扶正祛邪復方對人白血病細胞HL-60的增殖及凋亡的影響*

張曉丹 周永明 嚴靜賢 祝海霞

［1.河南中醫藥大學第二臨床醫學院，河南 鄭州 450002；2.上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院，上海 200437；3.上海市崇明區第三人民醫院，上海市崇明區岳陽醫院崇明分院，上海 202150；4.上海交通大學醫學院附屬同濟醫院寶山分院（大場醫院），上海 200043］

急性白血病是常見的造血系統惡性腫瘤，其特征就是骨髓或其他造血組織中白細胞及幼稚細胞的惡性增殖，浸潤全身組織及器官，臨床表現為貧血、感染、出血等癥狀。白血病的病情重、死亡率高、進展快等特點使其成為嚴重威脅人們健康的惡性腫瘤疾病。白血病的發生與白血病細胞的增殖與凋亡失衡相關。誘導白血病細胞凋亡是目前臨床常用化療藥物的主要機制，是鑒定藥物是否敏感、能否有效的一項指標。雖然目前的化療已經取得了顯著療效，但是仍不能根治，其毒副作用、復發率高等缺點，迫使我們尋求新的路徑。中醫藥治療急性白血病具有一定的特色優勢。扶正祛邪復方是本文通信作者周永明教授治療白血病的經驗方，在臨床使用中取得了一定的療效。本實驗用不同質量濃度的扶正祛邪復方對HL-60細胞進行干預，觀察HL-60細胞的增殖及凋亡，為臨床療效提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞株 HL-60人原髓細胞白血病細胞（原粒細胞，懸浮生長），購自上海中科院細胞庫。

1.2 試劑與儀器 生物安全柜（Thermo，1386，USA）；細胞培養箱（Thermo，3111，USA）；倒置顯微鏡（Olympus，FSX100，Japan）；靜 音 混 合 器（Kylin-Bell，BS 223S，China）；電子分析天平（Sartorius，BT 25S，Germany）；超低溫冰箱（Thermo，PRIMO，USA）；紫外分光光度計（Thermo，1658001，USA）；流式細胞儀（Beckman Coulter，Cytomicsfc500，USA）；多功能酶標儀（BIOTEK，IX 51，USA）；恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司）；臺式離心機（Thermo，ND2000，USA）；微量移液器（北京大龍公司，China）；Cell Counting Kit-8細胞增殖-毒性檢測試劑盒（Rainbio，R3000-4，China）；雙抗（MIULTICELL，450-201-EL，USA）；胎牛血清（FBS）（Hyclone，SH30084.03，USA）；細胞周期試劑盒（BD，51-66211E，USA）；Annexin V/FITC細胞凋亡檢測試劑盒（BD，556547，USA）；RPMI-1640培養基（Hyclone，SH30809.01，USA）；PBS 緩沖液（Hyclone，SH30022.01B，USA）；0.2 μm除菌濾網（Rephile，RJP3222SH）；流式管（FALCON，21115036，USA）。

1.3 扶正祛邪復方培養液的制備與分組 扶正祛邪中藥復方采用天江顆粒，方藥為太子參、炒白術、生地黃、制半夏、牡丹皮、炒黃柏、白花蛇舌草、半枝蓮、木饅頭、炒枳殼、炙甘草等。將中藥復方溶于RPMI-1640培養液中，配成100 mg/mL的復方中藥培養液。將裝有中藥藥液的玻璃杯置于水浴鍋中，加熱至100℃，并用玻璃棒勻速攪拌，充分混勻所有顆粒。用0.22 μm無菌濾器過濾至15mL離心管中，封口膜封口，當作母液，4℃保存。實驗時用RPMI-1640完全培養液稀釋成不同質量濃度的扶正祛邪復方培養液，將pH值調整為7。對照組為正常RPMI-1640完全培養液；實驗組質量濃度依次為20、15、10、5、1 mg/mL的中藥復方培養液。

1.4 細胞培養 細胞換液遵循懸浮細胞換液的技術，完全遵守無菌操作，每2～3天換液1次，每次添加約5 mL的完全培養基。完全培養液由10%胎牛血清、1%雙抗、RPMI-1640培養基組成，調節細胞濃度為1×105/mL，置于5% CO2的細胞培養箱中進行傳代培養，取對數期細胞進行實驗。

