異化鐵還原菌介導的硝酸鹽還原亞鐵氧化過程

張相杰 陳國俊 李涵 李芳柏 劉同旭

摘 要：中性厭氧的富鐵環境中，微生物驅動硝酸鹽還原亞鐵氧化（NRFO）過程和異化鐵還原過程，然而異化鐵還原菌能否介導NRFO仍未知。選取異化鐵還原菌（Klebsiella pneumoniae L17、Shewanella oneidensis MR-1、Shewanella putrefaciens strain CN32）、亞鐵和硝酸鹽，構建厭氧NRFO體系。結果表明：亞鐵氧化、硝酸鹽還原同步發生，主要是因為硝酸鹽還原產物亞硝酸鹽可以直接氧化亞鐵;亞鐵抑制了硝酸鹽還原，且該抑制作用隨亞鐵濃度升高而增強;亞鐵對亞硝酸鹽的競爭性還原導致了銨根大量減少;亞鐵氧化生成的次生礦物沉淀在細胞表面，阻礙硝酸鹽進入細胞進行還原。在低濃度亞鐵條件下，亞鐵的毒害和氧化成礦作用抑制L17還原硝酸鹽;亞鐵氧化成礦作用是抑制CN32還原硝酸鹽的主要原因;而亞鐵的毒害是抑制MR-1還原硝酸鹽的主要原因。在高濃度亞鐵條件下，亞鐵氧化導致細胞結殼是抑制微生物硝酸鹽還原的主要原因。

關鍵詞：硝酸鹽還原亞鐵氧化;鐵還原微生物;亞鐵氧化成礦;細胞結殼

Abstract： Microbially-mediated nitrate-reducing Fe（Ⅱ） oxidation （NRFO）process and alienated iron reduction process are ubiquitous under neutral anaerobic iron-rich environments. However， it is still unknown whether NRFO can be mediated by dissimilatory iron reducing bacteria. In this study， anaerobic NRFO system is constructed by selecting dissimilatory iron-reducing bacteria（Klebsiella pneumoniae L17， Shewanella oneidensis MR-1， and Shewanella putrefaciens strain CN32）， ferrous and nitrate. The results show that nitrate reduction and Fe（Ⅱ） oxidation occurred simultaneously. The intermediate product nitrite during nitrate reduction is considered the dominant contributor to the overall Fe（Ⅱ） oxidation. The presence of Fe（Ⅱ） inhibited microbial nitrate reduction， and the inhibitory effect of Fe（Ⅱ） was more significant with the higher Fe（Ⅱ） concentration.Competitive reduction of nitrite by Fe（Ⅱ）resulted in the decrease of ammonium production. Fe（Ⅱ） oxidized secondary minerals precipitated on the cell surface，hindering nitrate from entering the cell for reduction. The toxicity and oxidation-mineralization of Fe（Ⅱ） inhibited nitrate reduction by L17 with low Fe（Ⅱ） concentration. Nitrate reduction by CN32 was inhibited by Fe（Ⅱ） oxidation-mineralization， while the inhibition of nitrate reduction by MR-1 was attributed to toxicity of Fe（Ⅱ）.Under high Fe（Ⅱ） concentration， microbial nitrate reduction was inhibited by cell encrustation.

Keywords： nitrate-reducing Fe（Ⅱ） oxidation; iron-reducing bacteria; Fe（Ⅱ） oxidation-mineralization; cell encrustation

鐵是地殼中第四豐富的元素，也是生物圈中最普遍存在的氧化還原活性金屬[1]。鐵長期以來被認為是生命所必須的，鐵氧化菌（FeOB）與鐵還原菌（FeRB）驅動了鐵的生物地球化學循環。鐵循環過程控制著土壤有機物礦化、甲烷排放、重金屬的吸附固定、反硝化等環境過程，是連接土壤養分循環與污染物轉化的紐帶，是推動物質循環與能量代謝的重要引擎[2-6]。氮是核苷酸和氨基酸的基本組成元素，是構成生命的基本元素，從根本上影響著大多數生態系統的結構和功能[7]。硝酸鹽作為氮循環網絡的關鍵節點，在自然界氮循環過程中起著至關重要的作用。在農業生產中，氮素的輸入至關重要，而微生物的反硝化作用會導致氮素的大量流失[8]。微生物通過反硝化過程、異化硝酸鹽還原成銨、厭氧氨氧化競爭性還原硝酸鹽[9]。硝酸鹽還原的產物N2O作為重要的溫室氣體，超過60%的排放來自農業土壤，而土壤中超過2/3的N2O排放可歸因于細菌和真菌生物與非生物反硝化過程共同作用的結果[10-11]。因此，微生物驅動的硝酸鹽還原過程對元素地球化學循環、農業生產、溫室氣體排放等方面具有重要意義。

在厭氧環境中，微生物通過生物與非生物作用耦合鐵氮循環普遍存在，是鐵、氮氧化還原反應中的重要過程[12]。1996年首次報道微生物介導的硝酸鹽還原亞鐵氧化過程（NRFO）[13]，在此后的二十多年里，人們證明了NRFO過程在土壤中、海洋、溫泉、地下水、深海、濕地沉積物和海底熱液噴口等環境中普遍存在[14-19];甚至在火星也可能存在潛在的NRFO過程[20]。在厭氧條件下，NRFO微生物將硝酸鹽作為電子受體，將Fe（Ⅱ）作為唯一或者輔助電子供體進行生命代謝活動，同時硝酸鹽還原的中間產物亞硝酸鹽通過化學反硝化作用氧化Fe（Ⅱ）[12， 21-22]。

