雷帕霉素對S180肉瘤細胞及CD90、CD133、Notch1蛋白表達的影響

孔 萍，王康嶸，張 靜

(1.宜昌市夷陵醫院藥劑科，宜昌 443100；2.武漢市普仁醫院耳鼻喉口腔頭頸外科，武漢 430081)

惡性腫瘤是目前導致居民死亡的主要原因之一[1]。近年研究發現，抗原分化簇90(CD90)參與腫瘤細胞增殖、轉移、凋亡等過程，可在各種正常組織或細胞中表達并與腫瘤預后密切相關[2]。腫瘤干細胞(CSCs)的存在是腫瘤逆轉和恢復的主要原因之一。抗原分化簇133(CD133)為CSCs標志物，Notch為調控CSCs的經典信號通路。研究表明，CD133和Notch1具有致瘤性，且與CSCs腫瘤的發生、轉移和耐藥有關[3-4]。研究證實，細胞自噬具有促進腫瘤細胞發生和發展的作用，通過抑制細胞自噬可達到抗腫瘤作用[5]。雷帕霉素靶蛋白(mTOR)為細胞自噬的重要調控途徑。雷帕霉素是目前臨床常用的mTOR受體抑制劑，可通過抑制mTOR活化，促進細胞自噬[6]。本研究觀察了雷帕霉素對S180肉瘤細胞和小鼠S180肉瘤模型的抑瘤作用，以及對腫瘤組織CD90、CD133和Notch1蛋白表達的影響，旨在進一步探討雷帕霉素的抗腫瘤作用機制，為臨床抗腫瘤治療提供參考。

1 儀器與材料

1.1儀器 Multiskan FC型酶標儀和Attune NxT型流式細胞儀，均購自美國賽默飛世爾公司。

1.2材料 小鼠S180肉瘤細胞，上海江林生物科技有限公司；雷帕霉素(批號822178)，北京華邁科生物技術有限責任公司；DMEM完全培養基(批號31600)、磷酸鹽緩沖液(PBS，批號P1022)、胰蛋白酶(批號T1320)、CCK-8試劑盒(批號CA1210)、抗熒光衰減封片劑(批號S2100)、HRP標記二抗(批號SE064)、DAB顯色試劑盒(批號DA1015)，均購自北京索萊寶科技有限公司；細胞周期檢測試劑盒(批號340242)、細胞凋亡檢測試劑盒(批號556507)，均購自美國BD公司；冷凍包埋劑(批號6506)、熒光二抗(批號A-11034)，均購自美國賽默飛世爾公司；CD90多克隆抗體(批號ABP56393)、CD133多克隆抗體(批號ABP52923)、Notch1多克隆抗體(批號PAB19810)、β-actin多克隆抗體(批號ABP50593)，購自武漢艾美捷科技有限公司。

1.3動物 KM小鼠(批號CS-003)，雄性，40只，6～8周齡，體質量為(20.13±1.78) g，均購自遼寧長生生物技術股份有限公司，實驗動物許可證號SCXK(遼)20200002。

2 方法

2.1體外實驗

2.1.1細胞培養與分組 在液氮中取出凍存細胞，置于37 ℃水浴鍋中融化，移至15 mL離心管中，加入預熱的DMEM完全培養基10 mL，以2 000 r·min-1離心2 min，棄上清液；以DMEM完全培養基10 mL清洗，棄上清液；再次加入DMEM完全培養基10 mL，接種于培養板中，置于37 ℃、體積分數為5%的CO2培養箱中培養，待細胞融合度達80%～90%時，棄去培養基；以PBS清洗2次，加入胰蛋白酶3 mL消化，3 min后以DMEM完全培養基終止反應，移至15 mL離心管中，以2 000 r·min-1離心2 min，棄上清液；加入PBS 10 mL，吹勻后細胞以1×105個·孔-1接種于96孔板中，孵育過夜，雷帕霉素低、中、高劑量組分別加入20、50、100 nmol·L-1的雷帕霉素；對照組加入等量培養液，每組設置5個復孔；空白組僅加入等量培養液。

2.1.2細胞增殖 采用CCK-8法檢測細胞增殖。雷帕霉素分別作用24、48、72 h后，每孔加入CCK-8試劑10 μL，37 ℃避光孵育3 h；用酶標儀在450 nm波長處測定吸光度值A，實驗重復3次，取平均值，細胞增殖抑制率(%)=[1-(A給藥組-A對照組)÷(A對照組-A空白組)]×100%。

2.1.3細胞周期與凋亡 采用流式細胞術法檢測細胞周期與凋亡。雷帕霉素作用48 h后，在4 ℃條件下，以3 000 r·min-1離心5 min，棄上清液；加入預冷的PBS洗滌2次，以100 μL結合PBS重懸細胞；分別按照細胞周期檢測試劑盒和細胞凋亡檢測試劑盒說明書操作，利用流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡，實驗重復3次，取平均值。

