一株中華鱉源嗜水氣單胞菌的分離鑒定及毒力基因分析

薛明洋，周 勇，梁宏偉，李 翔，范玉頂，曾令兵，曲春娟，孟 彥

（1中國水產科學研究院長江水產研究所，武漢 430223；2安徽省喜佳農業技術有限公司，安徽蚌埠 233000；3安徽省蚌埠市水產技術推廣中心，安徽蚌埠 233000）

0 引言

中華鱉(Pelodiscus Sinensis)，俗稱甲魚，團魚等，隸屬于爬行綱(Reptilia)、龜鱉目(Testudinata)、鱉科(Tironychidae)、鱉屬(Pelodiscus)，是中國重要的水產經濟養殖品種，具有重要的營養、藥用和觀賞價值[1]。近年來，國內鱉養殖產量穩步增長，養殖區域主要集中在浙江、安徽、廣東、湖北、江蘇、江西等地，養殖呈現出工廠化、規模化和集約化的發展趨勢[2]。隨著養殖規模和養殖密度不斷提高，而且加之長期的人工控溫養殖，致使中華鱉自身免疫力、抗病力都有所下降，因而養殖過程中發病頻率和不同病原感染導致的疾病均有所增加，病害問題日益突出，因此應加強對中華鱉疾病的研究。

嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)于弧菌科、氣單胞菌屬，是一種廣泛分布于自然界中的革蘭氏陰性桿菌，通常被認為是條件致病菌，是多種水生動物的致病菌，為典型的“人-畜-魚”共患病病原[3-4]。嗜水氣單胞菌是中華鱉的主要致病菌，目前已從多種癥狀的病鱉中都分離出嗜水氣單胞菌，如紅脖子病、紅底板病、白底板病、腐皮病、疥瘡病、出血性腸炎等多種不同癥狀的疾病[5]。嗜水氣單胞菌還能引發多種并發癥，如“紅脖子、紅底板”并發癥，“腐皮、疥瘡”并發癥等[6]。所以在中華鱉養殖過程中疾病診斷、病原的確定尤為重要。目前抗生素是防治鱉嗜水氣單胞菌感染的主要藥物。研究表明，不同區域和來源的嗜水氣單胞菌對藥物的敏感性不同[7]。林峰[8]從中華鱉中分離出1 株嗜水氣單胞菌對慶大霉素、頭孢他啶、頭孢西丁、鏈霉素、呋喃妥因敏感。趙小平等[9]分離的嗜水氣單胞菌對恩諾沙星、氧氟沙星、丁胺卡那霉素高度敏感。此外，研究發現嗜水氣單胞菌的耐藥性呈現上升趨勢[10]。因此，要做好藥敏檢測，要有針對性用藥。

嗜水氣單胞菌的致病性與毒力因子密切相關，對于毒力因子的作用，一般認為都是多功能和多因子協同致病的結果[11]。嗜水氣單胞菌所分泌的氣溶素、溶血素、絲氨酸蛋白酶、彈性蛋白酶、金屬蛋白酶及細胞毒性腸毒素等是重要的毒力因子，與嗜水氣單胞菌有無毒力或者毒力強弱有很高的相關性[12]。

2019年，安徽某中華鱉養殖場中華鱉出現反應遲鈍、脖頸紅腫、伸縮困難、腹甲及四肢有紅色出血斑點（塊）為主要癥狀的傳染性疾病，主要感染對象為1 齡以上溫室養殖和室外池塘養殖的成鱉，發病周期持續2周，死亡率達30%，經濟損失嚴重。為了探究此次導致安徽省中華鱉養殖場發病的致病原，本研究無菌條件下從患病中華鱉體內分離病原，通過形態學、生理生化特征和16S rDNA 序列分析對病原菌進行鑒定；利用回歸感染試驗對病原菌致病性進行確定，采用瓊脂擴散法進行藥敏試驗；成功地分離并鑒定了一株高致病性的嗜水氣單胞菌AM-1，并對其毒力基因進行檢測，為此次中華鱉疾病的防治提供了重要的指導意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2019年5月從安徽省某中華鱉養殖場采集患典型癥狀的瀕死中華鱉(350 g±30 g)，冷藏帶回實驗室進行病原分離和鑒定。健康1齡中華鱉(350 g±30 g)購自安徽蚌埠某中華鱉養殖場。試驗在中國水產科學研究院長江水產研究所魚類病害實驗室，于2019 年5—10 月進行。