由于中性厭氧環境微生物活動的復雜性、物質循環活動的廣泛性以及元素之間的耦合過程，單獨的微生物種群進行完全的反硝化過程不普遍，大量微生物種群只參與一個或者幾個NO-X還原反應，這些微生物通常缺乏將硝酸鹽還原為氮氣的完整途徑基因組[8， 23]。目前主要是通過NRFO微生物這種模式菌研究硝酸鹽還原亞鐵氧化過程，例如Pseudogulbenkiania sp. strain 2002、Acidovorax sp. strain BoFeN1[21， 24-26]。實際上，很多微生物具備將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，進而非生物氧化Fe（Ⅱ）的能力。因此，反硝化微生物（非模式菌）能夠驅動NRFO過程[27]。大量鐵還原微生物具有參與硝酸鹽還原過程的酶，并能夠進行硝酸鹽還原，鐵還原微生物是氮循環的重要參與者[28]。目前，研究者陸續從多種環境中分離出大量鐵還原微生物，如深海沉積物、銅礦、海底熱泉、森林沉積物和油田等環境，這些微生物能夠利用硝酸鹽作為電子受體進行硝酸鹽還原。

[29-33]。目前的研究表明，Fe（Ⅲ）和硝酸鹽能夠作為鐵還原微生物的電子受體進行競爭性還原，而且硝酸鹽的濃度影響微生物鐵還原速率[34-37]。然而，對于鐵還原微生物驅動的硝酸鹽還原亞鐵氧化過程需要進一步研究。

鐵還原微生物驅動NRFO過程中，亞硝酸鹽和亞鐵發生化學反硝化生成N2O排放到大氣中，并造成厭氧環境中的氮損耗。因此，鐵還原菌驅動的NRFO過程對于研究微觀尺度溫室氣體排放具有重要的意義[38-41]。以往對模式菌驅動NRFO過程的研究表明，亞鐵的存在促進了Acidovorax sp. BoFeN1硝酸鹽還原，但抑制了Pseudogulbenkiania sp. strain 2002硝酸鹽還原，不同微生物生成的次生礦物類型也存在差別，說明不同的NRFO微生物對亞鐵的響應不同[42]。因此，不同鐵還原微生物驅動的硝酸鹽還原亞鐵氧化過程反應動力學和礦物學有可能也存在明顯區別。不同鐵還原微生物硝酸鹽還原過程相關酶促反應不同。研究表明，Shewanella loihica strain PV-4硝酸鹽還原過程中，能夠通過亞硝酸鹽還原酶NirK將亞硝酸鹽還原為N2O，也能夠通過亞硝酸鹽異化還原成銨酶NrfA，將亞硝酸鹽還原為NH+4[43]。Shewanella putrefaciens MR-1硝酸鹽還原過程中，通過硝酸鹽還原酶Nap將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，然后通過亞硝酸鹽異化還原為銨酶NrfA將亞硝酸鹽還原為NH+4[44-45]。說明不同希瓦氏菌，其硝酸鹽代謝酶促反應途徑不同，有可能導致硝酸鹽還原亞鐵氧化動力學和礦物學的區別。

筆者選取發酵型和呼吸型兩種鐵還原菌作為模式菌株，研究其驅動NRFO過程。設置不同鐵還原微生物驅動NRFO過程的對照實驗，對反應物和生成物反應動力學進行分析，對不同處理組的次生礦物進行對比，研究目的包括：探究不同類型鐵還原菌、硝酸鹽還原菌的NRFO過程動力學和礦物學差異，揭示鐵還原菌驅動的NRFO過程的反應機制和影響因素。該研究可拓展NRFO過程的微生物范疇，揭示厭氧環境微生物驅動的NRFO過程中的微生物功能與貢獻。

1 實驗

1.1 實驗材料

實驗采用的微生物為發酵型兼性厭氧鐵還原菌Klebsiella pneumoniae L17[46]、呼吸型兼性厭氧鐵還原菌Shewanella oneidensis MR-1[47]，來自海洋微生物菌種保藏管理中心（Marine Culture Collection of China， MCCC）;呼吸型兼性厭氧鐵還原菌Shewanella putrefaciens strain CN32[48]，來自廣東省微生物菌種保藏中心（Guangdong Microbial Culture Collection Center， GDMCC）。好氧培養基成分為NaCl 5 g/L、牛肉浸膏5 g/L、蛋白胨10 g/L，pH值調至7.0，并對培養基進行高溫高壓滅菌處理。將-80 ℃冰箱中保存的微生物（1 mL）取出解凍后，在超凈工作臺倒入好氧培養基中，在恒溫震蕩培養箱中活化培養14 h （30 ℃，180 r/min），然后放置在超凈工作臺，取1 mL菌液轉接到好氧培養基中，在恒溫震蕩培養箱中繼續培養14 h （30 ℃，180 r/min）。對100 mL西林瓶、純水用100% N2充氣30 min排氧，并高溫高壓滅菌，然后在厭氧工作站中配制亞鐵母液（FeSO4 1 mol/L），用橡膠塞壓緊并用鋁蓋進一步密封，平衡24 h后，用0.22 μm濾頭過濾并進行避光保存。配制葡萄糖母液（1 mol/L）、乳酸鹽母液（1 mol/L），并用0.22 μm濾頭過濾，然后用100% N2充氣30 min排氧。微量元素儲備液SL14和維生素儲備液V10的具體配方參考文獻[49]，用0.22 μm濾頭過濾之后，再用100% N2充氣30 min排氧。配制30 mmol/L的哌嗪-1，4-二乙磺酸（PIPES）作為洗菌和實驗體系的緩沖液（pH=7.0）。

