二氧化氯消毒劑在開放式組培中應用試驗初探

楊靜 張怡 何素芬 李雪 曹巧玲 王振

摘要：植物組織培養過程中，滅菌與消毒是防止微生物污染最基本的、最重要的環節，也是組培成功與否的關鍵因素之一。本試驗以香石竹為培養材料，選用必潔仕牌二氧化氯消毒劑，對培養瓶、房間和外植體進行消毒殺菌，再進行接種培養，觀察其消毒殺菌效果，以及對外植體分化效果，為二氧化氯消毒劑應用于植物組培快繁提供試驗數據，供同行們參考。

關鍵詞：二氧化氯 消毒劑 香石竹 開放式組培

在植物組織培養過程中，防止和消除細菌、真菌及其他微生物的感染，除了培養基、培養瓶、接種工具用品必須嚴格消毒外，外植體表面消毒處理是非常重要的一環，也是外植體材料從帶菌狀態轉為無菌狀態的關鍵步驟。目前植物組培中最常用的消毒劑為氯化汞和次氯酸鈉等，汞為重金屬元素，對環境和人體都有極大的負面影響，同時國家嚴禁汞消毒廢液排入下水道，無害化處理操作繁瑣。次氯酸鈉殺菌效果常因植物種類不同，同一植物取材部位、取材時間不同而不同。我們以必潔仕牌二氧化氯消毒劑替代升汞和次氯酸鈉產品，在花卉香石竹組培過程中，用于外植體消毒試驗探索，取得了一定的效果，但由于試驗次數有限，試驗結果僅供同行參考。

1.試驗材料與方法

1.1試驗材料

香石竹莖段：選擇剪取當年生長健壯無病蟲害感染的香石竹莖干，剪掉葉片，再剪成帶兩個葉節的莖段。

1.2藥劑與用品

必潔仕牌二氧化氯消毒劑、次氯酸鈉、酒精、洗衣粉、新潔爾滅、無菌水、剪刀、鑷子、不銹鋼盤、培養皿等。

2.試驗設計

試驗設計采取單因子試驗，MS培養基為基本培養基，6-BA、NAA用量不變，消毒劑處理方法和時間不變，只變動消毒劑用量，分別為100㎎/L、80㎎/L、60㎎/L三個水平，用2%次氯酸鈉作對照，試驗目的，篩選不同用量必潔仕消毒劑對香石竹外植體殺菌效果以及對芽分化的影響。

3.操作方法與步驟

3.1房間消毒

按1片A劑加5mLB劑，熏蒸5立方米房間，如果房間污染較嚴重的，可使用3片A劑加15mLB劑，熏蒸5立方米房間。

3.2培養瓶浸泡消毒

取必潔仕消毒劑母液（1200㎎/L），按1：30比例將母液稀釋，倒入一個塑料盆中，將培養瓶和瓶蓋放入消毒藥液中浸泡5分鐘，用毛巾在消毒液中浸濕后，擦拭工作臺面，除塵消毒，再用75%酒精噴霧臺面，把培養瓶和瓶蓋從消毒液中撈起，瓶口、瓶蓋向下倒扣在工作臺桌面上。剪刀、鑷子等接種工具，經高壓或干熱滅菌后取出直接放入75%酒精瓶中備用。

3.3培養基及配制

MS+6-BA2-3㎎/L+NAA0.1-0.2㎎/L+瓊脂7g/L+蔗糖28-30g/L

依次從配好的母液中量按需取出大量元素、微量元素、鐵鹽、有機物營養液和6-BA、NAA于燒杯中，稱瓊脂、蔗糖，加水熬溶化后，倒入營養液混合煮沸定溶，調整pH值為5.8-6.0，加入抗菌劑，煮沸2-3分鐘，分裝培養瓶，待凝固后備用。

3.4外植體表面清洗與消毒

3.4.1外植體選擇

選擇生長健壯無病蟲害感染的當年生香石竹莖段，剪去葉片，再剪成帶兩個葉節的小段。

3.4.2表面清洗與消毒

表面清洗與消毒，外植體取回來后，用自來水清洗表面，入三角瓶中加水和少許洗衣粉，振蕩洗滌1-2分鐘，自來水沖洗后，再加少許新潔爾滅振蕩洗滌后，在自來水下流水沖洗30-60分鐘，倒掉水后，加入75%酒精搖動5-8秒，倒出酒精，用無菌水洗兩次，再把外植體材料放在60㎎/L-100㎎/L濃度必潔仕牌二氧化氯消毒劑溶液中振蕩消毒15分鐘。