2.2體內實驗

2.2.1模型構建與分組 將S180肉瘤細胞以1×106個·mL-1接種于小鼠左前肢腋下皮下，24 h后隨機將小鼠分為對照組以及雷帕霉素低、中和高劑量組；定期測量小鼠體質量和腫瘤長徑(a)、短徑(b)，計算腫瘤體積V(mm3)，V=ab2÷2，當V≥100 mm3時，按照人體臨床用量的0.5、1.0、2.0倍換算小鼠用量，雷帕霉素低、中和高劑量組小鼠分別以1、2、4 mg·kg-1雷帕霉素灌胃，對照組以等量生理鹽水灌胃，每日1次，共3周。

2.2.2皮下成瘤實驗 末次灌胃后24 h，測定小鼠體質量，以CO2吸入麻醉，剝取腫瘤稱定質量，記錄瘤質量并計算抑瘤率，抑瘤率(%)=(對照組瘤質量-給藥組瘤質量)÷對照組瘤質量×100%。

2.2.3腫瘤組織CD90、CD133和Notch1蛋白表達 取腫瘤組織，一部分保存于-70 ℃冰箱內，用于免疫熒光染色；另一部分固定于甲醛中，用于免疫組織化學染色。(1)免疫熒光染色：取組織，用冷凍包埋劑包埋后，用切片機制備成厚8 μm的連續切片；4 ℃下丙酮固定10～20 min，用PBS沖洗3次，每次5 min；滴加正常羊血清，37 ℃反應30 min；棄去多余血清，滴加一抗，4 ℃過夜；用PBS沖洗3次，每次5 min；滴加熒光素標記二抗，37 ℃避光孵育60 min；PBS沖洗3次，每次5 min；以抗熒光衰減封片劑封片，400倍熒光顯微鏡觀察并拍照；CD90、CD133和Notch1蛋白陽性信號為細胞膜或細胞漿出現綠光顆粒、細胞核出現藍光顆粒；計算染色強度，染色強度越大提示蛋白表達越強。(2)免疫組織化學染色：取組織，依次進行常規脫水、透明、浸蠟處理后，以石蠟包埋，用切片機制備成厚4 μm的連續切片；烤片60 min，依次進行脫蠟、水化，加入過氧化氫溶液滅活；PBS沖洗3次，每次5 min；滴加抗原修復液，沸水浴中煮沸15 min，自然冷卻至室溫；PBS沖洗3次，每次5 min；滴加一抗，4 ℃過夜；PBS沖洗3次，每次5 min，滴加HRP標記二抗，37 ℃孵育60 min；PBS沖洗3次，每次5 min，滴加DAB顯色劑，3 min后用自來水沖洗，蘇木素復染3 min，分化液反應30 s，反藍后用自來水沖洗；常規脫水、透明處理后，以中性樹膠封片，400倍顯微鏡下觀察并拍照；CD90、CD133和Notch1蛋白陽性信號為細胞膜或細胞漿出現棕黃色或棕褐色顆粒，計算灰度值，灰度值越高提示蛋白表達越弱。

3 結果

3.1雷帕霉素對S180肉瘤細胞增殖的影響 見表1。由表1可知，與對照組比較，雷帕霉素低、中和高劑量組作用S180肉瘤細胞后，細胞增殖抑制率顯著升高(P<0.05)，且與作用時間呈正相關；同一作用時間，細胞增殖抑制率隨雷帕霉素濃度的增加而升高(P<0.05)。

表1 不同濃度雷帕霉素對S180肉瘤細胞各時間點細胞增殖抑制率的影響

3.2雷帕霉素對S180肉瘤細胞周期的影響 見表2。由表2可知，與對照組比較，雷帕霉素低、中和高劑量組作用S180肉瘤細胞48 h后，細胞周期阻滯明顯(P<0.05)，主要阻滯于G0/G1期。

表2 不同濃度雷帕霉素對S180肉瘤細胞各細胞周期抑制率的影響

3.3雷帕霉素對S180肉瘤細胞凋亡的影響 見圖1和表3。由圖1和表3可知，與對照組比較，雷帕霉素低、中和高劑量組作用S180肉瘤細胞48 h后，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，呈濃度依賴性。

圖1 不同濃度雷帕霉素作用于S180肉瘤細胞的凋亡情況

表3 不同濃度雷帕霉素對S180肉瘤細胞凋亡率的影響

3.4雷帕霉素對S180肉瘤小鼠的抑瘤作用 見表4。由表4可知，實驗前后，各組小鼠體質量比較，差異無統計學意義(P>0.05)；與對照組比較，雷帕霉素低、中和高劑量組小鼠瘤質量顯著降低，抑瘤率顯著升高(P<0.05)；瘤質量隨雷帕霉素濃度的增加而降低，抑瘤率隨雷帕霉素濃度的增加而升高(P<0.05)。