1.2 實驗方案及測試方法

1.2.1 實驗方案 在體系厭氧培養實驗前，對要用到的所有的容器耗材和溶液進行高溫高壓滅菌。在超凈工作臺上取微生物懸液，經8 000 r/min于4 ℃離心8 min后，用30 mmol/L PIPES（pH=7.0）緩沖液洗滌重懸浮，重復3次后，配成菌懸液（OD600=1.0），在超凈工作臺上用100% N2充氣30 min，排氧，用橡膠塞壓緊并迅速用鋁蓋密封待用。30 mmol/L PIPES、5 mmol/L NaNO3分裝于100 mL西林瓶中，100% N2充氣30 min，排氧后進行高溫高壓滅菌，冷卻至室溫后轉移到厭氧工作站中，根據不同處理組（處理組見表1）配制反應體系，反應體系溶液總體積為80 mL，包括：4 mL已制備的菌懸液、5 mmol/L NO-3、10 mmol/L碳源、微量元素10 mL/L、維生素10 mL/L、5 mmol/L （1 mmol/L）FeSO4、30 mmol/L PIPES。反應體系在生化培養箱中（30±0.5 ℃） 避光靜置培養，每隔一段時間進行取樣，并測定反應物、生成物濃度。

1.2.2 測試分析方法

實驗采取連續性取樣，每次取樣1.5 mL，迅速進行Fe（Ⅱ）的測定。采用鄰菲羅啉顯色法進行亞鐵的測定，使用酶標儀測定在波長510 nm處吸光值。然后將樣品充氧氣15 min，充分氧化樣品中的Fe（Ⅱ），用0.22 μm濾頭過濾保存于-20 ℃。取樣完成后，用配備離子色譜柱（IonPacAS14A 4×250 mm）的離子色譜儀（Dionex ICS-90）測定其中的NO-3、NO-2濃度，采用連續流動分析儀測定NH+4。使用X射線衍射儀（D2 phaser）（Co靶、衍射角10°～80°、掃描速度0.2 （°）/min）測定生成礦物晶體結構，使用掃描電子顯微鏡觀察微生物和礦物形貌。

2 實驗結果與討論

2.1 硝酸鹽還原動力學

不同亞鐵濃度條件下，3種異化鐵還原菌的硝酸鹽還原動力學曲線見圖1，3種異化鐵還原菌的硝酸鹽還原準一級速率常數見表2。結果表明，不加亞鐵情況下，L17和CN32體系的硝酸鹽在1.6 d時被完全還原，硝酸鹽還原的準一級速率常數分別為1.772、1.672/d（表2），說明L17和CN32的硝酸還原能力接近。MR-1體系與L17和CN32不同，在0～16 h硝酸鹽迅速還原，在16～64 h硝酸鹽還原速率變慢，在第3天，硝酸鹽被完全還原。硝酸鹽還原準一級速率常數0.674/d，顯著低于L17和CN32。分別在體系中添加1、5 mmol/L亞鐵，結果顯示，硝酸鹽的還原均受到顯著抑制。亞鐵為1 mmol/L條件下，微生物硝酸鹽還原速率明顯高于高濃度亞鐵條件，反應在第7天已達到穩定，L17菌在第7天將硝酸鹽完全還原;CN32體系的硝酸鹽在第4天基本被還原;說明低濃度亞鐵抑制了L17、CN-32硝酸鹽還原速率，但硝酸鹽最終能被完全還原。在MR-1體系，初始階段硝酸鹽還原速率較快，之后迅速達到平衡，硝酸鹽被還原30%，說明低濃度亞鐵顯著的抑制了MR-1硝酸鹽還原過程。綜上所述，在低濃度亞鐵條件下，微生物硝酸鹽還原速率為CN32（0.563/d）>L17 （0.179/d）>MR-1 （0.034/d）。在高濃度5 mmol/L亞鐵條件下，L17處理組僅僅有0.7 mmol/L硝酸鹽被還原，CN32處理組在反應12 d后，1 mmol/L硝酸鹽被還原，MR-1處理組在反應12 d后，1.6 mmol/L硝酸鹽被還原，其準一級速率常數分別為0.010/d、0.014/d、0.010/d，顯著低于1 mmol/L亞鐵處理以及不加亞鐵的處理。3種菌在高濃度亞鐵條件下，反應前期少量的硝酸鹽被還原，之后硝酸鹽還原過程停滯，表明了高濃度亞鐵對微生物硝酸鹽還原具有顯著的抑制作用。綜上所述，亞鐵的添加抑制了微生物硝酸鹽還原過程，而隨著亞鐵濃度的升高，對微生物還原硝酸鹽的抑制作用增強，亞鐵對不同類型鐵還原微生物硝酸鹽還原的抑制程度存在差異。

