響應面法優化滇黃精多酚的提取工藝及抗氧化活性

楊勇幫，胡棟寶，普曉燕，楊 猛

(1.玉溪市食品藥品檢驗所，玉溪 653100；2.玉溪師范學院化學生物與環境學院，玉溪 653100)

滇黃精(PolygonatumkingianumColl.et Hemsl)屬百合科植物，有節節高、德保黃精和仙人飯等多個名稱，主產于中國云、貴、川等地[1]。滇黃精藥用部位為干燥根莖，性平、味甘，兼具抗病毒、止血、抗疲勞、降血糖、抗氧化、滋陰補氣及健脾潤肺等功能，可預防心血管疾病、脾胃虛弱、體虛無力、口干舌燥、肺虛燥咳、精血無余等癥[2]。滇黃精的主要化學成分有生物堿、木質素、蒽醌、甾體皂苷、三萜、黃酮、多酚、多糖及揮發油等活性物質[3-4]。目前，關于滇黃精中多糖和黃酮類物質的研究較多，但對其多酚類物質的研究鮮有報道。多酚類物質抗氧化活性較強，能很好地清除自由基，延緩衰老[5]，為了更好地開發利用滇黃精的食用、藥用價值，本研究應用單因素實驗與響應面法[6-9]，以滇黃精多酚提取量為參考標準，采用Box-Behnken實驗設計優化提取工藝，研究滇黃精多酚的抗氧化活性，為藥食同源資源的開發利用提供理論依據。

1 儀器和試藥

1.1儀器 SHZ-D(Ⅲ)型水循環真空泵(鞏義市子華儀器設備有限責任公司)；H2-16K型臺式高速微量離心機(河南可成儀器設備責任有限公司)；CAV114C型電子分析天平(奧豪斯電子儀器有限公司)；紫外-可見分光光度計(上海菁華科技儀器責任有限公司)；EYELA型水浴鍋(上海愛朗儀器有限分公司)；SY3200-T型超聲波清洗設備(上海聲源超聲波儀器技術設備管理有限公司)。

1.2試藥 滇黃精藥材，采自云南省玉溪市新平縣哀牢山，經玉溪市食品藥品檢驗所牟娟副主任中藥師鑒定為百合科植物滇黃精(PolygonatumkingianumColl.et Hemsl)的根莖。沒食子酸(分析純)，武漢遠成共創科技有限公司；甲醇、丙酮(分析純)，四川西隴化工技術有限公司；抗壞血酸(分析純),天津市雙船化學試劑廠；福林酚、碳酸鈉(分析純),均購自國藥集團化學試劑有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)(分析純),均購自艾科達成都化學試劑有限公司；磷酸氫二鈉(分析純),天津市風船化學試劑科技發展有限公司；三氯乙酸(分析純),天津市大茂化學試劑廠；福林酚試劑(分析純)，南京都萊生物技術有限公司；鐵氰化鉀(分析純)，四川西隴化工技術有限公司。

2 方法

2.1滇黃精多酚的提取 精密稱定0.5 g滇黃精粉末，置于錐形瓶中，精密加入10 mL不同體積分數的乙醇，混勻后置于功率為220 W的超聲儀中超聲提取1 h，抽濾，收集濾液，濾渣中加入一定量的乙醇再重復抽濾2次，合并濾液，置于25 mL比色管中，加不同體積分數的乙醇稀釋至刻度，即得滇黃精多酚提取液。在10 mL試管中加入滇黃精多酚提取液1 mL及福林酚試劑0.5 mL，振蕩并搖勻，靜止放置反應5～7 min，再加入150 g·L-1的碳酸鈉溶液1.5 mL，混勻，冷卻至室溫，避光靜置1 h，用超純水作空白對照實驗，在400～900 nm波長范圍內測定吸光度值，測得滇黃精多酚的最大吸收波長為740 nm。

