煙薊馬取食與機械損傷對小蔥保護酶的影響

楊曉婷

（昌寧縣農田和農村能源管理站，云南昌寧 678100）

昆蟲取食和機械損傷時植物體同時存在保護酶系統，能夠清除體內多余的自由基。抗氧化系統實際就是保護酶系統，它由許多酶和還原性物質組成，其中超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）是主要的抗氧化酶，植物提高對逆境的抗性是通過抗氧化酶加強抗氧化作用，從而防治自由基毒害。SOD的活性氧脅迫，是植物在逆境脅迫條件下產生的，對于清除超氧自由基起關鍵作用。CAT是一種抗氧化酶，在植物體組織中普遍存在，是生物氧化過程中一系列抗氧化酶的終端，能夠有效清除植物體內多余的H2O2。POD是活性較高的適應性酶，能夠反映體內代謝狀況以及對外環境的適應性、植物生長發育的特性。

從春雷等研究了西花薊馬取食與機械損傷對菜豆葉片抗氧化系統的影響，發現西花薊馬取食與機械損傷兩種處理誘導及處理誘導時間的不同導致（SOD、POD、CAT）三種抗氧化酶活性有不同程度的升高，但變化規律不完全相同，西花薊馬對菜豆葉片的取食誘導明顯高于機械損傷對菜豆葉片抗氧化系統的影響。從春雷等對薊馬取食、機械損傷以及外源物對菜豆葉片的防御酶活性影響的研究，結果表明不同處理可誘導菜豆植株產生明顯的防御反應。其他昆蟲的取食和機械損傷也可以引起植物體內保護酶活性的變化，如MithoFer等研究表明，海灰翅夜蛾Spodoptera littoralis （Boisduval）取食和機械損傷處理后利馬豆Phaseolus Lunatus（Linnaeus）葉片內SOD、CAT及POD的活性均升高。毛紅等研究綠盲蝽取食與機械損傷對棉花葉片內防御酶活性的影響，結果表明綠盲蝽取食誘導不同抗性葉片的PAL、POD和PPO的活性顯著升高，機械損傷處理后，PAL、POD和PPO的活性變化沒有綠盲蝽取食誘導的明顯。本研究說明，這些酶活性的變化與逆境條件和脅迫時間有關。王艷穎等機械損傷對富士蘋果抗氧化酶活性的影響的研究表明，機械損傷顯著的影響了抗氧化酶的活性變化。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗蟲源

從周邊的蔥地采集煙薊馬成蟲，放到實驗室60 cm×60 cm×60 cm的養蟲籠中進行養殖，實驗室溫度在20～30 ℃適合煙薊馬成蟲的生長繁殖。在花盆上栽種小蔥放到養蟲籠里供煙薊馬成蟲食用。

1.1.2 不同處理操作

對照處理：在溫室大棚里栽種20盆小蔥，待蔥長大之后健康未受損小蔥葉片作為空白對照。

取食誘導處理：取10 cm長的健康小蔥蔥葉兩根，每根截成長度相等的3段放入玻璃管，用自制的吸蟲器吸取40頭煙薊馬成蟲放入玻璃管，立即用生物膜白處理，封上管口開始計時，進行煙薊馬的取食處理。

機械損傷誘導處理：在花盆上找到健康未受損的蔥葉，用消過毒的針頭在蔥葉上等距離刺10個孔作為機械損傷，并開始計時，做好標記。

1.1.3 實驗主要試劑與儀器

試驗主要試劑：測定植物三種保護酶試劑盒中的各種試劑，包括0.1mL/L磷酸鹽pH值7.0～7.4緩沖液、雙蒸水、Nacl。

試驗主要儀器：光照培養箱、電子天平、吸蟲管、容量瓶、昆蟲飼養籠、移液槍、藥匙、試管、水浴鍋、低速冷凍多管離心機、離心管、玻璃棒、小刀、分光光度計。

1.2 試驗方法

1.2.1 過氧化物酶（POD）的活力測定

稱取小蔥葉片1 g，為制備不同濃度的勻漿液加入不同量的Nacl，在0 ℃冰箱內靜置3 min后取出，立即機械勻漿，3500 r/min的條件下離心10 min，取上清液待測。待測液于420 nm處顯色反應，步驟（見表1）。