2.2 亞硝酸鹽和銨根生成動力學

實驗選取的鐵還原微生物硝酸鹽代謝途徑存在差異，亞硝酸鹽是鐵還原微生物還原硝酸鹽的次級產物。L17不僅能將硝酸鹽還原為N2O和NO，也能夠還原為NH+4[30]。CN32還原硝酸鹽的產物為N2O和NO，MR-1還原硝酸鹽的產物為NH+4[45]。亞硝酸鹽、銨根的生成動力學結果如圖2所示。對于生物處理組cell+NO-3，L17在第1.5天的亞硝酸鹽積累達到4.8 mmol/L，隨后被持續還原，在第12天亞硝酸鹽剩余1.7 mmol/L。銨根作為L17還原亞硝酸鹽的產物，在第0～5天生成速率較慢，在第12天積累量為1.4 mmol/L。對于cell+NO-3+ Fe2+處理組，加入1 mmol/L亞鐵后，亞硝酸鹽持續生成并在第7天積累量為4 mmol/L。添加5 mmol/L亞鐵條件下，亞硝酸鹽在第2.6天積累量達到最大0.74 mmol/L;亞鐵的添加抑制了銨根的生成，在1 mmol/L亞鐵條件下銨根的最高生成量僅僅0.09 mmol/L，而5 mmol/L亞鐵條件下未發現銨根的生成。圖2（b）結果表明，CN32生物處理組在反應第2天亞硝酸鹽生成量達到最高，之后還原速率減慢，亞硝酸鹽在第12天僅僅被還原9.8%，說明CN32硝酸鹽還原速率顯著高于亞硝酸鹽還原速率。低濃度亞鐵條件下，CN32亞硝酸鹽在第4天生成量達到最高4.6 mmol/L，之后亞硝酸鹽被持續還原。而高濃度亞鐵濃度顯著的抑制了CN32亞硝酸鹽的生成，其亞硝酸鹽最高生成量為0.91 mmol/L。CN32處理組未發現銨根的生成。圖2（c）結果表明，MR-1迅速還原硝酸鹽，導致了亞硝酸鹽大量積累，在16 h亞硝酸鹽積累量達到3.98 mmol/L，之后被持續還原。研究表明，亞硝酸鹽的添加抑制了MR-1的生長，證明亞硝酸鹽對MR-1代謝活動的抑制作用[44]。因此，高濃度的亞硝酸鹽積累抑制了MR-1的硝酸鹽還原過程。銨根在第12天積累量達到3.97 mmol/L，表明亞硝酸鹽基本上被異化還原為銨。而含有亞鐵的處理組中，亞硝酸鹽的積累量為1 mmol/L左右。在低濃度亞鐵條件下，銨根的最大生成量為0.23 mmol/L;而在高濃度亞鐵條件下，沒有發現銨根的生成，說明亞鐵顯著抑制了亞硝酸鹽異化還原為銨。上述結果表明，3種微生物處理組中，亞鐵的添加減少了亞硝酸的積累，一方面是因為亞鐵抑制了微生物硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，另一方面是因為亞鐵與亞硝酸鹽化學反硝化作用消耗了一部分亞硝酸鹽[38， 42， 50]。亞鐵抑制了L17和MR-1銨根的生成，隨著亞鐵濃度的升高，微生物硝酸鹽異化還原為銨越少，原因是NRFO過程中，亞硝酸鹽一方面被微生物還原，另一方面被亞鐵化學反硝化過程還原。相比于亞硝酸鹽的生物還原過程，亞硝酸鹽和亞鐵之間化學反應相對較快[51]。這導致了亞鐵添加條件下銨根生成量遠遠小于生物處理組銨根生成量。

2.3 亞鐵氧化動力學

亞鐵氧化動力學如圖3所示。在未添加硝酸鹽的條件下，L17、CN32和MR-1均不能生物氧化亞鐵;而加入硝酸鹽后，在1、5 mmol/L Fe2+的體系中均發生了氧化，在厭氧無催化劑存在的條件下，亞鐵和硝酸鹽不能直接發生化學反應[31， 51]。說明鐵還原條件下的亞鐵氧化是由硝酸鹽還原導致的。對于1 mmol/L Fe2+，在L17體系中，亞鐵在第4天接近完全氧化; CN32體系亞鐵完全氧化耗時6 d;MR-1體系中，直到第7天亞鐵僅氧化14.4%。其準一級速率常數分別為L17 （0.066/d）、CN32 （0.051/d）、MR-1 （0.034/d） （表2）。在5 mmol/L Fe2+條件下，第12天L17、CN32、MR-1體系中分別有57.1%、51.4%、34.1%的亞鐵發生氧化，其準一級速率常數分別為L17 （0.066/d）、CN32 （0.051/d）、MR-1 （0.034/d）。上述結果表明，3種鐵還原菌的亞鐵氧化速率為L17>CN32>MR-1，亞鐵氧化速率不同的原因是，不同微生物的硝酸鹽還原速率的差異以及代謝途徑的不同。在L17和CN32體系中，高濃度亞鐵不完全氧化，但低濃度亞鐵可以完全氧化;MR-1在不同的亞鐵濃度下均表現為亞鐵的不完全氧化。

2.4 次生礦物表征

亞硝酸鹽與亞鐵化學反硝化作用生成的次生礦物分為3部分，一部分沉淀于細胞周圍環境（綠色箭頭所示），一部分粘附在細胞表面但結合并不緊密（藍色箭頭所示）;一部分沉淀生成在細胞表面或者外膜，形成細胞結殼（紅色箭頭所示）。如圖4所示。

在Fe2+濃度為5 mmol/L的條件下，次生礦物大量附著在細胞表面，3種微生物均發生了明顯的細胞結殼，導致在高濃度亞鐵條件下硝酸鹽還原速率遠遠低于低濃度亞鐵濃度。在Fe2+濃度為1 mmol/L條件下，如圖5所示。

L17和CN32亞鐵氧化生成鐵氧化物并沉淀在細胞表面，會阻礙硝酸鹽進入細胞周質進行還原。然而，大部分微生物沒有結殼，所以，在反應后期，硝酸鹽仍然能被完全還原;而且L17細胞表面沉淀的次生礦物明顯多于CN32，導致L17硝酸鹽還原速率明顯低于CN32。低濃度亞鐵條件下，MR-1處理組亞鐵幾乎沒有被氧化，所以，未收集到次生礦物，這可能是因為亞鐵的添加導致了細胞活性降低，從而抑制了硝酸鹽還原過程。同時，對次生礦物類型進行了XRD表征，如圖6所示，結果表明，在高濃度亞鐵條件下，3種鐵還原微生物處理組生成的結晶態礦物主要為針鐵礦。亞鐵與亞硝酸鹽化學反應生成的鐵氧化物主要為針鐵礦和纖鐵礦[50]。在低濃度亞鐵條件下，生成的鐵氧化物除了針鐵礦之外，還生成了結晶度較差的水鐵礦，說明亞鐵氧化成礦的結晶度與亞鐵濃度正相關。

綜上所述，亞鐵氧化成礦并附著在細胞表面，能影響微生物硝酸鹽還原。隨著亞鐵濃度的提高，細胞結殼逐漸增加，次生礦物結晶度提高，阻礙硝酸鹽進入細胞周質進行還原，導致了硝酸鹽還原速率明顯降低甚至完全停滯，從而抑制了微生物的代謝活動[52]。