2.2繪制沒食子酸的標準曲線 精密稱定沒食子酸對照品適量，置于50 mL量瓶中，加體積分數為40%的乙醇40 mL溶解并稀釋至刻度，得0.2 mg·mL-1的沒食子酸對照品儲備液。精密量取沒食子酸對照品儲備液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置于25 mL比色管中，按順序分別加入福林酚試劑0.5 mL，振蕩搖勻并靜置反應5～7 min，加入150 g·L-1的碳酸鈉溶液1.5 mL并稀釋至10 mL刻度，冷卻至室溫，避光靜置反應1 h，在740 nm波長處測定吸光度值A。以沒食子酸溶液的質量濃度為橫坐標(x)、吸光度值為縱坐標(y)，繪制標準曲線，得線性回歸方程為y=78.314x+0.043 3(R2=0.996 7)。

2.3滇黃精多酚的測定 取1.2.1項下制備的滇黃精多酚提取液1 mL和福林酚試劑0.5 mL，振蕩并搖勻，靜止放置反應5～7 min，加入150 g·L-1的碳酸鈉溶液1.5 mL，混勻，冷卻至室溫，避光靜置1 h，用超純水作空白對照，吸收波長為740 nm。測定吸光度值A，計算滇黃精多酚的質量濃度。各實驗組平行取樣3份進行測定，取其平均吸光度值代入沒食子酸線性回歸方程計算滇黃精多酚質量濃度，根據公式計算滇黃精多酚的提取量：G=(T×V2×V1) ÷(m×V)，式中：G為滇黃精多酚的提取量(mg·g-1)；T為滇黃精多酚質量濃度(mg·mL-1)；V1為首次稀釋后體積(mL)；V2為二次稀釋后體積(mL)，定容至10 mL；V為移取的樣品體積(mL)；m為滇黃精取樣粉末質量(g)。

2.4單因素實驗提取滇黃精多酚 考察乙醇體積分數(10%、20%、30%、40%、50%、60%)、液料比(30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1)、超聲時間(30、40、50、60、70、80 min)以及不同提取溶劑(蒸餾水、體積分數為40%的甲醇、體積分數為40%的乙醇、體積分數為40%的丙酮)4個因素對滇黃精多酚提取量的影響，綜合分析確定其最佳提取條件。各因素分別設置3個因素，每組進行3次平行實驗，取平均值。

2.5響應曲面法優化總多酚實驗 參照Box-Behnken設計中心組合實驗，響應曲面的優化影響因素分別為乙醇體積分數 (A)、超聲時間 (B)和液料比(C)，以滇黃精多酚提取量作為響應值設計實驗，見表1。

表1 Box-Behnken設計的因素與水平

2.6抗氧化實驗 按照響應面優化的最佳條件(乙醇體積分數為38.7%、超聲時間為58 min、液料比為55∶1)，按照1.2.1項下方法提取滇黃精多酚提取液，調整波長至740 nm處，測定吸光度值，通過線性回歸方程計算得滇黃精多酚的質量濃度為0.008 mg·mL-1，設置不同的質量濃度梯度，分別用DPPH、ABTS、三價鐵離子作為抗氧化試劑，對滇黃精多酚提取液的還原能力進行測定，以抗壞血酸作為陽性對照。

2.6.1DPPH自由基清除活性的測定 準確稱量4.0 mg的DPPH，置于100 mL量瓶中，加乙醇得濃度為0.1 mmol·L-1的DDPH溶液，移取1 mL不同質量濃度梯度(0.002、0.004、0.006、0.008 mg·mL-1)的滇黃精多酚提取液，置于比色管中，加入DPPH溶液2 mL，室溫靜置30 min，于517 nm波長處測定其吸光度值(Ax)，然后用1 mL吸量管準確移取1 mL不同質量濃度的滇黃精多酚提取液置于試管中，用2 mL乙醇替代自變量DPPH，靜置30 min后測定其吸光度值(Ay)；準確移取2 mL乙醇置于干燥的試管中，按順序加入2 mL DPPH溶液，放置30 min后，測定吸光度值(A0)，用抗壞血酸作為陽性對照，計算 DPPH清除率，DPPH清除率=1-(Ax-Ay)÷A0。

