低氧脅迫對軍曹魚幼魚免疫相關基因轉錄水平表達的影響

王維政，楊林桐，楊二軍，謝瑞濤,3，陳剛,2，黃建盛,2*

( 1.廣東海洋大學 水產學院，廣東 湛江 524088；2.南方海洋科學與工程廣東省實驗室（湛江），廣東 湛江 524025；3.廣東恒興飼料實業股份有限公司，廣東 湛江 524022)

1 引言

免疫是動物以維持自身穩態為目的而進行的一種特異性的生理反應，根據免疫響應的類型，魚類的免疫分為先天免疫和適應性免疫。先天免疫構成了魚類抵御外界病原體感染的第一道防線，在早期的識別以及后期觸發病原體入侵而導致的促炎反應中起著重要作用，通過模式識別受體（Pattern Recognition Receptors，PRRs）對病原體入侵的識別而啟動。適應性免疫則負責對特定病原體產生特異性的免疫應答，兩者在防御、自穩和監督方面發揮關鍵作用[1-2]。免疫系統主要包括免疫組織及器官、免疫細胞和免疫因子3種組成成分[3]。免疫組織和器官是動物機體免疫細胞發生、成熟、活化及最終產生免疫應答的場所，魚類的免疫器官分為中樞免疫器官和外周免疫器官[4]，其中鰓、肝臟、腸道和脾臟是魚類重要的免疫器官[5-8]，在免疫應答中扮演著重要的角色。免疫細胞包括淋巴細胞、巨噬細胞、自然殺傷細胞和粒細胞等，主要分布在免疫器官、淋巴液和血液中。免疫因子則包含細胞因子、補體和抗菌肽等[9-11]，共同發揮免疫應答功能。

低氧是一種由人類活動或者環境變化引起的自然現象，作為魚類的應激條件之一，會對魚類的生長和健康造成影響。持續暴露在低氧環境中，魚類的行為、代謝發生異常，還可能對免疫功能造成損傷，甚至導致魚類的死亡[12]。據報道，相對于常氧，低氧對尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）的免疫系統具有明顯的抑制作用[13]。長期的低氧脅迫導致大西洋鮭（Salmo salar）免疫相關基因轉錄水平表達量的降低或延遲，從而改變其免疫反應[14]。在對金頭鯛（Sparus aurata）的研究中也發現，低氧脅迫會抑制其頭腎白細胞的呼吸爆發活力，從而降低其免疫力[15]。由此可見，低氧與魚類的免疫能力息息相關，研究低氧對魚類免疫功能的影響具有重要意義。

軍曹魚（Rachycentron canadum），隸屬于鱸形目的單科單屬單種魚類（軍曹魚科，軍曹魚屬），又被稱作海鱺和海龍魚，屬于大型洄游性魚類，在世界各地均有分布。軍曹魚因其飼料轉化率高、肉質鮮美和市場價值巨大，在亞洲（尤其是中國）、北美洲、加勒比地區和南美洲大西洋沿岸等地區均有養殖[16]，在全世界范圍內的年產量約為59 538 t[17]。目前，關于低氧對軍曹魚免疫方面的報道還相對匱乏，本實驗室前期開展了低氧對軍曹魚幼魚肝臟免疫相關酶活的研究，為了進一步探究低氧對軍曹魚免疫功能的影響，本文以軍曹魚幼魚為研究對象，探討低氧對其免疫相關基因腫瘤壞死因子α（TNFα）、腫瘤壞死因子α誘導蛋白 3（TNFAIP3）、白細胞介素 1β（IL-1β）、白細胞介素1受體 2（IL-1R2）、白細胞介素 17C（IL-17C）和熱休克蛋白70（HSP70）在不同組織（鰓、肝臟、腸道和脾臟）中的轉錄水平表達情況，為闡明軍曹魚低氧適應機制提供基礎資料。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

本研究所用軍曹魚為當年人工繁育的幼魚，2019年6月運到廣東恒興飼料股份有限公司863基地后，于室內24 h流水養殖系統暫養1周，初始體質量為（50.44±2.78）g，體長為（16.87±2.19）cm。暫養水溫為（29±1）℃，溶解氧濃度在 6 mg/L以上，鹽度為28～30，pH為7.8～8.0，自然光周期，每天早上 8:00和下午4:00各飽食投喂配合飼料（廣東越群海洋生物研究開發有限公司）1次，1 h后清除殘餌和糞便，實驗開始前1天停止投喂。