1.2 主要試劑和儀器

所需生化試劑和藥品均購自國藥集團；腦心浸液培養基(BHI)購于美國BD公司；LB培養基購自上海博微生物科技有限公司；酵母提取物、胰蛋白胨、DPBS緩沖液、瓊脂糖等試劑購自Sigma公司；細菌總基因組提取試劑盒Bacterial DNA Kit 購自OMEGA 公司，病毒基因組DNA 提取Viral DNAkit 購自OMEGA 公司；PCR 擴增試劑盒2×Hieff?PCR Master Mix 購自上海翊圣生物科技有限公司，PCR 產物純化試劑盒Gel Extraction Kit 購自OMEGA公司。藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司。全自動微生物鑒定系統來自于美國BIOLOG 公司的Biolog GEN Ⅲ。引物由武漢天一輝遠生物技術有限公司合成。

1.3 中華鱉虹彩病毒檢測

取瀕死中華鱉的肝臟、脾臟和腎臟組織，加入含雙抗的PBS，在混勻振蕩器中充分研磨，反復凍融3 次后，4℃條件下3000 rpm離心30 min后取上清液，利用病毒DNA提取試劑盒，按試劑盒說明書進行病毒基因組DNA 提取。參考中華鱉虹彩病毒(STIV)引物[13]對提取的DNA 進行PCR 擴增，具體引物信息見表1。PCR 擴增反應體系25 μL，包括12.5 μL PCR Mix，10 μmol/L 上、下游引物各1 μL，1 μL 模板DNA 以及9.5 μL雙蒸水。反應條件為：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃復性30 s，72℃延伸10 min，共35 個循環。以中華鱉虹彩病毒DNA 為陽性對照，并設置陰性對照。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 細菌病原的分離和純化

用70%酒精對患病中華鱉的體表消毒后，置于生物安全柜中進行解剖，挑取部分肝臟，涂布于BHI瓊脂平板上，于30℃恒溫培養48 h。挑取平板中菌落，重新劃線培養于BHI瓊脂平板上，于相同的條件下培養，得到純化的單菌落。挑取單菌落接種到5 mL BHI 液體培養基中，于30℃、200 rpm 條件下培養48 h。菌液加入甘油后分裝到1.5 mL EP 管中，置于-80℃超低溫冰箱保存備用。分離的菌株命名為AM-1。

1.5 病原的鑒定

1.5.1 細菌形態鑒定28℃條件下將分離的菌株在LB固體培養基純培養18 h后觀察菌落形態。用生理鹽水制備菌懸液做革蘭氏染色。

1.5.2 細菌生理生化鑒定 取經LB 固體培養基純培養的菌株，單菌落劃線接種于BUG（Biolog通用培養基）鑒定平板上，28℃培養16～24 h，待菌落大小適宜時取Biolog細菌鑒定試劑盒IF-A接種液，將管外壁擦拭干凈，置入Biolog 濁度儀中調整其讀數為100%T；用無菌棉簽蘸取適量的單菌落至接種液中，使濁度儀讀數在92%T～98%T之間，用移液器將混合液以每孔100 μL體積轉移至GEN Ⅲ鑒定板中，然后將鑒定板裝載于Biolog系統中培養，系統自動讀數并輸出鑒定結果。

1.5.3 分子生物學鑒定 將純培養的菌懸液以10000 rpm離心2 min 后收集菌體，然后按照Bacterial DNA Kit(OMEGA)試劑盒說明書上的方法提取細菌基因組DNA。采用16S rDNA 基因通用引物[14]（表1）對分離到的菌株16S rDNA進行PCR擴增。PCR反應體系為50 μL，包括25 μL PCR Mix，10 μmol/L上、下游引物各2 μL，2 μL 模板DNA 以及19 μL 雙蒸水。反應條件為94℃預變性3 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃復性45 s，35個循環，最后72℃延伸10 min。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收后測序。將測序結果置于 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 的Blast(Basic Local Alignment Search Tool)進行序列同源性比對，然后取不同來源的嗜水氣單胞菌16S rDNA 基因序列用MEGA7.0(http://www.megasoftware.net/previousVersions.ph) 中的鄰接法(Neighbor-Joining, NJ)構建系統發育樹，以1000 次自舉分析(Bootstrap)進行置信度檢測。

