超高效液相色譜-串聯質譜法快速測定毒蕈中6種鵝膏毒肽類和鬼筆毒肽類毒素

薛康 胡江濤 俞凌云 劉菲 馬麗 龔婷婷 華燚 陳佳玥

摘要 [目的]建立一種基于超高效液相色譜-串聯質譜法（UPLC-MS/MS）快速測定野生毒蕈中6種鵝膏毒肽和鬼筆毒肽類毒素的分析方法。[方法]將采集的四川野生毒蕈子實體低溫烘干，用甲醇超聲提取，40 ℃旋轉蒸發近干，加水復溶，Oasis HLB固相萃取小柱凈化，經Waters HSS T3色譜柱分離，ESI正離子模式下多反應監測（MRM）方式分析。[結果]6種毒肽在50～1 000 μg/kg具有良好的線性關系，相關系數均大于0.99，方法檢出限為30 μg/kg。α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽、γ-鵝膏毒肽、二羥鬼筆毒肽、羧基二羥鬼筆毒肽、羧基三羥鬼筆毒肽在低、中、高3個濃度的平均回收率在93.1%～117.5%，變異系數（CV）在1.49%～7.77%。[結論]該方法能準確、靈敏地測定野生毒蕈中6種毒肽，適用于野生菌中毒肽毒素的測定。

關鍵詞 野生毒蕈;鵝膏毒肽;鬼筆毒肽;超高效液相色譜-串聯質譜法

中圖分類號 R155.3 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2021）17-0182-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.17.048

Abstract [Objective]To establish a method for rapid determination of 6 kinds of amanitins and phallotoxins in wild poisonous mushrooms by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（UPLC-MS/MS）.[Method]The wild mushrooms samples collected in Sichuan were dried at low temperature， the amanitins and phallotoxins in samples were extracted with methanol by ultrasonic extraction， then 40 ℃ rotary evaporation drying ，water redissolution， purified by HLB solid phase extraction column and separated on Waters HSS T3 column，lastly detected by electrospray（ESI+） in MRM mode. [Result] The 6 kinds of amanitins and phallotoxins had good linear relationships in the range of concentration 50-1000 μg/kg with the correlation coefficient value greater than 0.99.The detection limits of 6 kinds of amanitins and phallotoxins were 30 μg/kg.The average recovery rates of α-amanitin， β-amanitin，γ-amanitin， phalloidin， phallacidin and phallisacin at 3 spiked levels were 93.1%-117.5%. The coefficients of variation were 1.49%-7.77%. [Conclusion]The method can accurately and sensitively determine 6 kinds of amanitins and phallotoxins in poisonous mushrooms， which is suitable for the detection of amanitins and phallotoxins in wild mushrooms.

Key words Wild poisonous mushrooms;Amanitins;Phallotoxins;UPLC-MS/MS

毒蕈即日常所說的毒蘑菇，是指不同類型的含有毒素的大型野生真菌，由于有些毒蕈在外觀上與食用菌沒有明顯區別，導致誤食毒蕈而引發中毒的事件時有發生，且在群體性食物中毒中，毒蕈中毒的致死率極高，其中肝損傷型毒蕈中毒致死率高達90%～100%[1]。據統計，我國毒蕈中毒事件中，95%是由鵝膏菌屬引起的[2]。因為鵝膏菌中含有化學性質穩定且毒性極強的鵝膏多肽類毒素，該類毒肽耐高溫、干燥和酸堿環境，一般的烹調加工不會破壞其毒性，不幸誤食后，毒肽就會通過消化系統進入肝臟，對肝臟造成嚴重的損傷，最終引發多器官功能衰竭而死亡[3-5]。現階段，國內外一般采用高效液相色譜法、高效液相色譜-飛行時間質譜法和高效液相色譜-串聯質譜法檢測毒肽毒素[6-11]，我國還沒有檢測毒肽毒素的國家標準。因此，該研究建立了一種利用超高效液相色譜-串聯質譜法快速測定野生毒蕈中6種毒肽毒素的檢測方法，以期為野生菌毒素檢測提供一種高效的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器

