海水環境下砂漿表面生物被膜特性及其對砂漿性能影響

榮 輝, 瞿 威, 馬國偉, 王海良, 張津瑞

(1.天津城建大學 材料科學與工程學院, 天津 300384; 2.天津城建大學 天津市建筑綠色功能材料重點實驗室, 天津 300384; 3.河北工業大學 土木與交通工程學院, 天津 300401; 4.天津城建大學 土木工程學院, 天津 300384; 5.天津大學 水利工程仿真與安全國家重點實驗室, 天津 300072)

在污水和廢水處理系統中,微生物會對混凝土造成腐蝕,使混凝土耐久性逐漸退化,這不僅會導致每年數十億美元的經濟損失,而且會影響系統的整體使用安全,因此微生物對混凝土的腐蝕研究迫在眉睫[1-2].微生物的細胞黏附、生長狀況和生物被膜的形成等特性可能是微生物對混凝土造成腐蝕的關鍵因素[3-4].

污水、淡水、海洋、石油等環境介質中,微生物首先在物理、化學、生物共同作用影響下,通過范德華力、疏水力以及靜電作用使其附著在砂漿表面.接著,附著在砂漿表面的微生物通過分泌胞外聚合物(EPS)形成生物被膜[5-7],進而對砂漿性能造成影響.生物被膜的成長和群落組成會受到溫度、pH值、光照、水動力、養分和有機質等環境因素的制約,因此有學者對不同環境因素下砂漿表面形成的生物被膜中微生物群落和分布特征進行了研究,結果發現生物被膜的附著會影響介質的傳輸,進而對混凝土性能造成影響[8-12].

目前生物被膜對砂漿性能的研究主要集中在污水環境,而海水環境中砂漿表面的生物被膜對砂漿的性能影響規律是什么？生物被膜在砂漿表面到底起腐蝕作用還是保護作用？想要了解海水環境中砂漿表面形成的生物被膜對砂漿性能的影響,則需首先探明海水環境中砂漿表面形成的生物被膜基本特性,然后再研究砂漿表面形成的生物被膜對砂漿性能的影響.研究表明,海洋中存在著大量的硫氧化細菌[13-14].因此,本文擬通過配置含有硫氧化細菌的人工海水進行研究,試驗首先通過研究海水環境中砂漿表面生物被膜的官能團、成分構成、厚度演變和生物被膜形貌等,闡明海水環境下砂漿表面形成的生物被膜基本特性,然后通過分析不同齡期砂漿的表觀形貌和抗壓強度,同時結合X射線衍射(XRD)和熱重分析(TG-DTG)研究試樣的水化產物,進而研究確定海水環境下砂漿表面生物被膜對砂漿性能的影響.

1 試驗

1.1 試驗材料

水泥采用P·O 42.5普通硅酸鹽水泥,購自順鑫水泥有限公司;砂采用天然河砂,細度模數為2.8;減水劑采用萘系高效減水劑,減水率(質量分數)為25%.

微生物采用硫氧化細菌,按2%(體積分數)接種到人工海水培養基中,每12d更換1次人工海水培養基.人工海水培養基成分見表1.

表1 人工海水培養基成分

1.2 試驗方案

砂漿設計強度為M50,配合比m(水)∶m(水泥)∶m(砂子)∶m(外加劑)=0.33∶1.00∶1.50∶0.01.試樣尺寸為40mm×40mm×160mm,標準養護28d后進行試驗.本試驗設置試驗組(SB)和對照組(DB),其中試驗組為滅菌后的人工海水培養基+硫氧化細菌+試樣,對照組為滅菌后的人工海水培養基+試樣,每組試樣均半浸在培養基中,如圖1(a) 所示.為方便后期觀察,將試樣氣液交界面處(生物被膜附著部位)標記為A區域,圖1(b)為附著生物被膜的試樣在海水中浸泡時所處狀態示意圖.齡期分別設置為7、15、30、45、60、75、90、120d.

圖1 試驗裝置Fig.1 Experimental apparatus

1.3 試驗方法

1.3.1生物被膜成分驗證

采用Bruker生產的Tensor27型傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR)對砂漿表面形成的生物被膜官能團進行分析.為進一步驗證生物被膜成分,在齡期30d時,分別在4只試管內將生物被膜提取液進行梯度稀釋,使其體積分數依次為20%(1#)、40%(2#)、60%(3#)、80%(4#),然后分別采用苯酚-硫酸法、考馬斯亮藍法和結晶紫染色法對生物被膜的成分作進一步驗證.