表1 本實驗中所用的引物序列

1.6 人工感染實驗

分離菌株培養后通過平板計數法測定菌液濃度，并分別制備1×106、1×107、1×108、1×109CFU/mL 和1×1010CFU/mL 共5 個濃度梯度的菌懸液。將室內暫養1周的48只健康1齡中華鱉（體重350 g±30 g）以8只/組隨機均分為6組。5個實驗組分別從腹甲基部以腹腔感染1 mL/只劑量接種5種不同濃度的菌懸液，另外一組對照組注射同樣體積的PBS。感染后在23℃±2℃的室內連續觀察8 天，期間定期飼喂餌料，記錄死亡數量及癥狀，并剖檢以確定死亡的中華鱉體內能分離得到攻毒的菌株。

1.7 藥物敏感性測定

培養試驗菌株并用無菌PBS 調整菌液濃度為1× 108CFU/mL，吸取100 μL菌液涂布于MH(Mueller-Hinton)培養基表面，靜置10 min待培養基表面的菌液被完全吸收，將抗生素藥敏片分別貼在培養基表面，然后放入28℃恒溫培養箱中倒置培養24 h。測量并記錄抑菌圈大小(mm)，按照藥敏試劑盒使用說明判定敏感性。

1.8 毒力基因檢測

參照Nawaz 等的方法，分別合成6 種毒力因子的特異性引物，氣溶素(Aerolysin,aero)、熱不穩定性腸毒素(Heat-labile enterotoxin,alt)、細胞毒性腸毒素基因(Cytotoxic enterotoxin,act)、熱穩定性腸毒素(Heatstable enterotoxin,ast)、溶血素(Hemolysin A,hly)、彈性蛋白酶(Elastase,ahy)，引物序列信息見表1。以分離菌株AM-1基因組DNA為模板進行PCR檢測，PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳并觀察判定結果。

2 結果與分析

2.1 患病中華鱉癥狀

患病中華鱉最典型的癥狀為反應遲鈍，頸部有出血點，腫大，伸縮困難，腹甲和四肢有紅色出血點或斑塊。剖檢后發現腮腺部位粘膜出血，肝臟和脾臟腫大，部分個體肝臟有出血現象（見圖1）。

圖1 患病中華鱉主要癥狀

2.2 病毒病原檢測

對患病中華鱉組織提取物全基因組DNA 進行中華鱉虹彩病毒進行檢測，結果顯示，從上述組織液中未檢出任何擴增條帶。

2.3 分離細菌的菌落形態及菌體特征

從患病中華鱉肝臟中分離的菌株AM-1在普通瓊脂營養平板上經28℃培養18～24 h 后，長出直徑0.7～1.2 mm，圓形、中央隆起，濕潤，半透明，露滴狀，灰白色或灰黃色帶有特殊氣味的菌落，染色后顯示為革蘭氏陰性（圖2A和2B）。

圖2 菌株AM-1的形態特征。營養瓊脂(A)和革蘭氏染色(B)

利用BIOLOG 微生物自動鑒定系統對分離菌株AM-1 進行鑒定。結果表明AM-1 菌屬于嗜水氣單胞菌。鑒定的部分生理生化指標如表2所示。

表2 利用BIOLOG自動微生物分析系統對分離菌株AM-1的生化鑒定結果

2.4 分離菌株16S rDNA序列分析

通過PCR 擴增和序列測定獲得分離菌株AM-1 16S rDNA基因1407 bp長度的序列片段，將其在NCBI數據庫中進行BLAST比對，結果發現其與嗜水氣單胞菌的標準菌株ATCC7966(CP000462)的相似度達98%，而且與菌株AM184306 等嗜水氣單胞菌分離株的相似度也高達98%，確定該菌株為嗜水氣單胞菌。基于16S rDNA基因序列，從NBCI數據庫選擇不同來源的嗜水氣單胞菌14株，與中華鱉嗜水氣單胞菌分離株AM-1 構建NJ 系統發育樹（圖3），結果表明：AM-1首先與來源于鯽魚腎臟分離的嗜水氣單胞菌(KC812106.1)和患“白底板”病的中華鱉體內分離的嗜水氣單胞菌(GU563992.1)聚為在一起。