2.6.2ABTS自由基清除能力的測定 準確稱量0.038 4 g ABTS固體和0.013 4 g過硫酸鉀固體，分別置于10 mL量瓶中，加超純水定容至刻度，取上述溶液和過硫酸鉀按照1∶1的比例混合，搖勻，冷卻至室溫，避光放置16 h，制成ABTS工作液，備用。取5 mL ABTS工作液，加無水乙醇，調整波長至734 nm處測定吸光度值A；取1 mL不同質量濃度(0.002、0.004、0.006、0.008 mg·mL-1)的滇黃精多酚提取液置于比色管中，分別加入ABTS溶液4 mL，避光靜置10 min，調整波長至517 nm處，測定吸光度值(Ax),移取1 mL不同質量濃度的提取液置于比色管中，加入無水乙醇4 mL代替自變量ABTS，室溫避光靜置10 min，于517 nm波長處測定吸光度值(Ay)，移取無水乙醇4 mL置于比色管中，依次加入ABTS溶液4 mL，放置10 min測其吸光度值 (A0)，用抗壞血酸作為陽性對照，ABTS清除率=1-(Ax-Ay)÷A0。

2.6.3三價鐵還原能力的測定 取1 mL不同質量濃度的滇黃精多酚提取液，加入2.5 mL PBS(0.2 mol·L-1，pH值為6.6)和10 g·L-1鐵氰化鉀溶液，混勻，于50 ℃恒溫水浴鍋中反應20 min，再加入2.5 mL超純水和0.5 mL三氯乙酸(體積分數為10%)終止反應，以5 000 r·min-1離心30 min，取上清液靜置10 min，在700 nm波長處測定其吸光度值A，用抗壞血酸作為陽性對照。

3 結果與分析

3.1單因素實驗結果

3.1.1乙醇體積分數對滇黃精多酚提取量的影響 滇黃精多酚提取量隨乙醇體積分數的逐漸增加呈現先增后減的趨勢，原因可能與乙醇的極性有關，體積分數不相同，極性也不相同，當乙醇體積分數為40%時，其極性和滇黃精多酚極性最接近，溶解性最好，使其大量溢出[9]；體積分數較低的乙醇可進入植物細胞內部并溶解液泡中的水溶性酚類，當乙醇體積分數過高時則會引起蛋白質變性，阻礙滇黃精多酚的提取[10]。另外，脂溶性雜質成分與乙醇-水分子結合能力與乙醇體積分數成正比，形成了競爭性抑制劑，從而導致滇黃精多酚提取量的降低，所以乙醇體積分數過低或過高都不利于滇黃精多酚的斷裂和擴散[11]。

3.1.2液料比對滇黃精多酚提取量的影響 滇黃精多酚提取量與液料比的變化規律：液料比為60∶1時，滇黃精多酚的提取效果最佳，隨后下降，液料比過高或過低都會使其他物質(如多糖)溶出而影響滇黃精多酚析出[9-10]。其次，滇黃精多酚的量是一定的，到達一定程度就無法析出，所以即使增多溶劑量也無法增多滇黃精多酚的提取量,因此60∶1是提取滇黃精多酚的最佳液料比。

3.1.3超聲時間對滇黃精多酚提取量的影響 超聲時間為60 min時提取效果最佳，原因是超聲時間過短，滇黃精多酚類物質未完全與組織分離；而超聲時間過長會產生機械力和熱能降解，從而使滇黃精多酚類物質遭到破壞，降低提取量[10-13]。因此超聲時間為60 min時，滇黃精多酚的提取量最大，為1.125 mg·g-1。

3.1.4不同溶劑對滇黃精多酚提取量的影響 考察不同溶劑對滇黃精多酚提取量的影響，結果為：蒸餾水<體積分數為40%的甲醇<體積分數為40%的乙醇<體積分數為40%的丙酮，這可能是由于滇黃精多酚在蒸餾水和體積分數為40%的甲醇中溶解不充分，可以使滇黃精多酚的氫鍵和疏水鍵與組織內物質斷裂而充分溶出，因此體積分數為40%的丙酮提取量更高[13]。