1.3.2生物被膜厚度演變與形貌

將經過體積分數0.1%結晶紫染色過的生物被膜烘干,采用VHX-600E型超景深顯微鏡沿著生物被膜平行測量,每1.6cm為1個步長,取平均數作為該齡期的生物被膜厚度.另外,分別取試驗組和對照組A區域的一部分試樣固定在體積分數為2.5%的戊二醛溶液中,在4℃冷藏室放置2h后,用0.2mol/L 的磷酸緩沖液漂洗3次,最后用體積分數為50%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液進行梯度脫水,每次15min.脫水后放入30℃烘箱干燥,將烘干的試樣取出,在樣品臺上噴金鍍膜,采用JSM-7800F型場發射掃描電子顯微鏡(SEM)和能譜儀(EDS)分析生物被膜形貌和元素組成.

1.3.3砂漿宏觀形貌與性能

使用普通攝像機記錄砂漿表面形貌在不同齡期的變化,同時按照GB/T 17671—1999《水泥膠砂強度檢驗方法(ISO法)》進行抗壓強度試驗,并計算浸泡后試樣的抗壓強度增長率R：

R=(f2-f1)/f1×100%

(1)

式中：f1為試樣在齡期7d時的抗壓強度,MPa;f2為試樣分別在齡期15、30、45、60、75、90、120d時對應的抗壓強度,MPa.

1.3.4微觀分析

將每組試樣A區域(見圖1(b))使用去離子水和無水乙醇沖洗3遍,盡可能將表面雜質清除干凈.試樣在50℃ 烘箱中干燥12h后,使用研缽研磨成粉末,至全部通過10μm方孔篩,繼續放入50℃烘箱中干燥6h.采用RD/MAX-Ultima Ⅳ型X射線衍射儀分析物相組成,掃描步長為0.02°,掃描速度為8(°)/min,掃描范圍為10°～60°.采用Q600型同步熱分析儀分析砂漿礦化產物的含量,由室內溫度25℃開始加熱,直至升溫到800℃,測試時采用N2保護氣氛,升溫速率為20℃/min.

2 結果與討論

2.1 生物被膜官能團與成分構成

2.1.1生物被膜官能團

齡期到達30d時,試驗組試樣在氣液交界面處附著的黃色黏稠物質大量增多,如圖2所示.取黃色物質進行FTIR測試,結果見圖3.

圖2 砂漿表面黃色黏稠物質Fig.2 Yellow viscous substance on mortar surface

圖3 黃色黏稠物質的FTIR圖譜Fig.3 FTIR spectrum of yellow viscous substance

2.1.2生物被膜成分構成

多糖和蛋白質的存在可以有效證明砂漿表面形成的黃色黏稠物質為生物被膜[4],這是因為多糖和蛋白質是胞外聚合物EPS的主要成分,兩者含量一般占EPS總量的75%～80%.30d時生物被膜成分驗證結果見圖4.

圖4 30d時生物被膜成分驗證結果Fig.4 Biofilm composition validation results(30d)

由圖4(a)可以看出,1#試管內顏色相對較淡,隨著后續試管中提取液的體積分數不斷增大,試管內提取液的反應顏色依次加深.這是因為苯酚與多糖脫水后的糠醛衍生物會形成有色絡合物,可將溶液變為橙黃色[15],此現象證明黃色黏稠物質中含有多糖.由圖4(b)可以看出,1#試管內藍色程度還不是很明顯,隨著后續試管中提取液體積分數不斷增大,試管內提取液的反應顏色也依次加深.這是因為考馬斯亮藍染料與蛋白質中的堿性氨基酸和芳香族氨基酸的殘基通過疏水力相結合,會將溶液變為藍色[16],此現象再次證明了黃色黏稠物質中含有蛋白質.

圖4(c)是結晶紫染色生物被膜的照片.由圖4(c) 可以看到,結晶紫染色后的試驗組A區域顯藍色,而對照組相同位置處并沒有發生顯色反應,仍呈黑色.這是因為活細胞可以攝入溶解后的結晶紫,從而使細胞中的DNA、蛋白質和脂肪著色.這也證明了砂漿表面形成的黃色黏稠物質是生物被膜,而對照組表面此時還沒有形成一定規模的生物被膜.

結合圖3、4,可以證明30d時海水環境下硫氧化細菌在砂漿表面形成的這種黃色黏稠物質是生物被膜,該生物被膜由多糖、蛋白質和微生物構成.

2.2 生物被膜厚度演變及形貌

2.2.1生物被膜厚度演變

由于試驗組在15d時開始附著少量的生物被膜,故從15d開始采用超景深顯微鏡測量各齡期生物被膜厚度,結果見圖5.