圖3 構建不同來源嗜水氣單胞菌16S rDNA序列NJ進化樹;AM-1為本研究分離株

2.5 分離菌株的致病性

利用分離純化的分離菌株AM-1制備5個濃度梯度1×106、1×107、1×108、1×109CFU/mL和1×1010CFU/mL的菌液，分別腹腔注射健康中華鱉，然后連續對其觀察8天。結果發現，對比實驗組而言，注射第2天，除了1×106CFU/mL濃度注射組未出現中華鱉死亡現象，其余4 個組中華鱉都有不同程度的死亡，其中以1×1010CFU/mL濃度組的死亡率最高。觀察死亡中華鱉的癥狀主要表現為脖頸發紅。在注射第4天，1×1010CFU/mL菌液濃度組中華鱉全部死亡，死亡率為100%，1×106CFU/mL 濃度組從注射第2 天后出現持續死亡，到實驗結束時死亡率為75%，1×107CFU/mL 和1×108CFU/mL 濃度組的死亡率均為87.5%，1×109CFU/mL濃度組的死亡率為100%。在第4天和第5天感染后死亡的中華鱉個體中觀察到有一定程度的脖頸紅腫和腹甲出血現象，與自然發病類似。對照組在試驗期間累積死亡中華鱉1 只，無任何脖頸紅腫等癥狀。統計中華鱉攻毒后的死亡率和生存曲線如表3 和圖4 所示。此外，對人工感染死亡的中華鱉進行細菌分離鑒定，結果與嗜水氣單胞菌AM-1 一致。綜合上述結果表明，嗜水氣單胞菌AM-1是導致此次中華鱉脖頸紅腫病的致病菌。

表3 分離菌株AM-1對中華鱉致病性的實驗結果

圖4 中華鱉攻毒后的生存曲線

2.6 藥物敏感試驗

分離菌株AM-1 常見的藥物敏感性檢驗如表4 所示。按照藥敏試劑盒使用說明判定，分離菌株嗜水氣單胞菌AM-1 對恩諾沙星、氧氟沙星、左氟沙星、慶大霉素、頭孢他啶和氨曲南敏感，對氟苯尼考和多粘菌素中度敏感，而對諾氟沙星、環丙沙星、氯霉素等藥物具有耐藥性。

表4 分離菌株AM-1的藥物敏感性

2.7 毒力基因檢測

用嗜水氣單胞菌6 種毒力基因特異性引物進行PCR擴增，經1.5%瓊脂糖凝膠電泳顯示，發現氣溶素、熱不穩定性腸毒素、熱穩定性腸毒素、溶血素、彈性蛋白酶5種毒力基因都能擴增到單一且與預期片段相符合的條帶（圖5），而細胞毒性腸毒素基因未見擴增產物。

圖5 分離菌株毒力基因擴增電泳圖

3 討論

3.1 病原的分離與鑒定

嗜水氣單胞菌是一種條件致病菌，在自然界中廣泛存在，一定條件下對水產動物、畜禽和人類均有致病性[15-17]。其可以引起草魚、大菱鲆、羅非魚、大鯢和中華絨螯蟹等多種水產養殖魚類、甲殼類和兩棲類動物患病[17-19]。嗜水氣單胞菌可以引起中華鱉出血性腸道壞死癥、紅脖子病、紅底板病、癤瘡病、白斑病和腐皮病等病癥[20]。“紅脖子病”是中華鱉發現比較早的疾病，也是危害相對最嚴重的疾病之一。前期，不同學者對其病原的研究得到不同結論：其中包括虹彩病毒[21]，嗜水氣單胞菌[22]，維氏氣單胞菌[23]，嗜水氣單胞菌和蠟樣芽胞桿菌混合感染等[24]等，但僅邱德全等[22]鑒定病原之后在中華鰲上開展了詳細的回歸感染實驗。本研究中，我們對患病中華鱉分別開展了細菌和中華鱉虹彩病毒檢測，其中通過分子生物學方法未檢出有中華鱉虹彩病毒存在；另外，在細菌檢測過程中，從患病中華鱉的肝臟組織中分離到單一的、數量眾多的嗜水氣單胞菌，回歸感染實驗復制出與自然發病類似的病癥。確定引起中華鱉脖頸紅腫、呼吸困難、腹甲出血點/斑的致病原為嗜水氣單胞菌。

