異煙肼耐藥肺結核患者對丙硫異煙胺和對氨基水楊酸的耐藥情況分析

馬婷婷 任斐 馬進寶 楊翰

丙硫異煙胺(Pto)和對氨基水楊酸(PAS)作為二線抗結核藥品，因其價格低廉、藥物可及性高、可聯合其他二線抗結核藥品，仍較多應用于我國結核病治療中[1]。但Pto作為INH的類似物，其與INH的交叉耐藥一直是臨床較關注的問題。而PAS作為問世較早的抗結核藥品，臨床上常與INH聯合使用以增強INH的抗結核活性[2]，這些均導致耐INH結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)對Pto及PAS的耐藥率并不低，分別可達19.3%和11.9%[3]。同時，劉銀萍等[4]采用基因芯片法檢測MTB的INH耐藥inhA基因突變對檢測MTB對Pto耐藥的敏感度為60.0%，且與Pto的交叉耐藥率為20.0%，認為inhA基因突變可能是INH與Pto交叉耐藥的原因。為進一步了解耐INH的MTB對Pto及PAS耐藥是否與INH耐藥密切相關，以及inhA基因突變與Pto耐藥是否存在關聯，筆者對耐INH肺結核患者對Pto及PAS的耐藥情況進行分析，以指導兩藥在臨床上的應用。

資料和方法

1.研究對象：采用回顧性分析的方法，搜集2018年1月1日至2020年12月31日就診于西安市胸科醫院且符合入組標準的4021例分枝桿菌培養陽性患者臨床資料；排除168例非結核分枝桿菌感染患者后(MPB64單克隆抗體測定陰性)，對3853例肺結核患者(培養和MPB64單克隆抗體測定均陽性)的BACTEC MGIT 960(簡稱“MGIT 960”)液體藥物敏感性試驗[簡稱“藥敏試驗”；檢測INH和利福平(RFP)耐藥]、比例法藥敏試驗(檢測Pto和PAS耐藥)和實時熒光定量PCR熔解曲線法(檢測inhA和katG基因突變)的檢測結果進行整理。3853例肺結核患者中，849例(22.03%)為INH耐藥，其中，男性566例(66.67%)，女性283例(33.33%)；年齡范圍為2～84歲，年齡中位數(四分位數)為37.0(26.0，54.0)歲；耐多藥和非耐多藥患者分別為515例(60.66%)和334例(39.34%)；初、復治患者分別為582例(68.55%)和267例(31.45%)。

2.入組標準：納入痰液或支氣管肺泡灌洗液分枝桿菌MGIT 960培養陽性，醫院信息系統(HIS)中有MGIT 960和比例法藥敏試驗及PCR熔解曲線法耐藥基因檢測結果者。排除經MPB64單克隆抗體測定結果為陰性(非結核分枝桿菌)者。

3.液體培養及初步菌種鑒定：采用MGIT 960培養系統操作。首先對患者痰液或支氣管肺泡灌洗液標本進行預處理，取0.5 ml處理過的標本放入MGIT 960專用管中，在MGIT 960儀器中進行培養。對培養陽性標本進行MPB64單克隆抗體測定，進一步對判定為MTB的菌株行藥敏試驗。

4.藥敏試驗：使用MGIT 960藥敏試驗檢測INH和RFP的耐藥性，兩者耐藥濃度分別為 0.1 μg/ml 和 1.0 μg/ml；使用比例法藥敏試驗檢測Pto和PAS耐藥性，二者耐藥濃度分別為40 μg/ml和1 μg/ml。

5.耐藥基因檢測：參照實時熒光定量PCR熔解曲線法MTB耐藥基因突變檢測試劑盒說明書進行試劑配制。取5 μl待檢測核酸加入反應體系，瞬時離心，彈去氣泡后上機檢測。使用0.5麥氏單位H37Rv菌懸液按照Lad-Aid 824 MTB核酸提取試劑盒說明書提取核酸，與試劑盒自帶陽性對照、陰性對照及樣品同時進行檢測。菌液熔解曲線與陽性對照結果均敏感為質量控制合格，陰性對照用于檢測環境及操作過程中的污染。

6.統計學處理：使用SPSS 18.0軟件對數據進行統計分析。計數資料以“構成比或百分率(%)”表示，組間差異的比較采用χ2檢驗。inhA基因突變與Pto耐藥檢測的一致性采用Kappa值判定，當Kappa值≥0.75說明一致性好，Kappa值<0.4說明一致性差，0.75>Kappa值≥0.4說明一致性一般。

結 果

1.對Pto和PAS的耐藥情況：849例INH耐藥患者中，Pto耐藥33例，耐藥率為3.89%；其中，Pto耐藥比例在耐多藥與非耐多藥、初治與復治患者中的差異均有統計學意義。PAS耐藥101例，耐藥率為11.90%；其中，PAS耐藥比例在耐多藥與非耐多藥患者中的差異有統計學意義，但在初治與復治患者中的差異無統計學意義，見表1。

