三七總皂苷對腦缺血再灌注大鼠TLR4/NF-κB信號通路及炎性細胞因子的影響*

周玉嘉 張允嶺 周 晶 田 沫 馬青科 金香蘭 張志辰△

（1.北京中醫藥大學東方醫院，北京 100078；2.中國中醫科學院西苑醫院，北京 100191；3.北京第一中西醫結合醫院，北京 100026）

根據《全球疾病負擔研究》報告，中風已成為第2大死亡原因，也是全球殘疾調整生命年的第3大原因［1］。近年來，缺血性卒中的臨床治療手段越來越多樣化，大量研究表明，血管再通是治療缺血性腦卒中的最有效手段。中風后的腦損傷是由于流向大腦的血液中斷以及受損區域缺氧引起的［2］。然而，對于發生血栓后的組織來說血供的重建會提高損傷的程度，即缺血再灌注損傷（I/RI）［3］。炎癥是I/RI的主要機制之一［4］，神經缺血缺氧后可激活Toll樣受體4（TLR4），激活核因子-κB（NF-κB），被激活的NF-κB可以促進多種促炎性細胞因子合成，促進小膠質細胞釋放促炎性細胞因子白細胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α），減少抑炎性細胞因子白細胞介素-4（IL-4）、白細胞介素-10（IL-10）等釋放，擴大炎癥反應。因此，靶向抑制TLR4/NF-κB信號通路，可降低腦組織促炎性細胞因子的表達，改善組織炎性損傷。

三七總皂苷是三七提取物，臨床上廣泛應用于心腦血管疾病。基礎研究發現，三七總皂苷可以改善大鼠腦、心、腎等臟器I/RI損傷［5-8］。目前研究認為，三七總皂苷對腦缺血/再灌注損傷的保護機制涉及其對自由基及脂質過氧化物、細胞凋亡、鈣通道、神經元損傷、相關信號通路蛋白表達等［6］。本研究旨在從TLR4/NF-κB信號通路及炎癥因子角度，探討三七總皂苷對腦缺血/再灌注大鼠腦組織的保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性Wistar大鼠45只，體質量（275±25）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，使用許可證編號：SYXK（京）2019-0013。飼養于北京中醫藥大學東方醫院動物中心，飼養級別為SPF級，5只/籠，保證正常光照節律、溫度適度、環境安靜，正常大鼠生長繁殖飼料飼養，自由進食和飲水。本研究通過北京中醫藥大學動物實驗倫理審批（批號：2019072）。

1.2 試藥與儀器 三七總皂苷（廣西梧州制藥有限公司，生產批號：19060106）。大鼠線栓（廣州佳靈生物科技有限公司，規格：L3600）；大鼠IL-1β ELISA試劑盒（Abcam，ab100768）；大鼠TNF-α ELISA試劑盒（Abcam，ab100785）；大鼠IL-4 ELISA試劑盒（Abcam，ab100771）；大 鼠 IL-10 ELISA 試 劑 盒（Abcam，ab100765）；Anti-TLR4抗體（Abcam，ab217274）；Anti-NF-κB p65抗體（Abcam，ab16502）。顯微鏡（Leica公司，型號DM3000）；酶標分析儀（無錫華衛德朗儀器有限公司，DR-200BS）；高級凝膠成像系統（基因有限公司，G：BOX F3）。

1.3 分組與造模 所有大鼠適應性飼養1周后，隨機分為假手術組、模型組、中藥組各15只。模型組及中藥組建立I/RI模型。造模方法：10%水合氯醛（0.35 g/kg）麻醉大鼠，麻醉成功之后，大鼠固定于操作臺，頸部正中切口，游離右側頸總動脈、頸內動脈及頸外動脈，頸外動脈及結扎，夾閉頸總動脈，在大鼠做一V型切口，插入線栓并緩慢向前推進，直至插入大腦中動脈，輕遇阻力即停止。栓塞2 h后，緩慢拔出線栓，逐層縫合大鼠傷口。假手術組不插入線栓外，其余操作與模型組及中藥組相同。造模24 h后評估模型成果，成功標志：Longa神經功能分級評分≥2分的大鼠為模型制備成功。剔除各組造模不成功大鼠及死亡大鼠，最終假手術組14只，模型組12只，中藥組13只。

1.4 給藥方法 中藥組大鼠尾靜脈注射三七總皂苷50 mg/kg（給藥劑量參考文獻［7］），模型組及假手術組給予等量0.9%氯化鈉注射液尾靜脈注射。各組給藥均每日1次，連續3 d。