表1 測定POD活性試劑用量（mL）

1.2.2 超氧化物歧化酶（SOD）的活力測定

稱取小蔥葉片1g，為制備不同濃度的勻漿液加入不同量的0.1mL/L磷酸鹽pH值 7.0～7.4緩沖液，在0℃冰箱內靜置3 min后取出，立即機械勻漿，3500 r/min的條件下離心10 min，取上清液待測。待測液于550 nm處顯色反應，步驟（見表2）。

表2 測定SOD活性試劑用量（mL）

1.2.3 過氧化氫酶（CAT）的活力測定

稱取小蔥葉片1g，為制備不同濃度的勻漿液加入不同量的生理鹽水，在0℃冰箱內靜置3 min后取出，立即機械勻漿，3500 r/min的條件下離心10 min，取上清液待測。待測液于405 nm處顯色反應，步驟（見表3）。

表3 測定CAT活性試劑用量（mL）

2 結果與分析

2.1 組織勻漿濃度和不同處理對小蔥超氧化物歧化酶活力的影響

2.1.1 組織勻漿濃度對小蔥超氧化物歧化酶活性的影響

根據勻漿濃度與絕對OD值繪制標準曲線，由圖1可知，當組織勻漿濃度為0.03g/mL以后，絕對OD值變趨近于0.6，濃度再升高，絕對OD值差異不大。所以當組織勻漿濃度為0.03g/mL時，超氧化物歧化酶活性趨近于最大值。

圖1 勻漿濃度與絕對OD值變化趨勢圖

2.1.2 不同處理對超氧化物歧化酶活力的影響

煙薊馬取食與機械損傷誘導處理小蔥葉片后，SOD的活力在不同時間內表現不同。誘導24 h時取食誘導蔥葉內SOD活力與健康植株相比無明顯變化，機械損傷處理明顯高于健康植株；誘導48 h時煙薊馬取食和機械損傷處理SOD活力明顯高于健康植株；誘導72 h時煙薊馬取食處理SOD活力升高到最高值，至96 h時酶活力略有下降，但仍然高于健康植株，機械損傷處理和健康植株酶活力無明顯變化（見表4）。

表4 不同處理的SOD活力時間變化（U/g）

由圖2可知，健康植株活力在不同時間保持不變在77 U/g附近；機械損傷在處理24 h時就達到了最大值123 U/g，后逐漸下降；煙薊馬取食處理是一個先上升后下降的過程，在72 h時達到最高點123 U/g。

圖2 不同處理的SOD活力時間變化

2.2 組織勻漿濃度和不同處理對小蔥過氧化物酶活力的影響

2.2.1 組織勻漿濃度對小蔥過氧化物酶活性的影響

由圖3可看出，當植物組織勻漿濃度在0.04 g/mL以后，絕對OD值在0.45附近，濃度再增加絕對OD值變化不大，所以組織勻漿濃度為0.04 g/mL時活性趨近最大值。

圖3 勻漿濃度與絕對OD值變化趨勢圖

2.2.2 不同處理對過氧化物酶活力的影響

煙薊馬取食和機械損傷誘導對POD活力的影響在不同時間范圍有所不同。由表5可知，誘導處理24 h時，機械損傷和取食誘導處理對蔥葉內POD活力無明顯影響；48 h時兩種誘導處理的POD活力明顯高于健康植株，但兩處理之間無顯著差異；至72 h時兩處理的蔥葉POD活力均達到最高值，且明顯高于健康植株，煙薊馬取食誘導的POD活力也明顯高于機械損傷。隨后酶活力下降；到96 h時兩種處理與健康植株均無明顯差異。