圖5 各齡期生物被膜厚度Fig.5 Biofilm thickness at different ages

由圖5可見：試驗組的生物被膜在15d時厚度為0.16mm,15～30d增長速度最快,期間增加0.63mm,這是因為,附著的硫氧化細菌開始分泌大量EPS,生物被膜在砂漿表面快速繁殖,不斷疊加生長,使得生物被膜厚度快速增加;在75d時,生物被膜厚度達到了最高值1.70mm,此時生物被膜已經趨于成熟;75～90d內,生物被膜厚度開始下降;90d 后其厚度緩慢增加,120d時其厚度增至1.59mm.這是因為,海水環境中的營養物質難以維持更多生物被膜的繁殖,部分營養物質難以到達生物被膜深處,致使生物被膜增長速度逐漸減緩,表面黏附力逐漸減弱,部分生物被膜開始脫落.90d之后海水中的營養物質和氧氣再次滿足大部分硫氧化細菌的繁殖需求,新的生物被膜重新開始繁殖并附著,從而使生物被膜厚度呈現出先下降后緩慢增加的現象.

另外,通過對比可發現,對照組生物被膜厚度遠小于試驗組,在120d時,對照組生物被膜厚度僅為0.45mm,原因是對照組在后期會形成雜菌[17],從而導致對照組中也形成了微量的生物被膜.

2.2.2生物被膜形貌

圖6為30d時海水環境下砂漿表面生物被膜微觀形貌.由圖6可見,生物被膜是具有三維立體結構的細菌群落,內部結構錯綜復雜,細菌固著在胞外聚合物內,細菌多呈卵狀和氣泡狀,胞外聚合物作為基質彼此相互黏附.

圖6 30d時海水環境下砂漿表面生物被膜微觀形貌Fig.6 Micromorphology of biofilm on mortar surface in seawater environment(30d)

圖7是2組試樣A區域的EDS分析.由圖7(a)可以看出：試驗組表面的主要元素為O、C、Na、P；O元素含量最高,為68.92%,其次是C元素,含量為22.31%,這是因為試驗組表面附著生物被膜,而生物被膜中多糖和蛋白質的主要元素均為C、O;另外,出現了含量為5.93%的P元素,而P為脂類特有的元素[18].圖7(b)顯示對照組表面主要元素依次為O、Si、Ca.結合圖2、6可知,30d時試驗組表面已經出現大量生物被膜,厚度為0.79mm,而30d時對照組的生物被膜厚度僅為0.24mm,表明對照組表面的生物被膜附著范圍非常有限,且附著的量也極少,因此30d時很難在對照組表面精準測出生物被膜內的C、P元素含量.

圖7 2組試樣A區域的EDS分析Fig.7 EDS analysis of A region of two groups of samples

2.3 砂漿宏觀形貌與性能

2.3.1砂漿宏觀形貌

為了比較有無生物被膜對試樣表面形貌的影響,選取7、15、120d齡期時試樣的宏觀形貌進行對比,如表2所示.由表2可見：試驗組在7d時氣液交界面下方初步變黑,15d時顏色進一步加深,原因是15d時初步形成了生物被膜附著的條件,隨后微生物加速繁殖,加快了對氧氣的消耗,導致試驗組浸泡部位的微量元素出現了更嚴重的顯色反應,且隨齡期增長而加深,在120d時試驗組海水浸泡部位已經徹底顯深黑色;對照組氣液交界面下方在15d時才開始變黑,并且后期同樣發生了嚴重的顯色反應,在120d時完全變黑,但是程度略輕于試驗組.對照組海水浸泡部位發生顯色反應的原因為：15d之后開始有雜菌的引入[17],并且后期逐漸增多,導致對照組也同樣會因缺氧而顯色.

表2 7、15、120d齡期時試樣的宏觀形貌

2.3.2砂漿抗壓強度

圖8給出了各試樣的抗壓強度.由圖8可見：7d 時2組試樣抗壓強度相差不大.為進一步體現海水環境下砂漿表面生物被膜對試樣抗壓強度的影響規律,對7d后各齡期試樣的抗壓強度增長率R進行了計算,結果如圖9所示.