2.2 低氧脅迫實驗

根據實驗要求將軍曹魚幼魚分為常氧對照組和低氧脅迫組，每個處理組有3個重復，每個重復有35尾魚。實驗周期為28 d，常氧對照組所有條件與暫養期間一致，低氧脅迫組除溶解氧濃度控制在（3.15±0.21）mg/L的水平外，其他條件與暫養相同。低氧脅迫組的溶氧條件實現方法：首先關掉流水以及停止充氣，在每個養殖水槽上方覆蓋聚乙烯薄膜，最大限度地隔絕空氣與水體的接觸，利用軍曹魚的呼吸作用使水體的溶解氧濃度降至3 mg/L左右，其次不斷調節充氣量的大小以及流水速度來控制氧氣的輸入，以此穩定實驗所需的溶氧條件，期間使用化學滴定法（GB 7489—87）檢測水體的溶氧量。最終在實驗期間，低氧脅迫組的溶解氧濃度穩定在（3.15±0.21）mg/L，常氧對照組溶解氧濃度為（6.18±0.24）mg/L。實驗結束時低氧脅迫組軍曹魚體質量為（58.44±3.03）g，體長為（18.23±1.48）cm，常氧對照組軍曹魚體質量為（119.17±5.80）g，體長為（20.94±1.32）cm。

實驗分別在低氧脅迫的第1天、第7天、第14天和第28天進行取樣，且同時取對照組樣品。取樣時每個水槽取5尾軍曹魚，使用MS-222進行麻醉，解剖取鰓、肝臟、腸道和脾臟，裝進2 mL凍存管后置于液氮速凍，運回實驗室后放進-80℃冰箱保存待測。

2.3 總RNA的提取以及反轉錄

軍曹魚幼魚各組織樣品在液氮中研磨后，使用總RNA提取試劑盒TransZol Up Plus RNA Kit（北京全式金生物有限公司）提取組織的總RNA。通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳和超微量核酸蛋白測定儀檢測其完整性和濃度后，以提取的總RNA為模板，根據反轉錄試劑盒EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix（北京全式金生物有限公司）說明書進行反轉錄，合成模板cDNA。

2.4 引物設計

根據本實驗室已有的軍曹魚肝臟轉錄組數據，篩選出注釋為 TNFα、TNFAIP3、IL-1β、IL-1R2、IL-17C、HSP70和內參基因β-actin的unigene。經NCBI數據庫Blast比對驗證后，利用Primer Primer 6.0設計特異性引物 TNFα-F/R、TNFAIP3-F/R、IL-1β-F/R、IL-1R2-F/R、IL-17C-F/R、HSP70-F/R和β-actin-F/R（表1），用于實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測，每組樣品重復3次，采用2-△△CT的方法計算各基因的相對表達量。

表1 本研究所用引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

2.5 數據分析

使用GraphPad Prism 8軟件對數據進行作圖，采用配對t檢驗的方法進行數據差異顯著性分析，p＜0.05表示差異顯著，p＜0.01表示差異極顯著。

3 結果

3.1 低氧脅迫對軍曹魚幼魚鰓組織免疫相關基因轉錄水平表達的影響

低氧脅迫對軍曹魚幼魚鰓組織免疫相關基因轉錄水平表達的影響見圖1。由圖1可知，在鰓組織中，低氧脅迫后，TNFα、IL-1R2和HSP70變化趨勢相同，在脅迫1 d時，TNFα、IL-1R2基因表達量極顯著下降（p＜0.01），HSP70 顯著下降（p＜0.05），在脅迫 7 d 時上升至與對照組無顯著性差異的水平后，在脅迫14 d時均極顯著下降（p＜0.01），在脅迫 28 d 時，TNFα、HSP70基因表達量極顯著下降（p＜0.01），IL-1R2顯著下降（p＜0.05）；TNFAIP3 在脅迫 1 d 時極顯著上升（p＜0.01）后呈下降趨勢，其中在脅迫7 d和14 d時分別與對照水平具有顯著（p＜0.05）和極顯著差異（p＜0.01），在脅迫28 d時上升至與對照組無顯著差異的水平；IL-1β在脅迫1 d時極顯著下降后極顯著升高（p＜0.01），在脅迫7 d、14 d和28 d時極顯著高于對照組（p＜0.01）；IL-17C 在脅迫7 d 和14 d 時極顯著下降（p＜0.01），脅迫1 d和28 d與對照水平無顯著差異。

