α-平滑肌肌動蛋白、乏氧誘導(dǎo)因子-1α在肺癌中的表達及對放化療療效的影響

劉學武，劉 敏，劉 翼，楊征奇，童月芳

(浙江衢化醫(yī)院 腫瘤中心，浙江 衢州 324004)

肺癌發(fā)病隱匿，發(fā)現(xiàn)時疾病分期往往較晚并已擴散至周圍組織或轉(zhuǎn)移[1-3]。目前，肺癌主要的治療方案有放射、手術(shù)和藥物治療，但往往因腫瘤易局部復(fù)發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致治療效果欠佳[4-5]。α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和乏氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)廣泛參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，并與腫瘤放射敏感性相關(guān)，已成為腫瘤治療研究的新方向和新思路。目前關(guān)于α-SMA和HIF-1α的報道主要集中在抑制腫瘤生長、纖維化等方面[6-9]。本研究觀察α-SMA和HIF-1α在肺癌中的表達及其對放化療療效的影響，以期為肺癌患者放化療提供新的生物靶標。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選取2016年1月—2017年12月于浙江衢化醫(yī)院確診為肺癌的患者66例為肺癌組，同期健康體檢者66例為對照組。肺癌組納入標準：①首次治療；②明確的組織學病理診斷；③接受放化綜合治療。排除標準：①有放化療相對禁忌證者；②有嚴重心、腦、血管、肝、腎疾病史者[10]。肺癌組平均年齡(61.24±5.45)歲，男42例、女24例，病理類型：鱗癌33例、腺癌27例、腺鱗癌6例，組織分化程度：高11例、中21例、低34例，TNM分期：Ⅰ/Ⅱ 22例、Ⅲ/Ⅳ 44例。對照組平均年齡(61.35±5.33)歲，男40例、女26例。兩組研究對象性別和平均年齡比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，所選研究對象均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器 快速總RNA提取試劑盒購自Sigma公司，PrimeScript RT試劑盒和SYBR-Green Premix Ex Taq購自Takara Bio公司，anti-alpha smooth muscle actin antibody 和anti-HIF-1 alpha antibody購自Abcam公司，DAB 染色試劑盒購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。NanoDrop 2000儀器購自Thermo Scientific公司，PRISM 7900序列檢測系統(tǒng)購自Applied Biosystems公司，高通量測序儀購自Life Technologies公司。

1.3 熒光定量 PCR 采用Trizol法提取肺癌組織和癌旁組織中的總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，應(yīng)用SYBR Green實時熒光定量PCR法對miR-21表達進行熒光定量分析。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性30 s、60 ℃退火90 s、72 ℃延伸90 s，共40個循環(huán)。選擇β-actin為內(nèi)參，用2-△△Ct值法計算相對表達量。α-SMA的引物：ForwardAAATGGGACCCTGAACAAACAC，Reverse GGAGCCTGGCAAGCACCTA；HIF-1α的引物：Forward GAAACCACCTATGACCTGC，Reverse CTGTTTGTTGAAGGGAGAA；β-actin的引物：Forward CACACCCGCCACCAGTTCG，Reverse GTCCTTCTGACCCATTCCCACC。

1.4 免疫組化法 將石蠟切片標本在二甲苯中脫蠟處理后，梯度酒精水化。加入蛋白酶修復(fù)液，37 ℃孵化30 min。加入3% H2O2，去過氧化物酶封閉液封閉10 min。PBS沖洗后，加入適量山羊血清，室溫下封閉30 min。吸取封閉液后，加入一抗于4℃冰箱孵育過夜，再加二抗，室溫孵育1 h。PBS沖洗后，DAB顯色處理10 min，脫水并封片。

1.5 化放療方法 肺癌研究對象連續(xù)靜脈滴注150 mL 0.9%氯化鈉溶液(含75 mg/m2多西紫杉醇)3 h。次日采用CT定位腫瘤位置，精確至病灶邊緣。將掃描圖像傳送至三維治療計劃系統(tǒng)內(nèi)，重建圖像。對放射治療的靶向區(qū)進行劃分，確定靶區(qū)周圍的器官組織。在靶向區(qū)以外3～4 mm，采用與患者相適應(yīng)的照射劑量以及照射視野。每周治療1 次，治療療程均為2個月。

1.6 觀測指標

1.6.1 療效 完全緩解：病灶完全消失，并且持續(xù)1個月以上無新病灶出現(xiàn)；部分緩解：腫瘤體積消退50%以上，并且持續(xù)1個月以上無新病灶出現(xiàn)；病變穩(wěn)定：腫瘤體積消退25%～50%；病變進展：腫瘤體積增加25%以上，甚至出現(xiàn)新病灶。總有效率=(完全緩解例數(shù)+部分緩解例數(shù))/總例數(shù)×100%。

1.6.2 毒副反應(yīng) 記錄患者治療期間惡心嘔吐、白細胞下降、血小板下降、貧血、肝功能障礙、腎功能障礙、放射性食管炎、放射性肺炎、腎功能損傷、脫發(fā)、電解質(zhì)紊亂、白細胞減少等不良反應(yīng)發(fā)生情況。

1.6.3 生存率 統(tǒng)計首次確診至死亡或者截止隨訪時間的患者例數(shù)，隨訪截止日期為2020年1月13日。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用 SPSS22.0統(tǒng)計軟件，計量資料比較采用t檢驗，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，生存資料采用Kaplan Meier法分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 肺癌組織α-SMA 和HIF-1α mRNA 水平 肺癌組織α-SMA mRNA 相對表達量(0.82±0.10)高于癌旁組織(0.38±0.05)和正常組織(0.11±0.02)，肺癌組織HIF-1α mRNA相對表達量(1.27±0.16)高于癌旁組織(0.54±0.09)和正常組織(0.13±0.03)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1。