2.5 反應機制與環境意義

大量的異化鐵還原菌具有還原硝酸鹽的功能[31， 34， 43， 53-55]。在厭氧富鐵環境中，微生物還原硝酸鹽的中間產物NO-2一方面與亞鐵發生化學反硝化，另一方面亞硝酸鹽被微生物還原，亞硝酸鹽還原產物為NO和N2O，亞鐵氧化形成鐵氧化物并沉淀在細胞表面[36， 56]。然而，微生物不能將亞鐵作為電子供體進行氧化。不同異化鐵還原菌介導的硝酸鹽還原-亞鐵氧化過程機制存在差異，由動力學結果和礦物學表征的結果分析得到3種異化鐵還原菌的反應機制，如圖7所示。L17菌介導的硝酸鹽還原亞鐵氧化過程機制如圖7（a）所示，硝酸鹽進入細胞周質被硝酸鹽還原酶（Nap）還原為亞硝酸鹽，亞硝酸鹽有3種代謝途徑，一方面能夠被亞硝酸鹽還原酶（NirK和NrfA）還原為N2O和NH+4，另一方面被亞鐵化學還原。CN32菌介導的硝酸鹽還原亞鐵氧化過程機制如圖7（b）所示，硝酸鹽進入細胞周質被硝酸鹽還原酶（Nap）還原為亞硝酸鹽，亞硝酸鹽有兩種代謝途徑，一方面能夠被亞硝酸鹽還原酶（NirK）還原，另一方面被亞鐵化學還原。MR-1菌介導的硝酸鹽還原亞鐵氧化過程機制如圖7（c）所示，硝酸鹽進入細胞周質被硝酸鹽還原酶（Nap）還原為亞硝酸鹽，亞硝酸鹽通過生物與非生物共同作用被還原，微生物還原亞硝酸鹽（NrfA途徑）的產物只有NH+4，另一方面亞硝酸鹽被化學還原為N2O。亞鐵氧化生成鐵氧化物，鐵氧化物能夠被鐵還原菌還原。以往研究表明，即使是較小濃度亞鐵也會抑制微生物的NO-X還原[36]。所以，鐵還原菌硝酸鹽還原途徑和對亞鐵毒害響應的差異，導致了硝酸鹽還原和亞鐵氧化速率的明顯差異。亞鐵競爭性還原亞硝酸鹽抑制了NH+4的生成，促進了N2O的生成。亞鐵氧化形成的鐵氧化物沉淀在細胞表面，阻礙了硝酸鹽進入細胞被還原，抑制了微生物硝酸鹽還原過程，亞硝酸鹽生成的減少進一步影響了亞鐵氧化速率。隨著亞鐵濃度的提高，亞鐵氧化速率升高并導致細胞結殼，硝酸鹽無法進入細胞被還原，導致硝酸鹽還原亞鐵氧化過程停滯。亞鐵氧化主要生成的是針鐵礦，隨著亞鐵濃度的提高，鐵礦的結晶度也越高。

鐵還原菌還原鐵主要通過3種途徑：鐵還原菌與鐵氧化物直接接觸;細胞分泌胞外螯合物提高鐵礦物溶解性，促進鐵還原過程;細胞分泌或者利用周圍環境的電子穿梭體，通過胞外電子傳遞過程進行鐵還原[57]。鐵還原菌介導的Fe-N循環已有報道，鐵氧化物作為電子受體被微生物還原為亞鐵，亞鐵被亞硝酸鹽化學氧化，生成的鐵氧化物仍然能夠作為鐵還原菌的電子受體被還原，實現鐵的氧化還原循環。對于亞硝酸鹽來說，一方面被亞鐵化學還原，另一方面能夠作為微生物的電子受體，被生物還原[58-59]。說明鐵還原菌介導的鐵氧化還原循環和硝酸鹽的持續還原理論上可行。但研究當中沒有發現明顯的鐵還原過程，其主要原因可能是：1）細胞結殼一方面限制微生物的運動、生長和營養物的攝入，導致微生物鐵還原相關酶活性的降低，阻礙鐵還原菌胞外電子傳遞。另一方面微生物不能有效地利用細胞表面鐵氧化物作為電子受體[36， 60]。2）硝酸鹽還原過程抑制了鐵還原過程。目前的研究表明，細胞色素CymA能夠參與多種電子受體的還原過程，微生物更傾向于利用硝酸鹽作為電子受體，所以硝酸鹽還原CymA的電子傳遞過程可能導致鐵還原速率的減慢，表現為硝酸鹽和鐵的競爭性還原[44， 61]。3）由于較高濃度亞硝酸鹽的存在，導致鐵還原生成亞鐵發生再氧化。4）體系殘留的亞鐵吸附在鐵氧化物表面，導致鐵活性的降低，微生物無法進行生物鐵還原過程。

研究表明，厭氧環境中多種微生物群落參與NRFO過程[62]。本研究強調了在厭氧富鐵環境中非模式菌驅動的NRFO過程，表明在厭氧環境中NRFO過程并不是單一微生物驅動的，非亞鐵氧化功能菌也能夠驅動NRFO過程。在低氮肥施加水稻土和厭氧沉積物中，微生物硝酸鹽異化還原為銨（DNRA）在硝酸鹽代謝途徑中占有主導地位[63-64]。鐵還原菌DNRA生成銨根，然后被植物或者其他微生物吸收利用，有利于厭氧環境氮沉積和再循環。厭氧富鐵環境中亞鐵顯著抑制微生物DNRA過程，亞鐵競爭性還原亞硝酸鹽導致微生物產銨的大量減少，生成的NO和N2O釋放到大氣中，造成厭氧環境中氮損耗[39]。細胞結殼阻礙硝酸鹽等電子受體進入細胞還原，導致硝酸鹽的不完全還原，同時限制微生物的運動、生長、營養物質攝入[60]。該研究表明，細胞結殼抑制了異化鐵還原菌介導的NRFO過程，細胞結殼對不同鐵還原菌的抑制機制不同。本工作豐富了硝酸鹽還原亞鐵氧化的研究思路，加深了對微生物驅動的NRFO反應機制的理解。