1.5 臺盼藍拒染實驗 取對數生長期HL-60細胞，調整細胞濃度為1×105/mL，接種于96孔培養板中，一共6組，每組設3個復孔，共接種3板。每孔加細胞懸液100 μL，培養箱中繼續培養2～4 h，待細胞狀態穩定后，對照組加入培養基10 μL，各實驗組每孔加入不同質量濃度的扶正祛邪復方中藥液，分別培養24、48、72 h后，在相應時間點取出一板。用EP管收集各個孔中的細胞，室溫下1 000 r/min，離心5 min，棄上清，加入0.3 mL不含血清的培養基，吹打混勻后加入0.4%的臺盼藍溶液0.3 mL，輕輕混勻。2～3 min后，吸取10 μL細胞懸液，從細胞計數板邊緣滴入。死細胞被染成明顯的藍色，而活細胞拒染呈無色透明狀。在低倍顯微鏡下計數活細胞的數量，并記錄。另取EP管中剩余細胞，分裝在96孔板中，在倒置顯微鏡中觀察細胞形態。

1.6 CCK-8法檢測HL-60細胞的抑制 細胞培養與藥物干預步驟同前一實驗，在3個時間點分別取出培養板，每孔加入CCK-8試劑10 μL，振蕩后放入培養箱中繼續培養2～4 h。將96孔板放入酶標儀中，以空白組孔調零，在波長450 nm處測定各孔吸光度值，并計算抑制率。

1.7 流式細胞術檢測HL-60細胞周期、凋亡率 選取活力旺盛、呈現對數生長期的HL-60細胞，用含10%小牛血清的RPMI-1640培養基制成以2×106/mL濃度的單細胞懸液，以每孔1 mL接種于無菌6孔板，各空白組加入完全培養液，實驗組每孔分別加入不同質量濃度的扶正祛邪復方中藥液10 μL。在37℃、5% CO2及95%飽和濕度下，培養48 h后，離心，收集細胞，進行細胞周期檢測（按照試劑盒說明操作）。將收集的細胞用預冷PBS洗滌2次，1 000 r/min離心后棄上清，重懸細胞，倒置顯微鏡下進行細胞計數，調整各組細胞數為1.0×106/mL。取不同質量濃度扶正祛邪中藥液處理后的細胞樣本，使細胞數達到2×105～1×106個，1 000 r/min離心5 min，棄上清，收集個細胞，離心棄上清。用PBS洗滌1次，離心棄上清。加入1 mL DNA染色液和10 μL滲透液，渦旋振蕩5～10 s混勻。室溫避光孵育30 min。選擇最低上樣速度，在流式細胞儀上進行檢測細胞周期；細胞凋亡實驗細胞培養與中藥干預同前，收集細胞后首先按照凋亡試劑盒中的說明，進行儀器的參數調節，然后進行樣品的檢測。收集1×106個細胞，用預冷PBS離心洗滌2次，棄上清，稀釋工作液，用1×Binding Buffer重懸細胞，每管加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI。輕柔渦旋混勻后，室溫避光孵育5 min。加入500 μL Apoptosis Po在流式細胞儀上，用空白管調節FSC、SSC和熒光通道的電壓，并在此電壓條件下，用單染管調節熒光通道的補償，然后樣品管進行實驗。

1.8 統計學處理 應用SPSS23.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差異性時用LSD法，涉及24、48、72 h增殖抑制率比較采用two-ways ANOVA。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 臺盼藍拒染實驗觀察各組白血病細胞形態 見圖1。本實驗對臺盼藍染色后的細胞形態進行不同組別之間的比較，觀察扶正祛邪復方中藥對白血病細胞形態的影響。如圖1可見空白組白血病細胞懸浮生長，密度適中，細胞膜完整，細胞質均勻透亮，細胞核清晰，細胞未被染色為藍色，為透亮；而各實驗組的細胞隨藥物質量濃度的增加，細胞密度逐漸下降，折光性減低，胞體逐漸變小，可見不同數量的被臺盼藍染為藍色的死細胞。隨著中藥質量濃度的增加，被臺盼藍染色的細胞增多，說明中藥干預后的白血病細胞有凋亡現象，并隨著藥物質量濃度的增加，細胞凋亡數目增加。

圖1 臺盼藍染色后各組細胞形態

2.2 臺盼藍染色細胞計數法檢測各組HL-60細胞抑制率 見表1。用細胞抑制率公式計算細胞生長抑制率，并以細胞生長抑制率對藥物質量濃度繪制生長曲線。細胞抑制率＝［1-（實驗組活細胞數/對照組活細胞數）］×100%。以上實驗重復3次，取平均值。數據以重復測量方差分析，結果顯示：group與time的交互作用有統計學意義。時間因素方差分析的F值為29.69，P1＜0.05；分組因素方差分析的F值為28.65，P2＜0.01，說明時間層面，同一質量濃度下隨著時間的延長扶正祛邪復方對HL-60細胞的抑制作用越強。同一時間點，不同質量濃度組之間隨質量濃度的增加，對白血病細胞的抑制率越高。