圖1 低氧脅迫后軍曹魚幼魚鰓組織 TNFα（a）、TNFAIP3（b）、IL-1β（c）、IL-1R2（d）、IL-17C（e）和 HSP70（f）基因的相對表達量Fig.1 Relative expression of TNFα (a), TNFAIP3 (b), IL-1β (c), IL-1R2 (d), IL-17C (e) and HSP70 (f) genes in gill of juvenile cobia after hypoxia

3.2 低氧脅迫對軍曹魚幼魚肝臟免疫相關基因轉錄水平表達的影響

低氧脅迫對軍曹魚幼魚肝臟免疫相關基因轉錄水平表達的影響見圖2。由圖2可知，在肝臟中，低氧脅迫后，TNFα和IL-1R2表達趨勢一致，在脅迫1 d時顯著下降（p＜0.05）后上升，脅迫7 d時與對照組無顯著差異，在脅迫14 d和28 d時分別極顯著（p＜0.01）和顯著低于對照水平（p＜0.05）；TNFAIP3在脅迫 1 d時極顯著升高（p＜0.01）后顯著下降，并且在脅迫14 d和28 d 時與對照組具有極顯著差異（p＜0.01）；IL-1β 在所有時間點均極顯著高于對照水平（p＜0.01）；IL-17C在脅迫 7 d、14 d和 28 d時極顯著下降（p＜0.01）；HSP70基因表現為不斷升高的變化趨勢，在脅迫7 d和14 d時顯著升高（p＜0.05），在28 d 時則極顯著上升（p＜0.01）。

圖2 低氧脅迫后軍曹魚幼魚肝組織 TNFα（a）、TNFAIP3（b）、IL-1β（c）、IL-1R2（d）、IL-17C（e）和 HSP70（f）基因的相對表達量Fig.2 Relative expression of TNFα (a), TNFAIP3 (b), IL-1β (c), IL-1R2 (d), IL-17C (e) and HSP70 (f) genes in liver of juvenile cobia after hypoxia

3.3 低氧脅迫對軍曹魚幼魚腸道免疫相關基因轉錄水平表達的影響

低氧脅迫對軍曹魚幼魚腸道免疫相關基因轉錄水平表達的影響見圖3。由圖3可知，在腸道中，低氧脅迫后，TNFα、IL-1β、IL-1R2、IL-17C和 HSP70基因表達量在脅迫的所有時間點均極顯著高于對照組（p＜0.01），TNFAIP3基因表達量在脅迫 1 d時極顯著升高（p＜0.01）后顯著下降，并且在脅迫7 d和14 d分別與對照組具有顯著差異（p＜0.05）和極顯著差異（p＜0.01）。

圖3 低氧脅迫后軍曹魚幼魚腸組織 TNFα（a）、TNFAIP3（b）、IL-1β（c）、IL-1R2（d）、IL-17C（e）和 HSP70（f）基因的相對表達量Fig.3 Relative expression of TNFα (a), TNFAIP3 (b), IL-1β (c), IL-1R2 (d), IL-17C (e) and HSP70 (f) genes in intestine of juvenile cobia after hypoxia

3.4 低氧脅迫對軍曹魚幼魚脾臟免疫相關基因轉錄水平表達的影響

低氧脅迫對軍曹魚幼魚脾臟免疫相關基因轉錄水平表達的影響見圖4。由圖4可知，在脾臟中，低氧脅迫后TNFα、IL-1β、IL-1R2和IL-17C具有相同的變化趨勢，在脅迫的所有時間點均有明顯的下降，其中，TNFα和IL-17C在脅迫1 d、7 d和14 d時極顯著下降（p＜0.01），在脅迫 28 d時則顯著下降（p＜0.05）；IL-1β在脅迫 1 d和 28 d時極顯著下降（p＜0.01），在脅迫7 d 和 14 d 時則顯著下降（p＜0.05）；IL-1R2 在脅迫 1 d、7 d和 28 d時極顯著下降（p＜0.01），在脅迫 14 d時則顯著下降（p＜0.05）。