UPLC lclass-XEVOTQ-XS超高效液相色譜-串聯質譜聯用儀（美國Waters公司）;3H20RI離心機（中國赫西）;AE240電子天平（瑞士梅特勒）;XW-80A旋渦混合器（中國HUXI）;B8510E-DTH超聲波清洗器（美國必能信）;Mili-Q Integral 3超純水儀（美國Millipore公司）;ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm，美國Waters公司）。

1.2 試劑 甲醇、乙腈、甲酸、乙酸銨、氯仿，HPLC級，美國Fisher公司。標準品：α-鵝膏毒肽（α-amanitin，純度≥90%，瑞士Alex）;β-鵝膏毒肽（β-amanitin，純度≥90%，瑞士Alex）;γ-鵝膏毒肽（γ-amaniyin，純度≥90%，瑞士Alex）;羧基三羥鬼筆毒肽（phallisacin，50 μg/mL，上海安譜實驗科技有限公司）;羧基二羥鬼筆毒肽（phallacidin，純度≥95%，瑞士Alex）;二羥鬼筆毒肽（phalloidin，純度≥90%，瑞士Alex）。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準溶液的配制。

1.3.1.1 α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽、γ-鵝膏毒肽、二羥鬼筆毒肽、羧基二羥鬼筆毒肽標準儲備液的配制。 分別精確稱取α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽、γ-鵝膏毒肽、二羥鬼筆毒肽、羧基二羥鬼筆5種標準物質1 mg，精確至萬分之一，甲醇定容至10 mL，濃度為100 μg/mL。-20 ℃存儲。

1.3.1.2 鵝膏毒肽和鬼筆毒肽混合標準使用液的配制。分別準確吸取1.0 mL α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽、γ-鵝膏毒肽、二羥鬼筆毒肽和羧基二羥鬼筆毒肽儲備液以及2.0 mL羧基三羥鬼筆毒肽標準溶液于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，濃度為10 mg/L。

1.3.1.3 6種毒肽混合標準系列的配制。分別吸取50、100、200、400、600、1 000 μL，用初始流動相定容至10 mL，配制成濃度為50、100、200、400、600、1 000 μg/L的標準系列工作液。

1.3.2 樣品前處理。

1.3.2.1 提取。將新鮮野生菌樣品烘干（烘干溫度小于50 ℃）并打成粉末，精密稱取干燥粉末0.2 g，置于50 mL離心管中，加入甲醇10 mL，振蕩渦旋1 min，超聲提取10 min，以10 000 r/min離心10 min后，移取上清液于另一離心管中。殘渣中再加入10 mL甲醇，渦旋混合均勻，再次超聲提取10 min后以10 000 r/min離心，合并上清液。40 ℃旋轉蒸發近干，加2 mL水溶解，洗滌3次，得提取液。

1.3.2.2 凈化。分別用2 mL甲醇和純水淋洗活化Prime Oasis HLB固相萃取柱（3 mL，60 mg），再將以上提取液過柱，用2 mL含5%甲醇的水溶液淋洗2次，最后用2 mL甲醇-乙腈混合溶液（V∶V=3∶2）洗脫。將洗脫液在40 ℃水浴中氮吹近干，用1 mL初始流動相[甲醇-5 mmol/L 乙酸銨（0.1%甲酸）=90∶10]溶解定容，溶液過0.2 μm濾膜后，待上機測定。

1.3.3 分析條件。

1.3.3.1 色譜條件。色譜柱為HSS T3色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm，Waters公司）;流動相 A為5 mmol/L乙酸銨-0.1%甲酸水溶液， B為甲醇溶液;柱溫40 ℃;進樣量1.0 μL;洗脫程序見表1。

1.3.3.2 質譜條件。電噴霧ESI正離子模式;多反應監測（MRM）;離子源溫度150 ℃;毛細管電壓2.83 kV;脫溶劑溫度550 ℃;脫溶劑氣流量1 000 L/h;其他質譜參數見表2。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優化