表5 不同處理的POD活力時間變化（u/g）

由圖4可看出，健康植株在不同時間的變化過程中，POD活性變化不明顯，活力值接近60 U/g；機械損傷處理POD活力是先上升后下降，在72 h時達到最大值97 U/g，后下降至與健康植株差別不大；煙薊馬取食處理也是先上升后下降的過程，在72 h時達到最大值133 U/g，后下降到健康植株酶活力水平。

圖4 不同處理的POD活力時間變化

2.3 組織勻漿濃度和不同處理對小蔥過氧化氫酶活力的影響

2.3.1 組織勻漿濃度對小蔥過氧化氫酶活性的影響

根據勻漿濃度與絕對OD值繪制標準曲線（圖5），由圖可看出當勻漿濃度為0.03 g/mL以后，絕對OD值趨近于0.35，濃度再升高，絕對OD值變化不大，所以當組織勻漿濃度為0.03 g/mL時，過氧化氫酶活性趨近于最大值。

圖5 勻漿濃度與絕對OD值變化趨勢圖

2.3.2 不同處理對過氧化氫酶活力的影響

煙薊馬取食與機械損傷對小蔥CAT活力在時間范圍內也有明顯變化。24 h時機械損傷與取食誘導處理酶活力都略高于健康植株；至48 h時誘導處理葉片與健康植株相比差異顯著；72 h時煙薊馬取食處理酶活力顯著上升，機械損傷處理下降，但仍然高于健康植株；96 h時煙薊馬取食上升至最大值，機械損傷和健康植株酶活力無明顯差異，（見表6）。

表6 不同處理的CAT活力時間變化（U/g）

（續上表）

由圖6可看出，健康植株在不同時間CAT活力無明顯變化，活力值接近45 U/g；機械損傷是一個先上升后下降的過程，在48 h時達到最高值91 U/g，后下降到和健康蔥葉活力無明顯差異；煙薊馬取食誘導是一個逐漸上升的過程，在96 h時達到最高值。

圖6 不同處理的CAT活力時間變化

3 結 論

3.1 薊馬取食與機械損傷對過氧化物酶活力的影響

薊馬取食誘導處理SOD活力隨處理時間不斷上升，最大值出現在72 h時（123.48 U/g），至96 h時SOD活力已降至與48 h時接近；機械損傷處理在24 h時就達到了最大值（123.84 U/g），之后SOD活力一直下降，至96 h時與健康植株接近；兩誘導處理葉片SOD活力顯著高于健康植株，在整個誘導處理過程中，煙薊馬取食誘導SOD活力也明顯高于機械損傷誘導。

3.2 煙薊馬取食與機械損傷對超氧化物歧化酶活力的影響結果

煙薊馬取食誘導處理、機械損傷誘導處理POD活力變化均為先上升后下降。誘導處理24 h時，機械損傷和取食誘導處理對蔥葉內POD活力無明顯影響；48 h時兩種誘導處理的POD活力明顯高于對照處理；至72 h時兩處理的蔥葉POD活力均達到最高值，且明顯高于健康植株，煙薊馬取食誘導POD活力也明顯高于機械損傷誘導；到96 h時兩種處理與健康植株均無明顯差別。

3.3 煙薊馬取食與機械損傷對過氧化氫酶活力的影響結果

機械損傷誘導處理CAT活力變化是先上升后下降，最大值出現在48 h時（91.22 U/g）之后不斷下降，至96 h時與對照接近；煙薊馬取食誘導24 h時CAT活力比健康植株略高，之后一直上升，96 h時酶活力達到最大值（96.47 U/g）；煙薊馬取食誘導處理CAT活力最大值略高于機械損傷誘導處理。

總之，煙薊馬取食誘導和機械損傷處理對蔥葉內過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活力均有影響，影響度是：煙薊馬取食處理＞機械損傷處理＞對照處理；保護酶活性在誘導的不同時間段變化規律也不完全相同，煙薊馬取食處理對小蔥保護酶的影響高于機械損傷處理。