3.2Box-Behnken優化提取工藝

3.2.1使用Box-Behnken優化實驗設計方案 見表2和表3。由表2可知，滇黃精多酚提取量的回歸方程為Y=0.86-0.028A+0.051B+0.083C+0.019AB-0.026AC+0.053BC-0.03A2+0.013B2-0.026C2,相關系數R2=0.991 5，對線性回歸方程分析可知，擬合狀況較好，結果可靠。由表3可知，模型的F=90.50，P<0.000 1，該模型顯著性差異小且數據擬合度高。實驗模型的R2=0.991 5表明實驗結果與預測性一致性良好，表明該回歸模型擬合性好、回歸方程代表性良好，能準確預測實際情況。Radj2=0.980 5表明實驗結果為0.980 5時受實驗因素影響，模型能解釋98.05%響應值變化。變異系數(CV)=0.86%表明實驗隨機誤差小，失擬值P=0.014<0.005表明該方程具有較好的擬合性，方法可取，滇黃精多酚提取量的測定可用該方法進行預測。分析可知，滇黃精多酚提取量受3個因素影響的順序依次為：液料比(C)>超聲時間(B)>體積分數(A)。

表2 滇黃精多酚提取工藝響應面設計及其結果

表3 線性模型的方差分析

3.2.2響應面分析 在響應面圖中，曲面形狀反映出響應曲面點的交互作用對滇黃精多酚提取量的影響，曲面坡度傾斜度越大，影響越大，曲面坡度傾斜度越小，影響越小[9-12]。見圖1。由圖1可知，液料比對滇黃精多酚提取量的影響大于超聲時間，超聲時間對滇黃精多酚提取量的影響大于乙醇體積分數，曲面坡度傾斜度最大，對多酚提取量的影響呈高度顯著。采用Box-Behnken優化提取工藝，得最佳提取工藝為：乙醇體積分數為38.7%，液料比為55∶1，超聲時間為58 min。

圖1 響應面分析圖

3.3抗氧化活性 見表4。由表4可知，不同質量濃度滇黃精多酚提取液和維生素C溶液對DPPH、ABTS自由基的清除能力、三價鐵的還原能力有如下規律：當兩者質量濃度為0.002 mg·mL-1時，維生素C溶液對DPPH自由基的清除能力以及三價鐵的還原能力強于滇黃精多酚提取液；當兩者質量濃度為0.004 mg·mL-1時，對于DPPH自由基的清除能力以及三價鐵的還原能力，滇黃精多酚提取液和維生素C溶液兩者能力接近；而當兩者質量濃度大于0.006 mg·mL-1時，滇黃精多酚提取液對DPPH自由基的清除能力以及三價鐵的還原能力均強于維生素C溶液，最佳清除率達到89%。滇黃精多酚提取液和維生素C溶液對ABTS自由基的清除能力也隨兩者的質量濃度變化呈正比，對ABTS自由基的清除能力表現為：滇黃精多酚提取液在不同質量濃度下清除能力均強于維生素C溶液，特別是在質量濃度大于0.006 mg·mL-1時，兩者對自由基清除能力相差較大，滇黃精多酚提取液對自由基的最佳清除率能達到88%。

表4 滇黃精多酚對DPPH自由基、ABTS自由基的清除率及三價鐵的還原能力

4 結論

采用超聲波輔助技術提取滇黃精多酚，探究4個單因素實驗對其提取量的影響，確定最佳提取條件；再采用響應面法優化提取工藝得到滇黃精多酚的最佳提取工藝為：乙醇體積分數為38.7%，液料比為55∶1，超聲時間為58 min。抗氧化活性結果表明，除在0.002和0.004 mg·mL-1質量濃度時，滇黃精多酚提取液的DPPH自由基清除率略小于維生素C溶液或與維生素C溶液接近；其余的相同質量濃度水平，滇黃精多酚提取液的DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率以及三價鐵還原能力均高于維生素C溶液，可為天然抗氧化劑的開發提供參考。