3 結論

鐵還原菌能夠通過硝酸鹽還原的中間產物亞硝酸鹽與亞鐵的化學反硝化作用實現亞鐵氧化過程。亞鐵抑制了微生物硝酸鹽還原、亞硝酸鹽和銨根的生成。低濃度亞鐵條件下，亞鐵降低了L17和CN32硝酸鹽還原速率，而亞鐵完全抑制了MR-1硝酸鹽還原，其抑制順序為MR-1>L17>CN32。亞鐵嚴重抑制了硝酸鹽異化還原成銨過程。在高濃度亞鐵條件下，亞鐵氧化成礦明顯抑制了微生物硝酸鹽還原過程。在低濃度亞鐵條件下，對于L17和CN32來說，亞鐵氧化生成的鐵氧化物抑制了微生物的硝酸鹽還原，但大部分微生物沒有完全結殼，所以，硝酸鹽最終能被完全還原，且CN32硝酸鹽還原速率明顯高于L17。亞鐵毒害作用抑制了L17硝酸鹽還原過程，也是影響MR-1硝酸鹽還原的主要原因。隨著亞鐵濃度的升高，微生物細胞結殼程度越高，細胞的完全結殼是硝酸鹽還原停滯的主要原因。本研究拓展了硝酸鹽還原亞鐵氧化過程的微生物類型，加深了對微生物介導的硝酸鹽還原亞鐵氧化的理解，對研究微生物介導的鐵-氮循環過程具有重要的意義。

參考文獻：

[1] KAPPLER A. Geomicrobiological cycling of iron [J]. Reviews in Mineralogy and Geochemistry， 2005， 59（1）： 85-108.

[2] BORCH T， KRETZSCHMAR R， KAPPLER A， et al. Biogeochemical redox processes and their impact on contaminant dynamics [J]. Environmental Science & Technology， 2010， 44（1）： 15-23.

[3] RODEN E E， WETZEL R G. Kinetics of microbial Fe（Ⅲ） oxide reduction in freshwater wetland sediments [J]. Limnology and Oceanography， 2002， 47（1）： 198-211.

[4] WEBER K A， ACHENBACH L A， COATES J D. Microorganisms pumping iron： Anaerobic microbial iron oxidation and reduction [J]. Nature Reviews Microbiology， 2006， 4（10）： 752-764.

[5] KENDALL B， ANBAR A D， KAPPLER A， et al. The global iron cycle[M]//Fundamentals of Geobiology. Chichester， UK： John Wiley & Sons， Ltd， 2012： 65-92.

[6] 胡敏， 李芳柏. 土壤微生物鐵循環及其環境意義[J]. 土壤學報， 2014， 51（4）： 683-698.

HU M， LI F B. Soil microbe mediated iron cycling and its environmental implication [J]. Acta Pedologica Sinica， 2014， 51（4）： 683-698. （in Chinese）

[7] ROBERTSON G P， VITOUSEK P M. Nitrogen in agriculture： Balancing the cost of an essential resource [J]. Annual Review of Environment and Resources， 2009， 34（1）： 97-125.

[8] KUYPERS M M M， MARCHANT H K， KARTAL B. The microbial nitrogen-cycling network [J]. Nature Reviews Microbiology， 2018， 16（5）： 263-276.

[9] KRAFT B， STROUS M， TEGETMEYER H E. Microbial nitrate respiration-Genes， enzymes and environmental distribution [J]. Journal of Biotechnology， 2011， 155（1）： 104-117.

[10] TORRES M J， SIMON J， ROWLEY G， et al. Nitrous oxide metabolism in nitrate-reducing bacteria： Physiology and regulatory mechanisms [J]. Advances in Microbial Physiology， 2016， 68： 353-432.

[11] ZHU-BARKER X， CAVAZOS A R， OSTROM N E， et al. The importance of abiotic reactions for nitrous oxide production [J]. Biogeochemistry， 2015， 126（3）： 251-267.

[12] WANG X N， SUN G X， ZHU Y G. Thermodynamic energy of anaerobic microbial redox reactions couples elemental biogeochemical cycles [J]. Journal of Soils and Sediments， 2017， 17（12）： 2831-2846.

[13] STRAUB K L， BENZ M， SCHINK B， et al. Anaerobic， nitrate-dependent microbial oxidation of ferrous iron [J]. Applied and Environmental Microbiology， 1996， 62（4）： 1458-1460.

[14] LI X M， ZHANG W， LIU T X， et al. Changes in the composition and diversity of microbial communities during anaerobic nitrate reduction and Fe（Ⅱ） oxidation at circumneutral pH in paddy soil [J]. Soil Biology and Biochemistry， 2016， 94： 70-79.

[15] HAFENBRADL D， KELLER M， DIRMEIER R， et al.Ferroglobus placidus gen. nov.， sp. nov.， a novel hyperthermophilic archaeum that oxidizes Fe2+ at neutral pH under anoxic conditions [J]. Archives of Microbiology， 1996， 166（5）： 308-314.

[16] EMERSON D. Biogeochemistry and microbiology of microaerobic Fe（Ⅱ） oxidation [J]. Biochemical Society Transactions， 2012， 40（6）： 1211-1216.

[17] SOROKINA A Y， CHERNOUSOVA E Y， DUBININA G A.Hoeflea siderophila sp. nov.， a new neutrophilic iron-oxidizing bacterium [J]. Microbiology， 2012， 81（1）： 59-66.

[18] MICHIELS C C， DARCHAMBEAU F， ROLAND F A E， et al. Iron-dependent nitrogen cycling in a ferruginous lake and the nutrient status of proterozoic oceans [J]. Nature Geoscience， 2017， 10（3）： 217-221.