表1 臺盼藍染色細胞計數法檢測各組HL-60細胞抑制率（%，±s）

表1 臺盼藍染色細胞計數法檢測各組HL-60細胞抑制率（%，±s）

與空白組比較，*P＜0.05；同一時間點，與前一質量濃度組比較，△P＜0.05；與本組前一時間點相比較，▲P＜0.05。下同

組別空白組中藥1 mg/mL組中藥5 mg/mL組中藥10 mg/mL組中藥15 mg/mL組中藥20 mg/mL組24 h 0.00±0.00 7.98±4.27*17.10±4.41△*19.07±8.46△*25.80±11.27△*30.57±5.70△*48 h 0.00±0.00 12.08±5.51*▲21.91±5.75△*▲27.85±8.16△*▲31.74±10.87△*▲35.97±7.57△*▲72 h 0.00±0.00 12.19±5.40*▲22.52±6.34△*▲28.22±4.13△*▲37.63±4.14△*▲42.41±2.37△*▲

2.3 CCK-8法檢測各組HL-60細胞的抑制 見表2。測定各孔吸光度值，并計算抑制率，結果以重復測量方差分析，時間因素方差分析的F值為118.9，P1＜0.01；分組因素方差分析的F值為365.4，P2＜0.01，說明時間層面，同一質量濃度下，隨著時間的延長扶正祛邪復方對HL-60細胞的抑制率越高；同一時間點，各不同質量濃度組之間隨扶正祛邪復方質量濃度的增加，對白血病細胞HL-60的抑制率越高，說明扶正祛邪復方對HL-60細胞活性具有抑制作用，且呈一定的質量濃度與時間的依賴性。

表2 CCK-8法檢測各組HL-60細胞的抑制率（%，±s）

表2 CCK-8法檢測各組HL-60細胞的抑制率（%，±s）

組別空白組中藥1 mg/mL組中藥5 mg/mL組中藥10 mg/mL組中藥15 mg/mL組中藥20 mg/mL組24 h 0.00±0.00 4.30±1.90*10.41±2.61△*13.24±0.89△*15.80±1.99△*25.7±1.82△*48 h 0.00±0.00 8.46±0.87*▲16.45±2.13△*▲24.29±2.56△*▲29.97±3.80△*▲36.94±0.72△*▲72 h 0.00±0.00 11.49±1.43*▲18.62±1.73△*▲28.34±2.08△*▲35.60±3.13△*▲42.56±2.33△*▲

2.4 流式細胞術檢測各組HL-60細胞周期和凋亡見表3，圖2。采用流式儀檢測扶正祛邪復方干預白血病HL-60細胞對細胞周期及凋亡的影響。經單因素方差分析，與空白組比較，復方中藥組可將HL-60白血病細胞周期阻滯于G1期，S期的細胞比例減少（P＜0.05），并且隨著質量濃度的增高，對白血病細胞周期的阻滯作用越強?？梢哉T導HL-60白血病細胞發生凋亡（P＜0.05），且隨著中藥質量濃度的增加，細胞凋亡率越高，具有一定的質量濃度依賴性。

圖2 各組HL-60細胞周期比較

表3 流式細胞術檢測各組HL-60細胞周期和凋亡（%，±s）

表3 流式細胞術檢測各組HL-60細胞周期和凋亡（%，±s）

與空白組比較，*P＜0.05；與中藥1 mg/mL組比較，△P＜0.05；與中藥5 mg/mL組比較，○P＜0.05；與中藥10 mg/mL組比較，▲P＜0.05；與中藥15 mg/mL組比較，◆P＜0.05

組 別G1期S期G2期 凋亡率空白組中藥1 mg/mL組中藥5 mg/mL組中藥10 mg/mL組中藥15 mg/mL組中藥20 mg/mL組39.51±2.53 42.17±2.89*47.02±1.48*△49.46±0.64*△○57.27±2.20*△○▲64.28±4.06*△○▲◆51.48±1.68 46.88±1.53*41.08±1.45*△35.02±2.34*△○28.63±4.79*△○▲23.99±3.54*△○▲◆9.02±1.53 10.96±4.36 11.91±1.73 15.52±1.98 14.10±2.99 11.73±1.37 7.04±5.34 10.38±2.76 14.31±1.60*△19.29±5.76*△○30.00±13.56*△○▲38.27±8.17*△○▲