圖4 低氧脅迫后軍曹魚幼魚脾組織 TNFα（a）、TNFAIP3（b）、IL-1β（c）、IL-1R2（d）、IL-17C（e）和 HSP70（f）基因的相對表達量Fig.4 Relative expression of TNFα (a), TNFAIP3 (b), IL-1β (c), IL-1R2 (d), IL-17C (e) and HSP70 (f) genes in spleen of juvenile cobia after hypoxia

4 討論

在養殖條件下，魚類經常會受到低氧等的環境脅迫壓力，暴露在環境脅迫中的魚類不僅新陳代謝、滲透調節等會受到影響，其免疫屏障功能也會受損，如果長期受到環境脅迫的壓力，還可能導致其生長緩慢、行為異常，并且增加其疾病易感性，對魚類的養殖造成嚴重的損失[18]。在魚類的免疫系統中，細胞因子由免疫細胞分泌，是一種調節免疫應答、修復損傷組織和抵抗病原體感染的關鍵介質[19]。TNFα是一種由巨噬細胞、單核細胞和分化的T細胞產生的促炎細胞因子，通過增加IL-1β和IL-6的產生、黏附因子的表達、成纖維細胞的增殖以及啟動細胞毒性、凋亡和急性反應等實現促炎作用。IL-1β也是一種研究廣泛的促炎細胞因子，通過各種類型的細胞啟動2型環氧化物酶、磷脂酶A和誘導型一氧化氮合酶而產生，具有免疫上調和促炎活性[20]。TNFAIP3作為一種負調控因子，在免疫信號通路的負反饋調節中具有重要作用，可以作為NF-kB信號通路的負反饋調節因子，對NF-kB具有抑制功能，用以應對包括TNFα、IL-1β和LPS引起的多種炎癥刺激，對于維持免疫穩態至關重要[21]。IL-1R2是IL-1受體家族的細胞因子受體，可調節細胞代謝和多種細胞因子誘導的免疫炎癥反應，同時，IL-1R2是一個分子誘餌，可引誘IL-1β的結合而不啟動后續的反應，從而抑制炎癥，研究表明，其在潰瘍性結腸炎緩解過程中起著穩態調節作用[22]。IL-17C作為先天免疫的中介因子，通過激活NF-kB通路和MAPK通路，在黏膜炎癥和宿主抗病中發揮重要作用[23]。熱休克蛋白（HSPs）在正常和應激條件下都發揮著重要的生物學作用，正常情況下，作為分子伴侶蛋白參與蛋白質的折疊和運輸、細胞周期調控和細胞凋亡等，而在生物機體受到低氧等環境脅迫和微生物感染時，為了維持機體平衡，HSPs的表達顯著增加[18]。HSP70作為一種應激反應蛋白可激活先天免疫，參與保護細胞質成分、對抗包括細菌感染在內的各種應激條件，并在保護生物體免受應激誘導的細胞損傷中具有關鍵作用[24-25]。

為了揭示低氧脅迫對軍曹魚幼魚免疫功能的影響，本研究分析比較6種免疫相關基因在鰓、肝臟、腸道和脾臟中的轉錄水平表達情況，結果顯示，該6個基因在不同組織中具有不同的變化趨勢，原因可能是組織器官的功能特異性導致6個免疫相關基因響應情況的差異。魚類的鰓直接與水體接觸，是魚類進行氣體和水體交換的場所，具有濾食、排泄、調節滲透壓和酸堿平衡的作用，同時，魚鰓作為黏膜淋巴組織之一，也是魚體的免疫器官[26]。肝臟作為脊椎動物最大的腺體器官，在消化、能量代謝和激素合成等方面具有重要意義，此外，肝臟還含有大量的免疫細胞，能夠分泌產生細胞因子和補體等以應對病原體的入侵[27-28]。本文結果顯示，軍曹魚幼魚的鰓和肝臟中免疫基因的轉錄水平表達情況類似，TNFα、TNFAIP3、IL-1R2和IL-17C的表達在低氧脅迫后均出現了顯著和極顯著下降的變化情況，提示軍曹魚幼魚的鰓和肝臟在脅迫過程中可能具有類似的免疫應答機制，根據基因的功能表明，低氧可能降低了鰓和肝臟的免疫能力。在前期實驗結果中，低氧脅迫后，軍曹魚幼魚血清谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶活性顯著升高，表明幼魚肝臟受到一定程度的損傷[29]，在卵形鯧鲹的研究結果中，14 d的低氧嚴重影響其鰓器官形態結構，肝組織發生明顯的病理變化，受損嚴重[30-31]，由此推測，低氧也可能對軍曹魚幼魚的鰓和肝臟造成損傷，從而導致其免疫功能受到影響。IL-1β在鰓和肝臟中與其他炎癥基因變化趨勢相反，提示其參與鰓和肝臟免疫調控的機制可能存在差異，IL-1R2的誘餌功能以及TNFAIP3的負反饋調節作用的下降也可能是其表達升高的原因。HSP70基因的轉錄水平表達情況在鰓和肝臟中呈現相反的趨勢，其表達量在鰓組織中出現顯著和極顯著下降的情況，而在肝臟中則持續升高，暗示與鰓組織相比，HSP70可能在肝臟抵御低氧脅迫過程中發揮關鍵的作用。此外，在研究結果中還觀察到，總體來看，在低氧脅迫14 d和28 d后，免疫基因的表達量明顯低于脅迫1 d和7 d，對此，研究表明，魚類長期處于脅迫條件下，其免疫反應會受到抑制[32]，該結果進一步說明28 d的低氧脅迫可能造成軍曹魚幼魚的鰓和肝臟免疫功能的下降。