1.5 神經行為學評分 給藥3 d后，對所有大鼠進行Garcia評分［8］，從大鼠自主運動、體態對稱性、前肢伸展功能、攀爬運動、身體雙側觸覺、雙側胡須碰觸反應等6個方面評估大鼠神經功能損傷的程度。分值為3～18分，數值越大，神經功能損傷越輕，18分為正常。

1.6 標本采集與檢測 1）大鼠腦組織HE染色。各組大鼠完成神經行為學評分后，每組隨機取3只大鼠麻醉，4%多聚甲醛灌注固定，留取腦組織制作5 μm的冠狀石蠟切片。切片脫蠟、復水后進行HE染色，在普通光學顯微鏡下觀察大鼠腦組織形態變化。2）大鼠腦組織氯化三苯基四氮唑（TTC）染色。每組隨機取3只大鼠麻醉，生理鹽水心臟灌注，留取干凈腦組織迅速放入-20℃冰箱里冷凍，20 min后取出，冠狀位切5～6片，每片厚約2 mm。切好的腦組織用2%TTC染色液37℃孵育染色30 min，沖掉多余染色液，4%多聚甲醛固定，24 h后拍照，計算腦梗死面積。3）大鼠腦組織小膠質細胞炎性細胞因子IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10水平檢測。各組剩余大鼠麻醉后迅速留取腦組織，-80℃保存用于細胞因子檢測及蛋白免疫印跡法（Wester blotting）檢測。取大鼠新鮮腦組織50 mg，在預冷PBS（0.01 mol/L，pH=7.0～7.2）中清洗去除血液，將組織切成小塊，均勻地放入放置在冰上勻漿，勻漿液4℃低溫冷凍離心機10 000 r/min離心5 min，留取上清液用于檢測。分別用IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10 ELISA試劑盒檢測各個大鼠腦組織細胞因子含量，具體操作步驟按試劑盒說明進行。4）各組大鼠腦組織TLR4、NF-κB p65蛋白表達檢測。取30 mg大鼠腦組織剪碎，加入適量含磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，置于冰上研磨，4℃低溫冷凍離心機10 000 r/min離心5 min，取上層清液為蛋白提取液，用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。調整各樣本為統一濃度，金屬浴使蛋白變性。配備SDS-PAGE凝膠電泳，恒流轉膜1.5 h，用5%脫脂奶粉封閉，于室溫搖床封閉1.5 h，分別加入一抗（兔抗TLR4抗體1∶300；兔抗NF-κB p65抗體1∶2 000），4 ℃過夜孵育，洗膜后加入二抗（山羊抗兔IgG HRP，1∶10000），室溫搖床孵育70 min，洗膜后加入超敏ECL發光液顯色，于凝膠圖像成像分析系統曝光5～30 s，Image J軟件計算條帶灰度值。

1.7 統計學處理 應用SPSS20.0統計軟件。數據符合正態分布，以（±s）表示，符合方差齊性，兩組對比采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠神經行為學評分比較 見表1。模型組及中藥組大鼠表現不同程度的神經功能缺失癥狀，如左側偏癱，行走時左側轉圈，運動減少，左前爪不能完全伸展等。對各組大鼠進行Garcia評分，與假手術組相比，模型組大鼠Garcia評分顯著降低（P＜0.01），與模型組相比，中藥組大鼠Garcia評分升高（P＜0.05）。

表1 各組大鼠神經行為學評分比較（分，±s）

表1 各組大鼠神經行為學評分比較（分，±s）

注：與假手術組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組別假手術組模型組中藥組n 14 12 13 Garcia評分17.31±0.23 6.28±2.49**8.53±1.72△

2.2 各組大鼠缺血半暗帶組織形態學變化 見圖1。假手術組大鼠神經元胞體及軸突排列整齊，細胞結構完整，細胞核清晰可見；模型組大鼠神經細胞可見壞死，細胞排列混亂，神經元結構不完整；中藥組大鼠與模型組大鼠相比神經元凋亡情況顯著改善。

圖1 各組大鼠腦組織病理觀察（HE染色，400倍）

2.3 各組大鼠腦梗死面積比較 見表2，圖2。通過Image Pro Plus軟件分析各個層面白色梗死區域的所占面積，取平均值代表大鼠梗死面積百分比。與模型組相比，中藥組大鼠腦組織梗死面積顯著降低（P＜0.05）。

表2 各組大鼠大腦梗死面積比較（%，±s）

表2 各組大鼠大腦梗死面積比較（%，±s）

組別假手術組模型組中藥組n 3 3 3腦梗死面積0 46.79±17.46 27.53±11.32△

圖2 大鼠腦組織梗死情況（TTC染色）

2.4 各組大鼠腦組織炎癥因子水平比較 見表3。與假手術組相比，模型組大鼠促炎性細胞因子IL-1β、TNF-α水平顯著增高（P＜0.01），抑炎型細胞因子IL-4、IL-10水平降低（P＜0.01）；與模型組相比，中藥組促炎性細胞因子IL-1β、TNF-α水平顯著降低（P＜0.01），抑炎型細胞因子IL-4、IL-10水平顯著增加（P＜0.05或P＜0.01）。