圖8 各試樣的抗壓強度Fig.8 Compressive strength of samples

圖9 7d后各齡期試樣的抗壓強度增長率Fig.9 Compressive strength growth rate of samples after 7d

由圖8、9可見,試驗組的抗壓強度總體趨勢是增大的,從7d時的51.7MPa增至120d時的68.1MPa,增長了31.72%.推測齡期內可能有少量的硫酸根離子通過生物被膜進入了試樣內部,并生成了填充物,使得砂漿內部孔隙更加密實,從而提高了砂漿的抗壓強度.而對照組的抗壓強度是先增大后降低的,從7d時的52.3MPa增至45d時的60.1MPa,增長了14.91%,期間對照組與試驗組的抗壓強度相差不大,這是由于期間海水內的硫酸根離子同樣進入了對照組試樣內部并生成了少量的填充物,從而使得砂漿抗壓強度增大.但45d之后對照組的抗壓強度開始下降,在120d時其抗壓強度僅為52.5MPa,與7d抗壓強度相比只增長了0.38%.這可能是由于對照組試樣內部填充物在45d 后生成量逐漸增多,使得生成物在填充孔隙的同時,也使孔隙開始產生膨脹傾向,從而使后期抗壓強度下降.

2.4 微觀分析

2.4.1礦化產物組成

圖10是海水環境下砂漿的礦化產物XRD圖譜.由圖10可見,120d時2組試樣在A區域的主要水化產物均為二氧化硅、碳酸鈣、石膏和阿利特.二氧化硅大規模的出現是由于試樣中使用了河砂,阿利特則是硅酸鹽水泥中獲得早期強度的主要礦物,石膏是礦化產物中主要的腐蝕產物.由圖10還可見,試驗組的碳酸鈣衍射峰高于對照組,這是由于硫氧化細菌為好氧菌,在附著代謝過程中會消耗氧氣并產生大量的二氧化碳,從而使試驗組砂漿表面碳化.試驗組和對照組試樣均沒有出現氫氧化鈣衍射峰,由此推斷出2組試樣中均有腐蝕介質進入水泥內部,并與氫氧化鈣發生了化學反應,生成了具有膨脹性的石膏.

圖10 海水環境下砂漿的礦化產物XRD圖譜Fig.10 XRD spectrum of mineralized products of mortar in seawater environment

由圖10還可以看出,對照組試樣的石膏衍射峰明顯高于試驗組,這表明進入對照組試樣內部的腐蝕性介質更多,因此試樣內部生成了更多的石膏,而石膏自身的膨脹性可使砂漿體積增大2.2倍[19].由此可以推測,對照組試樣抗壓強度降低的原因可能是：砂漿內部形成了更多的石膏,使得內部出現膨脹傾向,而試驗組內部生成的石膏量較少,沒有出現膨脹傾向.

2.4.2熱重分析

圖11為120d時海水環境下砂漿試樣的TG-DTG曲線.由圖11可見：試驗組和對照組在180℃附近均出現了石膏的失重峰,并且對照組的失重速率快于試驗組：180～200℃范圍內試驗組和對照組試樣中石膏脫水質量損失分別為0.8%、1.7%;610℃附近出現了碳酸鈣的失重峰,對照組的失重速率慢于試驗組;610～650℃范圍內試驗組和對照組試樣中碳酸鈣質量損失分別為1.6%、0.8%.綜上,可以確定對照組內部生成的石膏含量多于試驗組,這與XRD分析結論一致.

圖11 120d時海水環境下砂漿試樣的TG-DTG曲線Fig.11 TG-DTG curves of mortar in seawater environment(120d)

綜上,海水環境下生物被膜在砂漿表面的附著會影響腐蝕介質的傳輸,使砂漿的腐蝕進程得以減緩.

3 結論

(1)試驗證明了海水環境下硫氧化細菌會在砂漿表面生成大量的生物被膜,主要成分是多糖、蛋白質和微生物.生物被膜中的微生物主要以群落的形式固著在胞外聚合物內,胞外聚合物作為基質彼此相互黏附.

(2)海水環境下砂漿表面的生物被膜在15d之后開始迅速繁殖,到75d時膜層趨于成熟,其厚度達到1.70mm,之后受到營養物質不足的影響,部分生物被膜開始脫落,90d后新的生物被膜重新附著,在120d時其厚度為1.59mm.

(3)120d時試驗組抗壓強度為68.1MPa,強度增長率為31.72%,石膏脫水質量損失為0.8%;而對照組抗壓強度為52.5MPa,強度增長率為0.38%,石膏脫水質量損失為1.7%.這表明生物被膜的存在會影響海水中腐蝕介質的傳輸,阻礙試樣周圍的腐蝕介質進入砂漿內部.在海洋實際工程中,生物被膜在構筑物表面附著120d以內時,可考慮保留,暫不對構筑物表面進行除污作業.