3.5接種與培養

3.5.1接種方法

用浸泡培養瓶的消毒液擦拭工作臺，肥皂洗干凈雙手，再用75%酒精擦拭工作臺和雙手，打開瓶蓋，從75%酒精瓶中取出剪刀和鑷子，適當剪去外植體莖段的兩端，用經過滅菌的無菌紙吸去水多余的液滴，把外植體插入培養基中，蓋緊瓶蓋。

3.5.2室內培養

有固定培養室的，把接種的培瓶擺放在培養架上，調控室內溫度在25（±2）℃，光照2000-2500XL，也可利用自然光源在室內培養。

4.試驗觀察與統計

4.1污染統計

接種后3天起至12天結束觀察，三個不同濃度的二氧化氯消毒劑對外植體消毒效果，分別為60∠100∠80，最好的是80㎎/L，最差的是60㎎/L。污染和外植體死亡癥狀主要有三種情況：一是在外植體及其轉圍培養基上生長出白色或灰白色毛和黑色塊狀物;二是在培養基上形成紅色或白色菌斑，培養基變稀變臭;三是外植體葉或莖變白后死亡。其中濃度100污染較輕，變白致死的比例較重些，濃度為80、60的污染較重，變白致死較輕。對照試驗的污染輕，但外植體變白死亡程度重。

4.2芽萌發與分化

外植體側芽萌發與叢生芽分化，接種第7天開始至20天觀察結束，二氧化氯消毒劑處理的外植體發芽早，接種7天開始萌芽，20天以后叢生芽數量顯著增多，叢生芽密集，弱苗細苗無效苗多，有玻璃化苗出現。總體表現：側芽萌發早（7天開始發芽）、多（平均1-12個），從生芽生長弱，葉片細長，葉色淡，有卷曲狀。對照材料發芽遲，接種15天后才有側芽萌發，叢生芽分化少，25天后叢生芽才分化，平均只有1-3個。

5.分析與討論

5.1在外植體及其轉圍培養基上生長出白色或灰白色毛和黑色塊狀物，多為真菌或其他老霉菌引起的污染。可能原因，接種環境和空氣帶菌，消毒不干凈;工作人員操作不熟練，不規范，敝開瓶口和材料暴露時間過久，被空氣中雜菌感染所致。

5.2在培養基上形成紅色或白色菌斑，培養基變稀變臭，多為細菌引起的污染。可能原因，工作臺、接種工具用具用品消毒不干凈，接種人員操作不規范，接種時工具與工作臺，瓶外壁觸碰，將菌源帶入所致;還有可能是材料自身體內毒素向外溢出造成培養基污染。

5.3外植體變白后壞死，可能原因，消毒劑使用濃度過高，浸泡時間過長，外植體材料剪口破損，消毒液浸入材料內部造成細胞組織受藥害導致中毒害死亡。

5.4外植體消毒不徹底，抗菌劑成分與配量沒達到最佳，材料體內帶毒，表面消毒不能徹底消除體內菌源，在培養過程中不斷產生出霉菌體并漫延所致。

5.5討論

必潔仕牌二氧化氯消毒劑，殺菌廣譜、能夠高效殺菌;無毒、無殘留、對人身體沒有傷害、對皮膚無刺激性;使用方法靈活多樣，即可以熏蒸對空間消毒，又可以配制成稀釋液，既可以對培養瓶浸泡殺菌，還可代替升汞作為外植體消毒，操作方便，省工省時，可大提高勞動效率。

但由于植物生長環境和材料本身差異，以及取材時間、部位不同，各種植物表面攜帶菌類和內生菌種類均不同，所以不同種類的外植體消毒方法、使用濃度、處理時間均有待進一步探索試驗。

作者簡介：

楊靜（1981-）女 碩士研究生 園林工程師 研究方向 園林工程與植物組織培養技術