乙型肝炎病毒核酸免提取熒光定量PCR方法應用價值分析

劉麗 營口經濟技術開發區中心醫院（營口市第六人民醫院） （遼寧 營口 115007）

內容提要： 目的：探討乙型肝炎病毒（HBV）核酸免提取熒光定量PCR方法應用價值。方法：選擇于2017年7月～2019年7月本院收治的乙型肝炎病毒感染患者145例作為資料，均取血清提取DNA，采用ELISA（酶聯免疫-吸附劑測定）法測定HBV血清標記物，采用熒光定量PCR檢測血清HBV-DNA，比較兩種方法檢測結果。結果：ELISA法測定結果為HBeAg（+）/HBeAg（-）94例、HBeAg（-）/HBeAg（+）42例、HBeAg（-）/HBeAg（-）9例，熒光定量PCR相對應陽性率分別為100.0%、64.29%、33.33%，不同HBV血清標記物的陽性率比較差異顯著，P＜0.05。結論：在乙型肝炎病毒核酸檢測中采用熒光定量PCR法可實現定量計數，準確反應核酸復制狀況，為診治提供可靠依據，保證治療合理性，應用價值較高。

乙型肝炎在我國較為多見，主要是由于乙型肝炎病毒引起的以肝臟病變為主的感染性疾病，可能導致出現乏力疲勞、食欲不振等癥狀，持續發展易引起多器官損害[1]。近年來我國乙型肝炎感染率逐漸增加，為實現對乙型肝炎的盡早發現，需重視實驗室對乙型感染病毒的檢測。常規多采用ELISA法測定HBV血清標記物進行診斷，但存在明顯局限性。而隨著科技進步，如今熒光定量PCR法受到重視，其具有特異性強、自動化程度高優勢，可直接呈現HBV復制過程[2]。為此，本次研究對乙型肝炎病毒核酸免提取熒光定量PCR方法應用價值進行了探討，分析如下。

1.資料與方法

1.1 臨床資料

選擇于2017年7月～2019年7月本院收治的乙型肝炎病毒感染患者145例作為資料，均知曉本次研究內容及目的，且自愿簽署知情同意書。其中男性78例，女性67例，年齡22～60歲，平均（40.17±3.74）歲。排除嚴重黃疸癥狀患者、凝血功能障礙患者等[3]。

1.2 方法

1.2.1 ELISA法。取空腹外周靜脈血5mL作為標本，離心處理10min，速度為3000r/min，分離上清血液，置入-20°C環境保存，采用ELISA法測定HBV血清標記物，北京萬泰生物藥業有限公司提供試劑盒，酶標儀型號為HBS1096B，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.2.2熒光定量PCR法。取待測血清樣本100μL，離心處理10min，1000r/min，分離上清血液加入100μlDNA提取液Ⅰ，混勻后離心處理10min，1000r/min，去除上清液，在沉淀物中加入25μlDNA提取液Ⅱ，混勻后沸水浴10min，離心處理10min，1000r/min，取上清液。在離心管中加重37.6μlPCR反應液，0.4μlTaq酶、0.06μL尿苷酶作為反應管，加入2mL處理樣本、對照品，對照品濃度梯度108copies/mL，107copies/mL，1076copies/mL，105copies/mL，104copies/mL，103copies/mL。完成后進行檢測，采用核酸擴增儀進行PCR擴增。設置激發光波長487rim，檢測波長525nm，探針在擴增區中間，條件為93°C預變形2s，94°C預變形5s，60°C預變形30s，40個循環。探針HB-Taq S，引物5'-ACATCAGGATTCCTAGGACC-3'（nt167-nt186）；探針HB-Taq AS，引物5'-GGTGAGTGATTGGAGGTTG-3'（nt339-nt321）；探針HB-TaqP，引物5'-FAM-CAGAGTCTAGACTC GTGGTGGTGGACTTC-3'（nt242-nt267）；探針HB-C-S，引物5'-CCTGCACCGAACATGGAGAG-3'（nt143-nt162）；探針HB-C-AS，引物5'-ATATGATAAACGCCGCAGACAC-3'（nt401-nt379）。

1.3 觀察指標

比較兩種方法的檢測結果。

1.4 統計學分析

采用統計學軟件SPSS20.0進行處理，計量資料以%表示，采用χ2檢驗，P＜0.05為比較差異有統計學意義。

2.結果

分析表1可知，ELISA法測定結果為HBeAg（+）/HBeAg（-）94例、HBeAg（-）/HBeAg（+）42例、HBeAg（-）/HBeAg（-）9例，熒光定量PCR相對應陽性率分別為100.0%、64.29%、33.33%，不同HBV血清標記物的陽性率比較差異顯著，P＜0.05。

表1 兩種方法的檢測結果分析

3.討論

根據臨床研究可知，肝炎主要致病因素為乙型肝炎病毒，其作為DNA病毒，對人體有易感性，可引發乙型病毒性感染，在我國較為多見，且呈現逐漸增長趨勢[4,5]。如今我國部分乙型肝炎患者形成持久免疫力，成為慢性感染患者，但大多數患者發展為肝硬化及肝癌，因此需重視對乙型肝炎的盡早檢出，有效治療，控制病情進展[6]。ELISA法屬于檢測乙型肝炎病毒的常見手段，可間接反應病毒的表達和復制。為進一步提高準確率，近年來臨床加強對熒光定量PCR法的應用，其可檢測血清學指標陰性的突變株DNA，彌補ELISA法檢測不足[7]。本次研究結果顯示ELISA法測定結果為HBeAg（+）/HBeAg（-）94例、HBeAg（-）/HBeAg（+）42例、HBeAg（-）/HBeAg（-）9例，熒光定量PCR相對應陽性率分別為100.0%、64.29%、33.33%，不同HBV血清標記物的陽性率比較差異顯著，P＜0.05，提示熒光定量PCR法可在陰性標本中檢測出感染病毒，并可實現對HBV-DNA復制定量計數，準確反應感染情況，應用價值較高。

綜上所述，乙型肝炎病毒核酸免提取熒光定量PCR方法應用可實現對病毒感染進展及抗病毒治療反應的判斷。