3 討論

細胞的增殖和凋亡的動態平衡與腫瘤的發生發展密切相關，白血病的發病也是如此。細胞凋亡是腫瘤機制研究的常見方向與切入點。所謂細胞凋亡是指細胞程序性的死亡，也就是說細胞受到一定的基因調控，按照一定的程序進行自殺性的死亡［1］。細胞凋亡不是病理性細胞死亡，而是另一種生理過程。正常情況下，細胞凋亡使機體細胞數量保持一定的相對平衡，維持著人體穩態。細胞凋亡機制受到一定的抑制時，就會相對地導致細胞增殖的過度。在白血病的發病與進展中，白血病細胞的失控性增殖是造成病情迅速惡化與進展的主要原因，而化療藥物一般就是通過誘導凋亡來抑制白血病細胞的過度增殖。中藥干預HL-60細胞誘導其凋亡，主要與PI3K/Akt通路、Wnt/β-catenin通路、Fas/CD95通路、RaF/MEK/ERK通路、ERK/MAPK通路等細胞凋亡的信號轉導系統發揮作用［2-3］。其中PI3K/Akt通路、Wnt/β-catenin通路為目前在腫瘤中研究最為廣泛的信號通路，通過藥物手段或基因干擾抑制該兩條通路的活化均具有較好的抗腫瘤效果［4-5］。這些通路通常與Caspase激活（包括Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9活性變化）、BAX蛋白表達、BCL-2蛋白表達、Cyt-C蛋白表達、c-myc蛋白、DR5的表達［6-8］等相關。通過對文獻的閱讀發現，大部分中藥都是多靶點地誘導細胞凋亡，通過對不同蛋白、基因的表達來調控信號通路誘導細胞凋亡。

細胞周期是一個細胞從一次分裂完成開始到下次細胞分裂結束所經歷的過程。細胞分裂過程異?？赡軐е履[瘤的發生，細胞的快速生長和分裂是所有腫瘤細胞的共同特征。而細胞周期蛋白是細胞周期調控因子中最重要的蛋白之一，這些周期調控蛋白包括CDC2、CDC7、CDC23、MCAK、mki67a和拓撲異構酶Ⅱ等［9］。這些不僅是正常細胞功能所需的，而且是癌細胞增殖過程中的重要參與者，其異常表達可能引發腫瘤。在白血病中，miR-375-HOXB3-CDCA3/DNMT3B調節通路在疾病進展中起重要作用，在該通路中調低HOXB3表達可降低CDCA3表達，從而抑制白血病細胞增殖［10］。

扶正祛邪方是以扶正、祛邪并舉的驗方，祛邪不忘扶正，正安則可達邪。全方諸藥配伍，清補兼施，益氣養陰、清解邪毒。大量臨床應用中，本方能改善患者的生存質量，抑制患者化療期間的嘔吐、骨髓抑制等毒副作用，具有增效減毒之功效。本方中的單味中藥都具有一定的抗腫瘤作用。其中有研究表明［11］白術內酯能抑制白血病細胞HL-60的增殖活性，抑制小鼠白血病模型中白血病細胞P-388的活力，說明白術內酯具有一定的抗腫瘤作用。何立麗等［12］發現半夏可以調節抑癌基因表達、降低細胞毒性、阻斷細胞增殖信號、抑制腫瘤細胞侵襲、化療增敏、調節細胞周期、逆誘導腫瘤細胞凋亡等作用。Yin等［13］通過流式細胞分析法發現丹皮酚100、200 mg/L組細胞凋亡率顯著升高，且促凋亡蛋白的水平顯著增高。有研究者通過對乳腺癌紫杉醇多藥耐藥細胞株（MCF-7/PTX）的研究發現，丹皮酚可以誘導乳腺癌多重耐藥細胞株的凋亡［14-15］。扶正祛邪復方具有一定的抗腫瘤的藥理學依據。

基于白血病細胞的增殖與凋亡的平衡，我們進行了上述實驗，結果顯示扶正祛邪復方對細胞活性有著明顯的抑制作用。為進一步探討本方抑制白血病細胞的存活能力是否與誘導細胞凋亡和阻滯細胞周期有關，本研究使用流式細胞儀檢測了不同質量濃度中藥干預后的白血病細胞的凋亡變化和周期變化。結果顯示扶正祛邪復方干預白血病細胞，對細胞活性有明顯的抑制作用，存在細胞凋亡，而隨著中藥質量濃度的增加，凋亡的細胞數目逐漸增多，早期凋亡與晚期凋亡的細胞都有表現。這說明扶正祛邪復方能誘導白血病細胞的凋亡，且呈劑量依賴性。通過PI單染流式細胞術檢測白血病細胞周期的變化，結果顯示不同質量濃度的扶正祛邪復方處理白血病細胞后，均可以使細胞周期阻滯在G1期，S期的細胞比例相對減少，且隨著扶正祛邪復方質量濃度的增加，阻滯在G1期的白血病細胞數目也逐漸增加，相對的S期的白血病細胞數目也逐漸減少。由此得出本扶正祛邪復方能抑制人白血病細胞HL-60的增殖，其作用機制可能與影響細胞周期及誘導細胞凋亡相關。