表1 不同特征異煙肼耐藥肺結核患者對丙硫異煙胺和對氨基水楊酸的耐藥情況

2.inhA及katG基因突變情況：849例INH耐藥肺結核患者中，518例進行了耐藥基因檢測，發現katG基因突變者382例，突變率為73.75%；inhA基因突變者82例，突變率為15.83%；其中，24例(4.63%)同時存在katG及inhA突變，78例(15.06%)未檢測到katG和inhA基因突變。二者聯合檢測INH耐藥率達84.94%(440/518)。

3.inhA基因突變與Pto耐藥的一致性分析：518例行耐藥基因檢測者中，Pto耐藥者20例，耐藥率為3.86%。其中，82例inhA基因突變者中，Pto敏感75例(91.46%)、耐藥7例(8.54%)，與Pto耐藥者中發生inhA基因突變(35.00%，7/20)的一致性較差，Kappa值為0.080。

討 論

結核病的治療遵循“早期、聯合、適量、全程、規律”，但因MTB生長緩慢，耐藥結核病早期診斷仍較困難，而分子生物學檢測方法為其提供了可能。katG和inhA基因突變是MTB對INH耐藥的常見基因突變位點，二者聯合檢測INH耐藥的陽性率可高達90%左右[4]，尤以katG基因突變更為常見。本研究二者聯合檢測INH的耐藥率達84.94%，katG基因突變率為73.75%，與周愛萍等[5]對西安市117株INH耐藥MTB菌株katG315位點突變率(69.23%)和Huo等[6]對2015年北京胸科醫院INH耐藥MTB菌株katG基因突變率(70.5%)的結果基本一致。但本研究inhA基因突變率(15.83%)高于周愛萍等[5]的研究結果(8.55%)，低于Huo等[6]報道(26.7%)，且仍有15.1%(78例)的INH耐藥患者未檢測到katG或inhA基因突變，提示INH耐藥除與katG和inhA耐藥基因突變相關外，可能還存在其他耐藥基因，如ahpC、oxyR及kasA等，其中，ahpC基因突變率在部分患者中可達15%～20%左右[7-9]，提示依靠katG及inhA檢測MTB分離株對INH耐藥可能會出現漏診，增加ahpc等基因突變檢測可能會提高診斷敏感度。

PAS為抗結核抑菌藥物[10]，目前在《耐藥結核病化學治療指南(2019年簡版)》[2]藥物分組中位列C組，因其與INH聯用時可增加INH的活性，并可延遲INH及鏈霉素的耐藥性[11]，在與INH聯合使用時可提高部分復治、難治及耐藥肺結核患者的治療效果[12]。本研究中，INH耐藥患者對PAS的耐藥率為11.90%，與Li等[3]研究結果(11.90%)一致，且與患者是否為耐多藥有關，說明INH耐藥結核病患者對PAS的耐藥率并不低，應重視耐多藥患者的藥敏試驗結果。但隨著抗結核新藥的問世及越來越多的臨床研究，PAS在耐多藥結核病治療中的地位逐漸降低[13]，其耐藥率也呈逐年下降趨勢[14]。筆者認為，隨著PAS使用率的降低，需要進一步考慮其用藥定位，加之其在INH耐藥結核病患者中的耐藥率較高，建議在準確藥敏試驗結果支持下使用，并應考慮既往用藥史及與耐藥結核病患者接觸史等。

Pto也因新型抗結核藥物的出現而使用減少，但因新型藥品價格及可獲得性問題，其在我國仍被用于耐藥結核病的治療。本研究INH耐藥患者中，Pto的耐藥率僅為3.89%，與趙冰等[15]調查的我國耐多藥結核病患者Pto耐藥率(3.2%)基本接近，提示Pto在我國的耐藥率較低，但并未表現出隨時間延長而降低的趨勢。雖然Pto是INH的類似物，但其與INH的耐藥分子機制并不完全相同，Pto的耐藥機制可能包括了inhA、ethA、ethR等基因突變[16]。宋艷華等[17]研究顯示，Pto耐藥MTB菌株中inhA基因突變率較低，約為20%左右；Tan等[18]研究我國南部地區282株MTB分離株，發現inhA基因突變率達59.4%，且16.3%的菌株對Pto耐藥，51.4%的菌株存在ethA基因突變。這提示inhA基因突變可能只是耐多藥結核病患者Pto耐藥的原因之一，而且可能存在地域性差異。另外，不同研究報道Pto耐藥MTB的inhA基因突變率是不同的，Lee等[19]對朝鮮地區206例存在katG及inhA基因突變的患者進行研究，發現Pto耐藥MTB的inhA基因突變率為61.8%；而Islam等[20]研究中在INH和Pto均耐藥的MTB中inhA基因突變率為33.5%，與本研究(35.00%)接近，但本研究證實了inhA基因突變與Pto耐藥的一致性較差，提示inhA基因突變可能不是Pto耐藥的主要分子機制，臨床使用Pto時應參照表型藥敏試驗結果，在使用分子生物學手段檢測MTB對Pto耐藥性時也應檢測更多的基因突變位點。

綜上，INH耐藥肺結核患者katG及inhA基因突變率較高，對PAS耐藥率較高，但對Pto耐藥率較低；inhA基因突變與Pto耐藥的一致性較差，可能存在其他耐藥基因，后續應對Pto其他耐藥基因突變位點進一步研究。