**與癌旁組織比較，P<0.01；##與正常組織比較，P<0.01。

2.2 肺癌組織α-SMA和HIF-1α蛋白水平 癌旁組織及正常組織無α-SMA蛋白陽性表達，見封三圖1A；肺癌組織中α-SMA陽性表達主要見于胞核內(nèi)，細胞質(zhì)中少有分布，主要呈棕黃色彌散分布，見封三圖1B。肺癌患者中α-SMA陽性表達為47例(71.21%)。癌旁組織及正常組織無HIF-1α蛋白陽性表達，見封三圖1C；肺癌組織中HIF-1α陽性表達主要見于胞核內(nèi)，細胞質(zhì)中少有分布，主要呈棕色灶狀分布，見封三圖1D。肺癌患者中HIF-1α陽性表達為51例(77.27%)。

2.3 α-SMA和HIF-1α水平對放化療療效的影響 肺癌患者α-SMA陽性組中放化療有效率(17.02%，8/47)低于α-SMA陰性組(73.68%，14/19)，肺癌患者HIF-1α陽性組中放化療有效率(25.49%，13/51)低于HIF-1α陰性組(86.67%，13/15)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 α-SMA 和HIF-1α水平對肺癌患者放化療療效的影響 (例)

2.4 α-SMA和HIF-1α水平對放化療毒副反應(yīng)的影響 與α-SMA陰性組比較，α-SMA陽性表達主要影響的放化療毒性指標為惡心嘔吐、白細胞下降、放射性食管炎和放射性肺炎(χ2=14.226、14.226、4.881、5.575，均P<0.05)；與 HIF-1α陰性組比較，HIF-1α陽性表達主要影響的放化療毒性指標為惡心嘔吐、白細胞下降、貧血、放射性食管炎和放射性肺炎(χ2=16.752、5.660、6.762、 5.135、 6.106，均P<0.05)。見表2。

表2 α-SMA和HIF-1α水平對肺癌患者放化療毒副反應(yīng)的影響(例)

2.5 α-SMA和HIF-1α水平對2年生存率的影響 α-SMA陽性組患者1年生存率為55.32%(26/47)，2年生存率為8.51%(4/47)；α-SMA陰性組患者1年生存率為89.47%(17/19)，2年生存率為52.63%(10/19)；2組患者的2年生存率差異有統(tǒng)計學意義(χ2=15.664，P<0.05)。HIF-1α陽性組患者1年生存率為56.86%(29/51)，2年生存率為7.84%(4/51)；HIF-1α陰性組患者1年生存率為93.33%(14/15)，2年生存率為66.67%(10/15)；2組患者的2年生存率差異有統(tǒng)計學意義(χ2=19.685，P<0.05)。見圖3。

3 討論

有研究[11]認為，氧氣對維持腫瘤微環(huán)境有重要作用，實體瘤的氧濃度顯著低于其他正常組織。HIF-1α作為HIF-1轉(zhuǎn)錄因子的主要亞單位，在缺氧條件下能夠發(fā)揮氧調(diào)節(jié)功能[12]。本研究結(jié)果顯示，肺癌組織α-SMA mRNA和HIF-1α mRNA相對表達量明顯高于癌旁組織和正常組織，癌旁組織及正常組織無α-SMA蛋白和HIF-1α蛋白陽性表達；肺癌患者中α-SMA陽性表達率為71.21%，HIF-1α陽性表達率為77.27%；表明α-SMA和HIF-1α在實體瘤中均出現(xiàn)高表達，與之前的相關(guān)研究[13-14]結(jié)果相吻合，提示α-SMA和HIF-1α高表達與腫瘤分化程度和腫瘤治療效果可能有一定相關(guān)性。

董熠等[13]的研究結(jié)果顯示，α-SMA與不同劑量的放射性有一定關(guān)系，在8 Gy照射劑量時，α-SMA水平達到最高，此后逐漸降低；照射劑量增加至12 Gy后，α-SMA水平低于0 Gy照射劑量。魏亞寧等[14]研究結(jié)果顯示，患者化療后的HIF-1α表達顯著降低。吳旻等[15]研究表明，腫瘤患者放療后，HIF-1α 表達顯著降低。以上研究均表明，放化療作用腫瘤組織時，對α-SMA及HIF-1α的表達有一定影響。本研究結(jié)果還顯示，肺癌患者α-SMA陽性組和HIF-1α陽性組的放化療有效率明顯低于α-SMA陰性組和HIF-1α陰性組；與α-SMA陰性組相比較，α-SMA陽性對肺癌患者放化療毒副反應(yīng)的影響主要表現(xiàn)為惡心嘔吐、白細胞下降、放射性食管炎和放射性肺炎；與HIF-1α陰性組相比較，HIF-1α陽性對肺癌患者放化療毒副反應(yīng)的影響主要表現(xiàn)為惡心嘔吐、白細胞下降、貧血、放射性食管炎和放射性肺炎。α-SMA陽性組患者的2年生存率明顯低于α-SMA陰性組患者，HIF-1α陽性組患者的2年生存率明顯低于α-SMA陰性組患者。此前相關(guān)研究[16-17]有類似結(jié)論。

綜上所述，肺癌患者中α-SMA、HIF-1α均呈現(xiàn)高陽性率，α-SMA、HIF-1α陽性患者放化療有效率和2年生存率下降，α-SMA和HIF-1α陽性表達的相關(guān)分子機制還需進一步探究。