表3 各組大鼠腦組織炎癥因子水平比較（pg/mL，±s）

表3 各組大鼠腦組織炎癥因子水平比較（pg/mL，±s）

組別假手術組模型組中藥組n 8 6 7 IL-1β 16.03±2.28 39.46±5.25**27.13±4.51△△TNF-α 37.24±0.28 59.11±1.45**53.40 ±0.75△△IL-4 28.21±9.83 14.00±7.66**19.50±7.81△IL-10 12.93±3.02 7.99±2.45**11.75±2.39△△

2.5 各組大鼠腦組織TLR4、NF-κB p65蛋白表達水平比較 見表4，圖3。與假手術組相比，模型組大鼠TLR4、NF-κB p65表達均顯著上調（P＜0.01）；與模型組相比，中藥組大鼠TLR4表達下調（P＜0.05），NF-κB p65蛋白表達顯著下調（P＜0.01）。

表4 各組腦組織TLR4、NF-κB p65水平比較（±s）

表4 各組腦組織TLR4、NF-κB p65水平比較（±s）

組別假手術組模型組中藥組n 8 6 7 TLR4蛋白0.21±0.03 0.62±0.09**0.31±0.05△NF-κB p65蛋白0.12±0.09 0.53±0.11**0.27±0.08△△

圖3 各組大鼠TLR4、NF-κB p65蛋白表達條帶

3 討論

炎癥是腦IR/R的主要損傷機制之一［4］。在靜息狀態下，存在于細胞質內并處于失活狀態，當腦缺血組織突然恢復血供后，細胞產生大量氧自由基，誘導TLR4激活［9］，通過信號級聯擴大效應激活 NF-κB，NF-κB被激活后從細胞質轉移到細胞核內（尤其是p65亞單位），與相應的炎癥相關基因結合，啟動炎性細胞因子轉錄，誘發炎癥。此外，活化的NF-κB還可激活小膠質細胞，同時調控其激活狀態［10-11］。

小膠質細胞是中樞最主要的炎癥細胞，在腦缺血后第一個做出反應［12］。小膠質細胞的活化存在于缺血性腦中風的各個階段［13］，通過釋放細胞因子、趨化因子等持續影響神經功能［14-15］。研究發現，活化的小膠質細胞可以表現出損傷和保護兩種截然相反的生理活性，這主要取決于小膠質細胞活化后的狀態［16-17］。M1型小膠質細胞為促炎型小膠質細胞，主要產生促炎性細胞因子，如TNF-α、IL-1β、干擾素-γ（IFN-γ）、IL-6、IL-12、IL-23、誘導型一氧化氮合酶（iNOS）和蛋白水解酶（MMP9、MMP3）等，加劇組織炎性損傷［18］。M2型小膠質細胞為修復型小膠質細胞，產生促血管生成和促炎性作用的IL-4、IL-10、IL-13、轉化生長因子-β（TGF-β），以及生長因子如VEGF、BDNF、血小板衍生生長因子（PDGF）等，可以減輕組織炎癥，促進損傷修復［19］。NF-κB對小膠質細胞的激活主要是使小膠質細胞由靜息態轉化為M1型，還可以促進小膠質細胞由M2型轉化為M1型，增加IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-8等促炎癥因子釋放，引起組織廣泛而又持續的炎性損傷［20］。

實驗研究證實，抑制TLR4/NF-κB信號通路，可以減輕腦組織炎性損傷，預防腦IR/R［21-22］。綜上所述，抑制TLR4/NF-κB信號通路，促進小膠質細胞M1/M2轉化，可以減少促炎性細胞因子水平，增加抑炎性細胞因子水平，恢復腦組織免疫穩態，可減少腦組織IR/R損傷。在本研究中發現，三七總皂苷可顯著縮小MCAO模型大鼠腦梗死面積，改善大鼠神經元損傷，改善大鼠神經功能缺損癥狀，這與既往的研究結果相同，再次印證了三七總皂苷對腦IR/R的保護作用。其機制可能與下調大鼠TLR4/NF-κB炎性信號通路，促進小膠質細胞由M2型向M1型轉化，進而減少M1型小膠質細胞IL-1β、TNF-α表達，增加M2型小膠質細胞IL-4、IL-10表達，減輕組織炎性損傷相關。