表4 各組小鼠體質量、瘤質量和抑瘤率比較

3.5雷帕霉素對小鼠腫瘤組織CD90、CD133和Notch1蛋白表達的影響

3.5.1免疫熒光染色 見表5。由表5可知，與對照組比較，其他3組小鼠腫瘤組織CD90、CD133和Notch1蛋白表達顯著降低，隨雷帕霉素濃度增加而降低(P<0.05)。

表5 各組小鼠肉瘤組織CD90、CD133和Notch1蛋白免疫熒光染色結果比較

3.5.2免疫組織化學染色 見表6。由表6可知，與對照組比較，其他3組小鼠腫瘤組織CD90、CD133和Notch1蛋白表達顯著降低，隨雷帕霉素濃度增加而降低(P<0.01)。見表6。

表6 各組小鼠肉瘤組織CD90、CD133和Notch1蛋白免疫組化染色結果比較

4 討論

惡性腫瘤是嚴重威脅居民生命健康的公共衛生問題，其發生和發展與細胞自噬密切相關[7]。吳曉莉等[8]研究表明，自噬活性改變可導致正常細胞惡性轉化或促進腫瘤進展。mTOR為誘導細胞自噬和抑制腫瘤細胞增殖的重要途徑[9]。雷帕霉素為新型大環內酯類免疫抑制劑，主治器官移植術后抗排斥反應及自身免疫性疾病[10]。近年研究發現，雷帕霉素可與細胞內受體FKBP-12結合形成復合物，抑制mTOR活性和誘導細胞循環停滯在G1期[11]。宋魏等[12]研究發現，雷帕霉素可通過下調mTOR表達和mTOR磷酸化，降低mTOR信號通路活性，顯著抑制鼻咽癌腫瘤干細胞增殖，達到抗腫瘤作用。

肉瘤源于小鼠間葉組織惡性腫瘤，常見于纖維肉瘤、骨肉瘤、淋巴肉瘤等[13]。崔明星等[14]以不同濃度雷帕霉素(20、50、100 nmol·L-1)作用于人骨肉瘤MG-63細胞發現，作用3～5 d后細胞增殖能力顯著降低。另有研究發現，通過調控磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B/mTOR信號通路，可顯著抑制骨肉瘤細胞的增殖和遷移[15]。本研究使用的小鼠S180肉瘤細胞來源于白人女性骨肉瘤組織，不同濃度雷帕霉素(20、50、100 nmol·L-1)作用后發現，S180肉瘤細胞增殖抑制率顯著升高，且與作用時間呈正相關，符合以往研究結果[16]，同一作用時間，細胞增殖抑制率隨雷帕霉素濃度的增加而升高，提示隨著雷帕霉素濃度的增加，其抑制腫瘤細胞增殖能力可能越強。既往研究結果顯示，雷帕霉素可抑制高糖狀態下腎系膜細胞增殖，促進其凋亡并使細胞阻滯于G1/S期[17]。周倫歡等[18]研究發現，雷帕霉素可通過抑制mTOR通路活性，將細胞阻滯于G1/G0期，抑制伯基特淋巴瘤細胞株增殖和誘導細胞凋亡。本研究結果顯示，雷帕霉素作用S180肉瘤細胞48 h后，細胞周期阻滯明顯，且主要阻滯于G0/G1期，雷帕霉素促進細胞凋亡作用呈濃度依賴性，符合以往研究結果。以上體外實驗證實，雷帕霉素具有明顯的抗腫瘤作用，可能通過抑制細胞增殖，阻滯細胞周期于G1/G0期，促進細胞凋亡實現。Shen M H等[19]研究發現，雷帕霉素能顯著降低腫瘤負荷。本研究通過構建小鼠S180肉瘤皮下荷瘤模型發現，雷帕霉素可顯著降低小鼠瘤質量，且瘤質量隨雷帕霉素濃度的增加而降低，抑瘤率隨雷帕霉素濃度的增加而升高，符合以往研究結果，體內實驗進一步證實雷帕霉素具有明顯的抗腫瘤作用。CSCs是影響腫瘤形成、增殖、復發和轉移的重要因素。Hubo Shi等[20]研究發現，雷帕霉素誘導的腫瘤生長延遲可能與抑制腫瘤干細胞表型Notch1、CD133和CD90蛋白表達有關。本研究分別采用免疫熒光染色和免疫組織化學染色法檢測腫瘤組織Notch1、CD133和CD90表達，結果均顯示，雷帕霉素可顯著抑制小鼠腫瘤組織CD90、CD133和Notch1蛋白表達，且隨雷帕霉素濃度的增加而降低，符合以往研究結果。

綜上所述，雷帕霉素可能通過下調CD90、CD133和Notch1蛋白表達，影響S180肉瘤細胞的增殖和凋亡，達到體內外抑瘤作用。