淫羊藿苷治療支氣管哮喘作用機制的網絡藥理學研究*

李竹英 陳 璐 王麗潔， 王 玨△

（1.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫藥大學，黑龍江哈爾濱 150040）

支氣管哮喘（簡稱哮喘）臨床表現為反復發作的喘息、氣短、胸悶或咳嗽等癥狀，以氣道慢性炎癥，氣道高反應性和氣道重塑為主要特征，因其不斷增長的發病率和死亡率而備受世界關注。中國肺健康研究顯示，目前我國哮喘患病人數約4 570萬，總體發病率達4.2%［1］。我國哮喘患者對疾病的認知水平普遍較低，導致全國范圍內哮喘控制水平仍低于發達國家，尚未達到全球哮喘防治倡議（GINA）中設定的目標［2］。因此，如何堅持長期管理、合理規范化的治療、有效地改善哮喘控制現狀、預防未來風險的發生成為我們目前急需解決的問題。西醫治療哮喘的常用藥物為糖皮質激素，雖然其具有較強的抗炎作用，但是長期服用會造成口咽念珠菌感染、聲音嘶啞等副作用，給患者帶來了較大的心理負擔。哮喘歸屬中醫學“哮病”范疇。中藥治療哮喘具有藥性溫和、藥效持久、副作用小、成本低廉等優勢，可明顯改善患者臨床癥狀，提高患者的生活質量。

淫羊藿苷是淫羊藿的主要活性成分，可以通過誘導嗜酸性粒細胞凋亡、調節Th1/Th2細胞分化和Th17/Treg細胞功能、促進炎癥細胞因子及趨化因子受體釋放等多種途徑干預哮喘的發生［3-6］。本課題組前期研究發現淫羊藿苷可以調控Smad和MAPK信號通路減輕哮喘氣道上皮間質轉化［7］、抑制NF-κB和STAT3的表達、改善哮喘氣道炎癥和氣道重塑［8］。以上研究表明淫羊藿苷治療哮喘的療效比較確切，但多從單一成分或單一靶點進行探討，其具體的分子作用機制研究相對匱乏。本研究基于網絡藥理學方法，探究淫羊藿苷治療哮喘的作用靶點和相關通路，為淫羊藿苷治療哮喘的分子機制的闡明提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 淫羊藿苷的靶點預測 通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）檢索“Icariin”，可獲得淫羊藿苷的分子結構和ADME相關參數。將淫羊藿苷的分子結構保存為mol2格式文件上傳至PharmMapper數據庫（http：//lilab.ecust.edu.cn/Pharmmapper/）進行靶點預測，將Select Target Set設置為 Human Protein Target Only，選取 Z′-score＞0的結果作為淫羊藿苷的靶點。利用蛋白質數據庫（Uniprot，http//www.Unitprot.org/）中的 Uniprot KB 檢索功能，將靶點蛋白名轉換為基因名，重復靶點僅保留1個，所得靶點即為淫羊藿苷的預測靶點。

1.2 哮喘相關靶點的獲取 以“asthma”為檢索詞從Genecards數據庫（https：//www.genecards.org/）網絡平臺庫中檢索哮喘的相關靶點。同時將淫羊藿苷的預測靶點與哮喘的相關靶點在Venny 2.1.0中映射篩選出共同靶點，即為淫羊藿苷作用于哮喘的潛在靶點。

1.3 蛋白相互作用（PPI）網絡的構建 將“1.2”中獲取的潛在靶點導入String數據庫（https：//string-db.org/），獲取PPI數據，將PPI數據導入Cytoscape 3.7.0中構建交集蛋白相互作用網絡圖。

1.4 基因本體（GO）功能富集分析和京都基因與基因組數據庫（KEGG）通路富集分析 運用Bioconductor生物信息軟件包（http：//www.bioconductor.org/）將淫羊藿苷作用于哮喘的潛在靶點進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，通過R語言中“Cluster profiler”進行可視化處理，設定閾值P＜0.05為指標進行篩選，選取P值前20條目制圖。GO功能富集分析可以了解靶點主要的作用過程，KEGG通路富集分析可以觀察靶點在通路中的分布情況。

