基于HPLC-ELSD法的銀柴胡中甾醇類成分含量測定

王秀芬，李 靜，方光明，馬學琴

(1.寧夏職業技術學院，銀川 750021；2.寧夏醫科大學，銀川 750001)

1 儀器與試藥

1.1儀器 1220型高效液相色譜儀，1260B型蒸發光散射檢測器(美國安捷倫公司)；CPA225D型電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司)；XPE26型百萬分之一電子分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；YER-201D型旋轉蒸發器(鞏義市予華儀器有限公司)；FW135型中藥粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)；15C4390型超聲波清洗機(寧波新芝生物科技有限公司)。

1.2試藥 本實驗藥材采自內蒙、陜西、甘肅和寧夏，經杭州醫學院藥學院生藥室主任吳曉寧教授鑒定為石竹科植物StellariadichotomaL.var.lanceolataBge.的干燥根。α-菠甾醇(批號ZZS-20-106-A6，質量分數為97%)、豆甾-7-烯醇(批號3632-091A4，質量分數為97.5%)，均購于上海甄準生物科技有限公司；甲醇、乙腈均為色譜純(Fisher Chemical公司)；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結果

2.1色譜條件 采用SHIMADZU Shim-pack GIST C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；ELSD參數：載氣流速為1.6 L·min-1；漂移管溫度：70 ℃；噴霧器溫度：30 ℃；流動相為甲醇-水(98∶2)；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：50 μL。

2.2溶液的制備

2.2.1對照品溶液 精密稱取α-菠甾醇對照品適量，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解，定容，制成質量濃度為0.215 mg·mL-1的α-菠甾醇對照品溶液；精密稱取豆甾-7-烯醇對照品適量，置于50 mL量瓶中，加甲醇制成質量濃度為0.174 mg·mL-1的豆甾-7-烯醇對照品溶液。置于冰箱內冷藏。

2.2.2供試品溶液 精密稱取銀柴胡粉末(過3號篩)6.0 g，置于100 mL錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，搖勻，稱定質量，超聲(功率250 W，頻率20 kHz)處理40 min，取出，放冷至室溫，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，過濾，濾液用0.45 μm濾膜濾過，即得。

2.3系統適用性及專屬性考察 分別精密吸取2.2項下制備的對照品溶液、供試品溶液和空白溶劑(甲醇)各50 μL，依照2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，見圖1。由圖1可知，供試品色譜圖中出現與對照品保留時間一致的色譜峰，2種成分峰的理論塔板數均不低于2 000，分離度均大于1.5，陰性對照無對應色譜峰，說明陰性對照對2種成分的測定無干擾，所建立的色譜條件專屬性良好。

圖1 HPLC-ELSD圖

2.4線性關系考察 精密吸取2.2項下制備的α-菠甾醇對照品溶液適量，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別制成質量濃度為10.77、17.23、21.54、32.32、38.78、43.09 μg·mL-1的α-菠甾醇系列對照品溶液。另精密吸取2.2項下制備的豆甾-7-烯醇對照品溶液適量，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成質量濃度分別為8.7、23.2、34.8、46.4、58.0、69.6、81.2 μg·mL-1的豆甾-7-烯醇系列對照品溶液。精密吸取上述不同質量濃度的對照品溶液各50 μL，按照2.1項下色譜條件進樣檢測，記錄峰面積。分別以各對照品峰面積對數值為縱坐標(y)、進樣量對數值為橫坐標(x)，繪制標準曲線，結果2種成分回歸方程分別為y1=1.595 2x1+4.719 2(r1=0.998 3)，y2=1.488 3x2+4.801 6(r2=0.999 5)，質量濃度分別在10.77～43.09、8.70～81.20 μg·mL-1范圍內線性關系良好。

2.5檢測限和定量限考察 精密量取2.2項下制備的α-菠甾醇對照品溶液適量，加甲醇逐級稀釋，分別以信噪比為2.25∶1與12.34∶1計算檢測限和定量限，確定α-菠甾醇的檢測限為0.107 5 μg，定量限為0.430 0 μg。按照2.2項下方法制備豆甾-7-烯醇對照品溶液(質量濃度為174 μg·mL-1)適量，分別以信噪比為5.35∶1、20.56∶1計算檢測限和定量限，測得豆甾-7-烯醇的檢測限為0.017 4 μg，定量限為0.087 0 μg。

