實時熒光PCR 檢測在支原體肺炎診斷中的應用價值

孫振宏，王茵娜，黃慰慰

泉州市婦幼保健院兒童醫(yī)院 （福建泉州 362000）

支原體是臨床中常見的病原菌，通過呼吸道傳播，具有較強的傳染性及反復性。支原體肺炎患兒會出現(xiàn)發(fā)熱、咳嗽等癥狀，且白細胞計數(shù)顯著增高，若不能及時接受治療，將會引發(fā)皮炎及中耳炎等病癥，嚴重時甚至還會并發(fā)心肌炎或腦膜炎，對患兒的身心健康造成影響[1]。臨床對于支原體肺炎的診斷多采用間接免疫熒光法檢測呼吸道病原體譜抗體IgM，該方法操作簡單，檢出率較高，但診斷靈敏度、特異度較低，加之患兒發(fā)病早期缺乏特異性癥狀，易出現(xiàn)誤診、漏診[2]。近年來，隨著臨床對分子生物學的研究不斷深入，PCR 檢測技術的應用越來越廣泛。有研究顯示，實時熒光PCR 檢測的靈敏度、特異度均較高[3]。本研究探討實時熒光PCR 檢測在支原體肺炎診斷中的應用價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年2月至2019年11月我院收治的90例支原體肺炎患兒，男42例，女48例；年齡0.5～7.0歲，平均（3.54±0.14）歲；病程7～44 d，平均（27.24±2.36）d。本研究經醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準納入標準：存在發(fā)熱、呼吸急促；胸片出現(xiàn)異常改變；存在管狀呼吸音；血清支原體肺炎IgM ≥1∶160；患兒家屬簽署知情同意書同意參與本研究。排除標準：患有先天性心臟病的患兒；臟器功能存在障礙的患兒；臨床資料不完整的患兒；患有嚴重精神疾病的患兒。

1.2 方法

患兒入院后均完善有關檢查，采集血清標本進行間接免疫熒光法檢測呼吸道病原體譜抗體IgM，采集咽拭子進行實時熒光PCR 檢測。（1）間接免疫熒光法檢測：檢測原理為，將稀釋的患者血清與包被有檢測基質的載片溫育，若樣本為陽性，特異性IgM 抗體與相應抗原結合，第2次溫育時，結合的抗體與熒光素標記的抗人免疫球蛋白抗體反應，此時可在熒光顯微鏡下觀察到特異性的熒光模型；檢測步驟包括準備、加樣、溫育、沖洗、加樣、溫育、沖洗、封片，上述操作完畢后在顯微鏡下觀察熒光模型；結果判讀時，觀察組織器官和感染的細胞采用20×物鏡，觀察細胞基質采用40×物鏡，激發(fā)濾鏡450～490 nm，分光鏡510 nm，阻擋濾鏡515 nm，光源100 W 汞燈，顯微鏡為歐蒙LED（EUROStar Bluelight，購置于上海兆儀光電科技有限公司）。（2）實時熒光PCR 檢測：將采集的咽拭子標本與0.9%氯化鈉注射液混合，12 000 r/min 離心5 min，去上清，沉淀中加入50 μl DNA提取液充分混勻，100 ℃恒溫處理（10±1） min，12 000 r/min離心5 min，備用；提取DNA 后使用熒光PCR 進行定量檢測，儀器選擇ABI7500型實時熒光定量PCR 儀（蘇州貝瑞儀器有限公司），試劑盒選擇中山大學達安基因股份有限公司生產的肺炎支原體核酸定量檢測試劑，嚴格按照說明書進行操作。

1.3 觀察指標

比較免疫熒光法和實時熒光PCR 檢測的檢出率，并繪制ROC 曲線，分析兩種方法單獨及聯(lián)合檢測的診斷效能。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗，繪制ROC 曲線，分析診斷效能，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩種方法的檢出率比較

實時熒光PCR 檢測的檢出率高于間接免疫熒光法檢測，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表1。

表1 兩種方法的檢出率比較（90例）

2.2 兩種方法單獨及聯(lián)合檢測的診斷效能

ROC 曲線結果表明，聯(lián)合檢測的診斷靈敏度、特異度均高于兩種方法單獨檢測，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表2和圖1。

表2 兩種方法單獨及聯(lián)合檢測的診斷效能

圖1 不同檢測方法在小兒支原體肺炎中的診斷ROC 曲線

3 討論

支原體肺炎是一種經呼吸道傳播的疾病，臨床表現(xiàn)無特異性，極易出現(xiàn)漏診、誤診的狀況，很多患兒不能得到及時治療，導致病情逐漸惡化，嚴重影響患兒的身心健康及生命質量[4]。該病患兒通過X 線片檢查多發(fā)現(xiàn)肺部紋理明顯增多，需采集血清、痰或咽拭子進行實驗室檢測，檢測方法多以間接免疫熒光法測定為主，該方法可直接對病原體抗體進行檢測，具有操作方便、速度快等特點，但其診斷靈敏度、特異度較低，極易出現(xiàn)假陽性，且僅適用于患兒體內存在抗體的情況，局限性較大，性價比較低[5]。

隨著我國醫(yī)療診斷技術的不斷進步，臨床發(fā)現(xiàn)實時熒光PCR 檢測對支原體肺炎的診斷準確性較高。實時熒光PCR 檢測是一種新興的體外核酸擴增技術，可同時擴增多個標本，直接反映患兒的感染情況[6]；該方法可通過探針實時監(jiān)測擴增時的熒光信號，不必進行配膠、電泳等操作，可進一步縮短檢測時間，同時還能提高診斷準確性[7]；加之該方法的診斷靈敏度、特異度較高，對傳統(tǒng)培養(yǎng)技術的依賴性較低，更利于在臨床推廣應用；但該方法對樣本的采集和操作環(huán)境要求較高，若樣本的處理出現(xiàn)差錯，會影響診斷結果，增加檢測難度，因此，需注意提高檢測人員的操作能力及綜合素養(yǎng)，避免人為因素影響檢測結果[8]。目前，實時熒光PCR 檢測是唯一一個將基因拷貝數(shù)進行定量的方法，且檢驗操作較為智能。本研究結果顯示，聯(lián)合檢測的診斷靈敏度、特異度均高于兩種方法單獨檢測（P<0.05）。

綜上所述，實時熒光PCR 檢測用于支原體肺炎診斷中能獲得較高的檢出率，聯(lián)合間接免疫熒光法檢測能提高診斷靈敏度、特異度。