2 結果

2.1 淫羊藿苷的靶點篩選結果 通過TCMSP檢索淫羊藿苷的OB和DL值分別為41.58%和0.61，符合文獻中化合物的篩選原則［9-10］，表明淫羊藿苷的成藥性良好。通過Pharm Mapper數據庫對淫羊藿苷進行靶點預測，得到排名前300的靶點，選取Z′-score＞0的靶點導入Uniprot數據庫進行基因標準化，刪除重復項，共得到淫羊藿苷的預測靶點204個，其中排名前50的靶點見表1。

表1 淫羊藿苷的預測靶點

2.2 哮喘相關靶點的獲取結果 在Genecards數據庫中搜索到哮喘相關靶點5 973個，將204個淫羊藿苷的預測靶點與哮喘相關靶點進行映射，取二者交集得到共同靶點125個，見圖1。

圖1 淫羊藿苷的預測靶點與哮喘相關靶點韋恩圖

2.3 PPI網絡構建結果 為進一步研究淫羊藿苷治療哮喘的作用機制，將映射所得125個共同靶點進行PPI網絡分析，將得到的PPI數據上傳至Cytoscape 3.7.0軟件進行可視化處理，網絡圖中包括125個節點、771條邊，圖中節點大小和顏色表示靶點degree的值，節點越大，顏色由藍色到紫色，表示靶點的度值越大，反之表示越小，見圖2。蛋白激酶B1（Akt1）、基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、Ras同源基因家族成員A（RhoA）、基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）的degree值排名靠前，可能是淫羊藿苷發揮中醫臨床功效以及與哮喘產生關聯的關鍵作用靶點。

圖2 淫羊藿苷和哮喘共同靶點PPI網絡圖

2.4 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析結果

將上述125個潛在靶點經R語言運行后可得到GO功能富集分析（P＜0.05）110個條目，按照P值從小到大順序排列，排名前20的GO條目繪制成氣泡圖，氣泡節點越大則富集基因數目越多，顏色越紅則富集越顯著。如圖3所示，蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、細胞因子受體結合、核受體活性、激活轉錄因子結合等方面靶點富集較集中。結果提示淫羊藿苷可以調控多種生物學途徑防治哮喘。

圖3 GO功能富集分析

KEGG通路富集分析篩選得到113條（P＜0.05）通路，按照P值從小到大順序排列，排名前20的通路繪制成柱狀圖，柱狀圖長度越長則富集基因數目越多，顏色越紅則富集越顯著，見圖4。我們得到淫羊藿苷治療哮喘的主要信號通路為T細胞受體信號通路、FoxO信號通路、Relaxin信號通路和VEGF信號通路。

圖4 KEGG通路富集分析

3 討 論

本研究基于網絡藥理學的方法，借助相關數據庫與軟件對淫羊藿苷治療哮喘的作用機制進行探討，得出了淫羊藿苷治療哮喘的潛在靶點125個。PPI網絡顯示淫羊藿苷治療哮喘的各靶點之間關系密切，其中degree值前5位的靶點依次為Akt1、MMP-9、MAPK1、RhoA、MMP-2，可能為淫羊藿苷發揮中醫臨床功效以及與哮喘產生關聯的關鍵作用靶點。Akt可以通過多種途徑參與哮喘的發病過程。研究發現，Akt可以通過調控中性粒細胞凋亡、氧化-抗氧化失衡、Th細胞的分化和細胞因子的產生調節哮喘的氣道炎癥反應［11-13］。Akt可以通過調節上皮細胞間充質轉化及上調VEGF的表達促使血管再生來參與哮喘氣道重塑［14-15］。此外，若Akt去磷酸化可以抑制氣道的高反應性，其機制可能與其減少HIF-α的表達有關［16］。MMP-9、MMP-2可以通過降解以Ⅳ型膠原為主的細胞外基質和血管中的膠原成分，誘導氣道平滑肌細胞增殖、分化、遷移至氣道壁和血管外，增加平滑肌肌層厚度和促進新血管形成，引發哮喘氣道重塑［17-18］。MAPK1是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族成員之一。MAPK信號通路可以通過介導炎癥、免疫應答、氣道結構細胞反應等途徑參與哮喘的發生和發展［19］。RhoA是Rho/Rock信號通路的關鍵受體調節型蛋白，活化后的RhoA可以激活下游效應物Rock作用于氣道平滑肌細胞，調節細胞因子和炎性因子等產生，增加氣道平滑肌的收縮力，在哮喘的氣道重塑和氣道高反應性的形成和發展中起關鍵作用［20］。由此可見，淫羊藿苷的關鍵靶點主要通過減輕炎癥反應、改善氣道重塑、抑制氣道高反應性等多方面發揮治療哮喘的作用。