“24以上、40歲以下的軍人，給我站出來！”馬國平凝視著在山坳里集合起來的連隊，突然大吼一聲，如同平地驚雷。

2.6精密度實驗 精密吸取2.2.2項下制備的同一供試品溶液(內蒙)，按照2.1項下色譜條件連續進樣6次，分別測定2種成分的峰面積，記錄色譜圖，計算RSD值。結果2種成分峰面積的RSD值分別為2.43%、2.16%，表明儀器精密度良好。

2.7重復性實驗 取銀柴胡藥材粉末6份(內蒙)，按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，按照2.1項下色譜條件分別測定2種成分的峰面積，計算含量。結果2種成分的平均含量(n=6)分別為0.017%、0.048%，RSD值分別為2.74%、2.54%，表明該方法重復性良好。

2.8穩定性實驗 取2.2.2項下制備的同一供試品溶液(內蒙)，分別在0、2、4、6 h進樣50 μL，分別測定2種成分的峰面積，計算RSD值。結果2種成分的RSD值分別為2.89%、2.04%，表明供試品溶液在6 h內穩定性良好。

2.9回收率實驗 精密稱取含量已知的銀柴胡樣品粉末6份，置于具塞錐形瓶內，按照1∶1的比例分別加入2.2.1項下制得的α-菠甾醇對照品溶液1.5 mL和豆甾-7-烯醇對照品溶液5.5 mL，按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，依照2.1項下色譜條件進樣。分別測定2種成分的含量，計算其平均回收率，結果見表1。由表1可知，2種成分的平均回收率分別為104.04%、96.50%，符合《中國藥典》2020年版規定，且RSD值均小于3%，表明該方法準確性良好。

表1 2個甾醇類成分的回收率實驗結果 (n=6)

2.10樣品測定 按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，按照2.1項下色譜條件對10個不同批次的銀柴胡藥材中α-菠甾醇和豆甾-7-烯醇的含量進行測定，結果見表2。

表2 銀柴胡的含量測定結果

3 討論

3.1指標性成分的選擇 銀柴胡臨床上主治疳積發熱、骨蒸潮熱等癥[16]，含有甾醇類、環肽類、黃酮類等多種化學成分，其中甾醇類成分中的α-菠甾醇和豆甾-7-烯醇具有抗炎、解熱作用，是銀柴胡除虛熱的主要活性成分，因此選擇這2個成分作為指標性成分建立含量測定方法。

3.2檢測器的選擇α-菠甾醇和豆甾-7-烯醇為紫外末端吸收，無法使用紫外檢測器進行含量測定。參考相關文獻[17-19]，建立銀柴胡中甾醇類活性成分的定量分析方法，同時對檢測器漂移管溫度、噴霧器溫度、載氣流速等進行考察，結果表明，該方法簡便、靈敏、重復性好、準確度高。

3.3流速的選擇 對色譜條件流動相的流速進行考察，流速分別設定為0.8、1.0、1.2 mL·min-1，取供試品溶液，分別按照上述不同流速下的色譜條件進樣檢測。流速為0.8 mL·min-1時，30 min內樣品未出峰；流速為1.2 mL·min-1時，2種成分均未達到良好的分離效果；流速為1.0 mL·min-1時，在30 min內樣品出峰，且2種成分分離效果較好。因此流速選擇1.0 mL·min-1。

3.4提取溶劑的選擇 根據2種成分的性質，選擇甲醇、乙醇、氯仿等溶劑進行提取[20]，超聲提取40 min后，放冷，濾過，作為供試品溶液，對其進行含量測定，其中甲醇與氯仿中2種成分的含量較高，提取效果較好，考慮到甲醇毒性小，對環境和人體健康影響小，成本低，最終確定甲醇作為提取溶劑。

3.5提取時間的選擇 使用甲醇作為提取溶劑，采用超聲處理，分別提取20、30、40、50 min，對銀柴胡2種成分的含量進行考察，結果提取時間為40 min時2種成分的含量較高，超聲處理40 min后含量變化不大，因此制備供試品選擇超聲處理40 min。

本研究采用HPLC-ELSD法建立了銀柴胡藥材中甾醇類成分α-菠甾醇和豆甾-7-烯醇的含量測定方法，為銀柴胡藥材的質量控制提供了簡便、高效的方法，為提升銀柴胡藥材的質量標準提供參考。