3.2 人工感染

本研究采用5個濃度的菌液對中華鱉進行腹腔注射感染以驗證其致病性。結果發現高濃度菌液可以導致中華鱉出現急性死亡，例如在注射4 天內，1×1010CFU/mL 注射濃度組中華鱉全部死亡，死亡癥狀為脖頸發紅。而低濃度注射組，從注射第2 天開始出現死亡，在第4天和第5天死亡的個體中觀察到與自然發病有一定程度相似的脖頸紅腫和腹甲出血現象。邱德全等[22]從患紅脖子的中華鱉體內分離到一株嗜水氣單胞菌，然后分別利用腹腔注射感染、灌胃感染、傷口感染和水體浸泡感染檢測其致病性。結果發現腹腔注射會導致多數中華鱉急性死亡，灌胃和傷口感染不會產生頸部紅腫的現象，而浸泡感染的個體會在感染20天左右出現脖子變粗，頸部充血，底板和四肢有出血點的癥狀。這與本研究嗜水氣單胞菌導致中華鱉脖頸腫脹，底板和四肢有出血點/斑的結果相似，這充分證明嗜水氣單胞菌是導致中華鱉脖頸紅腫癥狀的致病菌，但是癥狀是否典型則與嗜水氣單胞菌感染的方式和感染時間有關。

3.3 發病原因分析

本次發病中華鱉主要出現在溫室養殖過程中，養殖水溫普遍在30℃左右。目前中華鱉養殖多為工廠化集約養殖，養殖密度大。水體中常見的嗜水氣單胞菌在高密度養殖和加溫(28～30℃)飼養條件下，生長條件最佳，繁殖能力最快，致病性也會增強，是導致鱉病的主要致病菌[11]。在中華鱉溫室養殖中，與嗜水氣單胞菌病發生相關的主要環境因子有溫度、溶解氧、pH、氨氮、生物因子和亞硝酸氮等[24]，所以高密度養殖情況下，投餌飼喂導致水體中容易富集餌料殘渣和糞便等物質，養殖水體循環緩慢會造成水體污染，而且高溫還會使中華鱉自身的抵抗力下降[25]，所以嗜水氣單胞菌這一條件性致病菌就會“趁虛而入”導致機體感染。

3.4 嗜水氣單胞菌藥敏性質

藥敏試驗結果表明中華鱉脖頸紅腫的病原菌嗜水氣單胞菌AM-1 對菌對恩諾沙星、氧氟沙星、左氟沙星、頭孢他啶和氨曲南敏感，對氟苯尼考和多粘菌素中度敏感，而對諾氟沙星、環丙沙星、氯霉素等藥物具有耐藥性，該藥敏結果與康紹珠[26]和王帥兵等[27]報道有一定差異，這可能與用藥習慣及菌株差異有關。目前越來越多的研究發現嗜水氣單胞菌的耐藥性呈上升趨勢，甚至出現多重耐藥性。因此，在養殖過程中，要做好藥敏試驗，有針對性用藥，應做好用藥記錄，盡量使用窄譜抗生素，聯合用藥和輪換用藥相結合。

3.5 嗜水氣單胞菌毒力基因分析

細菌所攜帶毒力因子與其致病性緊密相關，氣溶素、溶血素、絲氨酸蛋白酶、彈性蛋白酶、金屬蛋白酶及細胞毒性腸毒素是嗜水氣單胞菌重要的毒力因子[28]，其中氣溶素、溶血素和細胞毒性腸毒素基因是典型的3種外毒素[29]，與動物出血病、敗血癥密切相關。經毒力基因檢測，本次分離株AM-1攜帶氣溶素、熱不穩定性腸毒素、熱穩定性腸毒素、溶血素、彈性蛋白酶5 種毒力基因，這可能與其具有較強致病性有關。

4 結論

本研究從患病中華鱉體內分離純化得到一株細菌，通過形態學、生理生化特征和16SrDNA 序列分析鑒定分離菌株為嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)。人工感染試驗顯示該菌對中華鱉具有較強致病性，且發病癥狀與自然發病中華鱉癥狀一致，表明該菌是此次中華鱉疾病的病原菌。藥敏試驗顯示該菌對恩諾沙星和左氧氟沙星等藥物敏感，對復方新諾明、氨芐西林和四環素等不敏感。毒力基因檢測顯示，該嗜水氣單胞菌分離株攜帶氣溶素、熱不穩定性腸毒素、熱穩定性腸毒素、溶血素、彈性蛋白酶5 種毒力基因。