GO功能富集分析發現，淫羊藿苷治療哮喘的潛在靶點主要涉及細胞因子、轉錄因子的活性及受體結合、抗氧化應激、激素調節、蛋白質活性和酶活性等生物學功能。通過KEGG富集分析發現淫羊藿苷可以通過調控多條信號通路達到治療哮喘的目的，其中與T細胞受體信號通路的關系最為密切，如圖5所示。哮喘是以Th2免疫反應為主的慢性氣道炎癥性疾病。Th2細胞的增殖分化主要通過共刺激分子結合T細胞受體所介導的信號途徑來完成［21］。T細胞受體作為抗原識別和免疫反應的核心，可以通過多種形式參與T細胞活化，在哮喘的發病過程中發揮著重要作用。研究顯示，T細胞表面的TCR-CD3復合物與樹突細胞表面的MHC復合物可以發生特異性的結合，釋放抗原識別信號激活初始T細胞，使之增殖分化，從而導致哮喘的發生［22］。CD40L可以調節CD4+T細胞與B細胞之間的免疫應答，同時激活抗原遞呈細胞，被認為是哮喘發病途徑的關鍵所在［23］。CD28能夠促進Th2細胞因子的釋放和募集嗜酸性粒細胞聚集引發哮喘氣道炎癥［24］。ICOS通過T細胞受體信號的誘導，高表達于活化后的T細胞上，而ICOS的效應T細胞可以促進抗原特異性IgE的生成參與哮喘的過敏反應［25］。PD-1和CTLA-4主要表達于活化的T細胞表面，參與免疫應答的負向調控。PD-1的主要配體PDL-1和PDL-2分別通過抑制Th1和Th2細胞介導的炎癥反應調控哮喘氣道的反應性［26］。研究顯示，哮喘患者普遍存在CD4+/CD8+失衡的免疫功能紊亂現象，且與肺功能呈現一定的相關性［27］。姜春燕等［28］研究發現，FoxO信號通路通過調控巨噬細胞M2極化和Th2免疫應答參與哮喘的炎癥反應。韓曙光［29］研究顯示，松弛素（Relaxin）可以通過降低細胞周期蛋白D1（Cyclin D1）的表達，抑制氣道平滑肌細胞的增殖力，延緩哮喘小鼠氣道重塑進程。VEGF信號通路可以通過刺激血管內皮細胞增殖，促進氣道血管擴張和通透性增強，促使支氣管周圍纖維化等方式調控哮喘氣道重塑［30］。以上的研究結果與本文的網絡藥理學預測結果較為一致，進一步印證了淫羊藿苷治療哮喘的作用機制。

圖5 T細胞受體信號通路

綜上所述，淫羊藿苷可通過多靶點、多通路發揮對哮喘的治療作用。淫羊藿苷通過調控T細胞受體信號通路、FoxO信號通路、Relaxin信號通路和VEGF信號通路作用于Akt1、MMP-9、MAPK1、RhoA、MMP-2等靶點，對哮喘所引發的炎癥反應、氣道高反應性及氣道重塑發揮治療作用。鑒于本文僅是通過數據挖掘的形式對淫羊藿苷治療哮喘的作用機制進行預測，故存在一定的局限性，后期還需要更加深入的基礎實驗和臨床試驗予以佐證。