腸道除了具有消化和吸收功能以外，還具有免疫屏障功能，在腸黏膜中分布有大量的淋巴細胞以抵御病原體的入侵，是魚體防御的第一道屏障[33]。研究發現，長時間的低氧應激會破壞腸道的緊密連接結構，導致腸道的固有屏障受損，從而增加腸道的通透性，進而增加病原體入侵的機會，引發腸道的免疫炎癥[34-35]。通常，慢性腸道炎癥還會伴隨著促炎細胞因子的增加以及中性粒細胞和單核細胞的積累[36]。在本文的研究結果中，低氧脅迫后腸道TNFα、IL-1β和IL-17C等炎癥相關基因以及HSP70基因的轉錄水平表達量極顯著升高，負反饋調節因子TNFAIP3極顯著升高后再顯著下降。再結合實驗室前期研究結果，低氧導致軍曹魚幼魚腸黏膜皺襞高度、絨毛寬度、肌層厚度顯著下降，微絨毛排列雜亂、萎縮、脫落（數據還未發表）以及腸道菌群中條件致病菌的增多[37]，暗示低氧可能對腸道產生應激反應，導致軍曹魚幼魚腸道結構受損，腸道通透性增加造成病原菌的入侵，進而引發了腸道炎癥，導致軍曹魚腸道炎癥相關基因和HSP70表達的增加。Niklasson等[38]研究也發現，長期的低氧引發了大西洋鮭的腸道炎癥，腸道白細胞浸潤增加，然而，其腸道促炎細胞因子IL-1β和IFN γ卻沒有升高的現象，與本文結果有所差異，推測其原因，可能是脅迫的時間、程度以及魚的種類不同所致。

脾臟是硬骨魚免疫系統中最后發育形成的免疫器官[8]，含有淋巴細胞和巨噬細胞，發揮免疫功能，負責保護機體免受病原體的入侵和檢測異常細胞，也是紅細胞、中性粒細胞產生、成熟以及儲存的地點，具有造血功能[39-40]。Mu等[41]對大黃魚（Larimichthys crocea）低氧脅迫后的脾臟轉錄組進行分析，挖掘出大量免疫相關的差異表達基因，包括模式識別受體（PRRs），如 Toll樣受體（TLR-1、TLR2-1、TLR2-2）、凝集素（FUCL1、FUCL4、FUCL5）和巨噬細胞甘露糖受體（MRC1）等均受到低氧的抑制，表達量顯著下降，表明低氧可能抑制了PRRs介導的幾種免疫應答的信號通路。本文的研究結果也出現類似的現象，低氧脅迫導致軍曹魚幼魚脾臟6種免疫基因均表現出不同程度的下降趨勢，提示低氧可能抑制了軍曹魚幼魚脾臟的免疫功能，進而可能增加其感染病原菌的風險。

綜上，28 d低氧脅迫后，軍曹魚幼魚鰓、肝臟、腸道和脾臟中的免疫相關基因的轉錄表達水平發生顯著性的變化，長期的低氧可能抑制了幼魚的免疫功能，引發腸道炎癥，并增加幼魚感染病原菌的風險。