[19] WANG H B， HU C， HAN L C， et al. Effects of microbial cycling of Fe（Ⅱ）/Fe（Ⅲ） and Fe/N on cast iron corrosion in simulated drinking water distribution systems [J]. Corrosion Science， 2015， 100： 599-606.

[20] PRICE A， PEARSON V K， SCHWENZER S P， et al. Nitrate-dependent iron oxidation： A potential Mars metabolism [J]. Frontiers in Microbiology， 2018， 9： 513.

[21] CHEN D D， LIU T X， LI X M， et al. Biological and chemical processes of microbially mediated nitrate-reducing Fe（Ⅱ） oxidation by Pseudogulbenkiania sp. strain 2002 [J]. Chemical Geology， 2018， 476： 59-69.

[22] BRYCE C， BLACKWELL N， SCHMIDT C， et al. Microbial anaerobic Fe（Ⅱ） oxidation-Ecology， mechanisms and environmental implications [J]. Environmental Microbiology， 2018， 20（10）： 3462-3483.

[23] ZHU Y G， DUAN G L， CHEN B D， et al. Mineral weathering and element cycling in soil-microorganism-plant system [J]. Science China Earth Sciences， 2014， 57（5）： 888-896.

[24] ZHAO L D， DONG H L， KUKKADAPU R， et al. Biological oxidation of Fe（Ⅱ） in reduced nontronite coupled with nitrate reduction by Pseudogulbenkiania sp. Strain 2002 [J]. Geochimica et Cosmochimica Acta， 2013， 119： 231-247.

[25] PANTKE C， OBST M， BENZERARA K， et al. Green rust formation during Fe（Ⅱ） oxidation by the nitrate-reducing Acidovorax sp. strain BoFeN1 [J]. Environmental Science & Technology， 2012， 46（3）： 1439-1446.

[26] KAPPLER A， SCHINK B， NEWMAN D K. Fe（Ⅲ） mineral formation and cell encrustation by the nitrate-dependent Fe（Ⅱ）-oxidizer strain BoFeN1 [J]. Geobiology， 2005， 3（4）： 235-245.

[27] LIU T X， CHEN D D， LI X M， et al. Microbially mediated coupling of nitrate reduction and Fe（Ⅱ） oxidation under anoxic conditions [J]. FEMS Microbiology Ecology， 2019， 95（4）： fiz030.

[28] 黎慧娟， 彭靜靜. 異化Fe（Ⅲ）還原微生物研究進展[J]. 生態學報， 2012， 32（5）： 1633-1642.

LI H J， PENG J J. Recent advances in studies on dissimilatory Fe（Ⅲ）-reducing microorganisms [J]. Acta Ecologica Sinica， 2012， 32（5）： 1633-1642. （in Chinese）

[29] DEMEY L M， MILLER C R， MANZELLA M P， et al. The draft genome of the hyperthermophilic archaeon Pyrodictium delaneyi strain hulk， an iron and nitrate reducer， reveals the capacity for sulfate reduction [J]. Standards in Genomic Sciences， 2017， 12： 47.

[30] LIU T X， LI X M， ZHANG W， et al. Fe（Ⅲ） oxides accelerate microbial nitrate reduction and electricity generation by Klebsiella pneumoniae L17 [J]. Journal of Colloid and Interface Science， 2014， 423： 25-32.

[31] ZHANG W， LI X M， LIU T X， et al. Competitive reduction of nitrate and iron oxides by Shewanella putrefaciens 200 under anoxic conditions [J]. Colloids and Surfaces A： Physicochemical and Engineering Aspects， 2014， 445： 97-104.

[32] CHEN Y， WANG F， XU J， et al. Physiological and evolutionary studies of NAP systems in Shewanella piezotolerans WP3 [J]. The ISME Journal， 2011， 5（5）： 843-855.

[33] YAO D F， ZHANG X， WANG G W， et al. A novel parameter for evaluating the influence of iron oxide on themethanogenic process [J]. Biochemical Engineering Journal， 2017， 125： 144-150.

[34] LI B B， CHENG Y Y， WU C， et al. Interaction between ferrihydrite and nitrate respirations by Shewanella oneidensis MR-1 [J]. Process Biochemistry， 2015， 50（11）： 1942-1946.

[35] ZHOU Z M， JING G H， ZHENG X J. Reduction of Fe（Ⅲ） EDTA by Klebsiella sp. strain FD-3 in NOx scrubber solutions [J]. Bioresource Technology， 2013， 132： 210-216.

[36] COBY A J， PICARDAL F W. Inhibition of NO-3 and NO-2 reduction by microbial Fe（Ⅲ） reduction： Evidence of a reaction between NO-2 and cell surface-bound Fe2+ [J]. Applied and Environmental Microbiology， 2005， 71（9）： 5267-5274.

[37] LIU T X， ZHANG W， LI X M， et al. Kinetics of competitive reduction of nitrate and iron oxides by Aeromonas hydrophila HS01 [J]. Soil Science Society of America Journal， 2014， 78（6）： 1903-1912.

[38] DHAKAL P. Abiotic nitrate and nitrite reactivity with iron oxide minerals [D]. South Limestone， Lexington： University of Kentucky， 2013.

[39] SAMARKIN V A， MADIGAN M T， BOWLES M W， et al. Abiotic nitrous oxide emission from the hypersaline Don Juan Pond in Antarctica [J]. Nature Geoscience， 2010， 3（5）： 341-344.

[40] CHANGE I C. The physical science basis [M]. Cambridge University Press， 2007.

[41] LU Y S， HUANG X E， XU L， et al. Elucidation of the nitrogen-transformation mechanism for nitrite removal using a microbial-mediated iron redox cycling system [J]. Journal of Water Process Engineering， 2020， 33： 101016.

