謝提供，脂肪酸主要來源于脂肪酸的從頭合成。檸檬酸能顯著提高小鼠細(xì)胞中乙酰輔酶A羧化酶的活性，促進(jìn)脂肪的合成和沉積；同時(shí)也能顯著降低激素敏感脂酶的活性，抑制脂肪的分解[24]。在羅非魚飼料中添加檸檬酸，顯著提高了肝臟6-磷酸葡萄糖脫氫酶和異檸檬酸脫氫酶的活性，而這2種酶均參與磷酸戊糖途徑，有助于產(chǎn)生還原型輔酶Ⅱ(NADPH)，從而促進(jìn)脂肪的合成代謝[25]。敬婷等[26]在飼料中添加不同水平的L-蘋果酸，發(fā)現(xiàn)湘云鯽(Carassiusauratus)的全魚粗脂肪含量和脂肪沉積率顯著提高。本試驗(yàn)結(jié)果與之類似，即在飼料中添加檸檬酸提高了草魚的全魚粗脂肪含量和脂肪沉淀率，其原因可能與脂肪合成代謝的增加和(或)脂肪分解代謝的減弱有關(guān)。各檸檬酸添加組草魚血清中GLU、TG和TC的含量均有上升的趨勢，也可能與此有關(guān)。

3.2 檸檬酸對草魚血清生化指標(biāo)的影響

血清GLU是機(jī)體主要的供能物質(zhì)。血清TP反映機(jī)體蛋白質(zhì)的代謝，同時(shí)也與免疫相關(guān)聯(lián)。血清膽固醇和TG是重要的脂類物質(zhì)，反映機(jī)體的脂類吸收和肝臟脂肪代謝狀況。在飼料中添加L-蘋果酸和檸檬酸顯著提高了異育銀鯽血清TP和白蛋白含量[27]。潘慶等[25]研究顯示，在飼料中添加檸檬酸和乳酸顯著提高了羅非魚血清中TG的含量。本研究中血清GLU、TP和TC含量隨檸檬酸添加量的增加呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，說明適量的檸檬酸可以促進(jìn)草魚的營養(yǎng)物質(zhì)代謝。ALT和AST主要存在于動(dòng)物的肝臟中，參與機(jī)體內(nèi)轉(zhuǎn)氨基作用。當(dāng)動(dòng)物肝臟受損或發(fā)生病變時(shí)，ALT和AST會(huì)釋放到血液中，導(dǎo)致血清中ALT和AST的活性升高[28]。血清AKP活性是判斷骨代謝狀況的一項(xiàng)重要指標(biāo)，當(dāng)動(dòng)物骨骼未發(fā)育完全或患佝僂病和軟骨癥時(shí)，其血清中AKP的活性會(huì)出現(xiàn)異常升高。李建平等[29]在斷奶仔豬飼糧中添加檸檬酸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對血清ALT、AST和AKP活性沒有顯著影響。在哲羅鮭(Huchotaimen)飼料中添加檸檬酸對血清ALT、AST和AKP活性也沒有顯著影響[30]。本研究中，各檸檬酸添加組草魚血清ALT、AST和AKP活性無顯著差異，說明檸檬酸不會(huì)影響草魚肝臟生理代謝和骨代謝。

此外，機(jī)體處于應(yīng)激條件下會(huì)產(chǎn)生過量的活性氧和自由基，導(dǎo)致機(jī)體受損。SOD能以氧自由基為反應(yīng)底物，通過歧化作用產(chǎn)生過氧化氫和氧，CAT能將產(chǎn)生的過氧化氫分解；丙二醛是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，其含量的多少反映組織過氧化損傷程度[31]。鄭建婷等[32]在肉兔飼糧中添加1.50%的檸檬酸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清SOD活性顯著升高；程義等[27]在異育銀鯽飼料中添加L-蘋果酸和檸檬酸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)顯著提高了肝臟SOD和CAT活性；程年成等[33]在黃顙魚飼料中添加檸檬酸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清SOD和CAT活性均有不同程度的提高。本研究表明，在飼料添加0.15%和0.30%的檸檬酸能顯著提高草魚血清SOD活性，降低血清MDA含量，反映出草魚的血清抗氧化能力得到了提高。

3.3 檸檬酸對草魚腸道組織形態(tài)的影響

腸道絨毛高度、數(shù)量和形態(tài)結(jié)構(gòu)可在一定程度上反映魚類腸道消化吸收能力的強(qiáng)弱。研究表明，有機(jī)酸對高豆粕飼料造成的龍膽石斑魚(Epinepheluslanceolatus)腸道損傷有修復(fù)作用[34]。在凡納濱對蝦[35]和羅非魚[36]的研究中，有機(jī)酸能改善腸道菌群，提高機(jī)體抵抗力，從而促進(jìn)動(dòng)物生長。李贊等[37]在飼料中添加1.0～16.0 g/kgL-蘋果酸，結(jié)果顯示羅非魚腸道表皮生長因子和表皮生長因子受體含量得到提高，前腸和中腸的絨毛高度和密度也有所提高。Chen等[38]發(fā)現(xiàn)，檸檬酸能緩解豆粕對大菱鲆腸道黏膜層造成的損傷，維持腸道菌群平衡。本試驗(yàn)中，檸檬酸能顯著提高草魚前腸的絨毛高度，肌層厚度也呈現(xiàn)上升的趨勢，說明檸檬酸能改善草魚腸道組織形態(tài)，一方面可能是檸檬酸參與了三羧酸循環(huán)，為腸道組織提供了更多的能量，促進(jìn)了腸絨毛發(fā)育；另一方面可能是檸檬酸通過降低腸道pH，抑制有害微生物生長，改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，從而促進(jìn)腸絨毛的發(fā)育。

值得注意的是，當(dāng)檸檬酸的添加量為0.45%時(shí)，腸道絨毛的中央乳糜管與周圍的平滑肌束分離，呈現(xiàn)“空泡”現(xiàn)象(圖1-D)。這表明過量的檸檬酸進(jìn)入腸道后，超出了草魚的調(diào)節(jié)能力，可能對腸道組織結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了不利影響，這可能也是0.45%檸檬酸組生長性能較0.30%檸檬酸組下降的重要原因。這種過量添加有機(jī)酸導(dǎo)致腸道結(jié)構(gòu)受損的報(bào)道也見于羅非魚[37]。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)條件下，在飼料中添加檸檬酸能提高草魚的營養(yǎng)物質(zhì)消化率和沉積率，降低飼料系數(shù)，改善腸道組織形態(tài)和功能，提高血清抗氧化能力，從而改善生長性能；檸檬酸在草魚飼料中的適宜添加量為0.30%。