[42] LIU T X， CHEN D D， LUO X B， et al. Microbially mediated nitrate-reducing Fe（Ⅱ） oxidation： Quantification of chemodenitrification and biological reactions [J]. Geochimica et Cosmochimica Acta， 2019， 256： 97-115.

[43] YOON S， CRUZ-GARCA C， SANFORD R， et al. Denitrification versus respiratory ammonification： Environmental controls of two competing dissimilatory NO-3/NO-2 reduction pathways in Shewanella loihica strain PV-4 [J]. The ISME Journal， 2015， 9（5）： 1093-1104.

[44] GAO H， YANG Z K， BARUA S， et al. Reduction of nitrate in Shewanella oneidensis depends on atypical NAP and NRF systems with NapB as a preferred electron transport protein from CymA to NapA [J]. The ISME Journal， 2009， 3（8）： 966-976.

[45] CRUZ-GARCA C， MURRAY A E， KLAPPENBACH J A， et al. Respiratory nitrate ammonification by Shewanella oneidensis MR-1 [J]. Journal of Bacteriology， 2007， 189（2）： 656-662.

[46] LI X M， ZHOU S G， LI F B， et al. Fe（Ⅲ） oxide reduction and carbon tetrachloride dechlorination by a newly isolated Klebsiella pneumoniae strain L17 [J]. Journal of Applied Microbiology， 2009， 106（1）： 130-139.

[47] BELIAEV A S， KLINGEMAN D M， KLAPPENBACH J A， et al. Global transcriptome analysis of Shewanella oneidensis MR-1 exposed to different terminal electron acceptors [J]. Journal of Bacteriology， 2005， 187（20）： 7138-7145.

[48] STONE J J， BURGOS W D， ROYER R A， et al. Impact of zinc on biological Fe（Ⅲ） and nitrate reduction by Shewanella putrefaciens CN32 [J]. Environmental Engineering Science， 2006， 23（4）： 691-704.

[49] WEBER K A， HEDRICK D B， PEACOCK A D， et al. Physiological and taxonomic description of the novel autotrophic， metal oxidizing bacterium，Pseudogulbenkiania sp. strain 2002 [J]. Applied Microbiology and Biotechnology， 2009， 83（3）： 555-565.

[50] JONES L C， PETERS B， LEZAMA PACHECO J S， et al. Stable isotopes and iron oxide mineral products as markers of chemodenitrification [J]. Environmental Science & Technology， 2015， 49（6）： 3444-3452.

[51] PICARDAL F. Abiotic and microbial interactions during anaerobic transformations of Fe（Ⅱ） and NO-x [J]. Frontiers in Microbilogy， 2012， 3： 112.

[52] HU M， CHEN P C， SUN W M， et al. A novel organotrophic nitrate-reducing Fe（Ⅱ）-oxidizing bacterium isolated from paddy soil and draft genome sequencing indicate its metabolic versatility [J]. RSC Advances， 2017， 7（89）： 56611-56620.

[53] ZHANG W， LI X M， LIU T X， et al. Enhanced nitrate reduction and current generation by Bacillus sp. in the presence of iron oxides [J]. Journal of Soils and Sediments， 2012， 12（3）： 354-365.

[54] WANG G W， CHEN T H， YUE Z B， et al. Isolation and characterization of Pseudomonas stutzeri capable of reducing Fe（Ⅲ） and nitrate from skarn-type copper mine tailings [J]. Geomicrobiology Journal， 2014， 31（6）： 509-518.

[55] LI X M， LIU T X， LI F B， et al. Reduction of structural Fe（Ⅲ） in oxyhydroxides by Shewanella decolorationis S12 and characterization of the surface properties of iron minerals [J]. Journal of Soils and Sediments， 2012， 12（2）： 217-227.

[56] COOPER D C， PICARDAL F W， SCHIMMELMANN A， et al. Chemical and biological interactions during nitrate and goethite reduction by Shewanella putrefaciens 200 [J]. Applied and Environmental Microbiology， 2003， 69（6）： 3517-3525.

[57] HERNANDEZ M E， NEWMAN D K. Extracellular electron transfer [J]. Cellular and Molecular Life Sciences CMLS， 2001， 58（11）： 1562-1571.

[58] ZHAO L D， DONG H L， KUKKADAPU R K， et al. Biological redox cycling of iron in nontronite and its potential application in nitrate removal [J]. Environmental Science & Technology， 2015， 49（9）： 5493-5501.

[59] LU Y S， XU L， SHU W K， et al. Microbial mediated iron redox cycling in Fe （hydr）oxides for nitrite removal [J]. Bioresource Technology， 2017， 224： 34-40.

[60] MUEHE E M， GERHARDT S， SCHINK B， et al. Ecophysiology and the energetic benefit of mixotrophic Fe（Ⅱ） oxidation by various strains of nitrate-reducing bacteria [J]. FEMS Microbiology Ecology， 2009， 70（3）： 335-343.

[61] MURPHY J N， SALTIKOV C W. The cymA gene， encoding a tetraheme c-type cytochrome， is required for arsenate respiration in Shewanella species [J]. Journal of Bacteriology， 2007， 189（6）： 2283-2290.

[62] NELSON M B， MARTINY A C， MARTINY J B. Global biogeography of microbial nitrogen-cycling traits in soil [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2016， 113（29）： 8033-8040.

[63] PANDEY A， SUTER H， HE J Z， et al. Dissimilatory nitrate reduction to ammonium dominates nitrate reduction in long-term low nitrogen fertilized rice paddies [J]. Soil Biology and Biochemistry， 2019， 131： 149-156.

[64] SALK K R， ERLER D V， EYRE B D， et al. Unexpectedly high degree of anammox and DNRA in seagrass sediments： Description and application of a revised isotope pairing technique [J]. Geochimica et Cosmochimica Acta， 2017， 211： 64-78.

（編輯 王秀玲）