鵝膏毒肽屬雙環八肽，鬼筆毒肽是一類環狀七肽，其支鏈上有較多的羥基和甲基，容易接受電子而被離子化，故常采用正離子模式進行分析[6，12]。分別將6種毒肽的標準品用甲醇稀釋成500 ng/mL，質譜儀直接進樣，在ESI正離子MS1Scan模式下，發現6種毒肽都有較強的M+1離子峰的出現，因此選定M+1為母離子，在Daughter Scan模式下，分別找到每種毒肽的2個最佳子離子。最后優化錐孔電壓、碰撞能、脫溶劑氣流量、脫溶劑氣溫度等質譜參數，使離子化效率更高、離子強度最大。具體6種毒肽的母離子和子離子見表2。

2.2 色譜條件的優化 試驗選擇了UPLC HSS T3色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），此色譜柱是與100%水相相兼容的C18柱，對保留和分離極性有機小分子具有較為理想的效果。該試驗選擇研究了4組流動相（A組水-乙腈;B組水-甲醇;C組0.1%甲酸水-甲醇;D組5 mmol/L乙酸銨（0.1%甲酸）-甲醇）的分離效果，試驗表明，甲醇的分離效果比乙腈好，且使用5 mmol/L乙酸銨（0.1%甲酸）作為水相時，目標物的離子峰強度較高，峰形較好。6種毒肽的標準提取離子圖詳見圖1。

2.3 樣品前處理方法的優化

由于野生菌中成分復雜，脂肪、磷脂、肽類等雜質含量較高，該試驗采用了先溶劑提取、再固相萃取柱凈化的方法，先后比較了甲醇、水、乙腈3種溶劑的提取效果，結果表明，甲醇的提取效果較好，回收率高。

試驗考察了在使用HLB固相萃取柱凈化過程中，5%甲醇-氯仿和5%甲醇-水淋洗液的淋洗效果，結果表明，5%甲醇-氯仿淋洗液對HLB小柱中吸附的脂肪、磷脂等雜質具有較好的洗脫效果，但回收率較差。綜合考慮，該試驗采用5%甲醇-水作為淋洗液。

2.4 線性范圍與檢出限 6種毒肽的線性方程、線性范圍和線性相關系數見表3。以3倍信噪比（S/N≥3）估算檢出限（LOD），6種毒肽的檢出限為30 μg/kg。

2.5 方法回收率和精密度

取1份樣品，分別對6種毒肽進行低（50 μg/kg）、中（200 μg/kg）、高（600 μg/kg）濃度加標試驗，結果發現（表4），平均回收率分別為α-鵝膏毒肽99.5%～

117.5%，β-鵝膏毒肽93.4%～107.0%，γ-鵝膏毒肽94.2%～110.1%，二羥鬼筆毒肽108.5%～119.8%，羧基二羥鬼筆毒肽 93.5%～109.7%，羧基三羥鬼筆毒肽93.1%～106.5%;6次平行測定，變異系數（CV）在1.49%～7.77%。

2.6 野生菌樣品檢測 按上述方法對采集到的10個四川野生菌樣品進行前處理和檢測。在4號和6號樣品中檢出了α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽和二羥鬼筆毒肽3種毒蕈毒素，具體結果見表5，譜圖見圖2和圖3。

3 結論

該研究基于超高效液相色譜-質譜聯用技術（UPLC-MS/MS），采用甲醇提取， HLB固相萃取柱凈化，HSS T3 色譜柱分離，電噴霧ESI正離子模式和多反應監測（MRM）方

式對6種毒蕈毒素的目標離子進行監測，外標法定量，建立了6種毒蕈毒素的快速、準確、選擇性好的測定方法。該方法與傳統的色譜法的檢測時間（20 min）相比，大大縮短了檢測時間，同時具備更高的準確度、靈敏度和特異性，適用于野生菌中毒肽毒素的測定。

參考文獻

[1] 魏佳會，吳劍峰，陳佳，等.12種劇毒鵝膏菌的肽類毒素成分鑒定及其相對含量差異比較研究[J].分析化學，2017，45（6）：817-823.

[2] 章鐵哲，孫承業，李海蛟，等. 一起蘑菇致急性中毒事件的現場調查與鑒定[J].中華急診醫學雜志，2016，25（8）：1012-1015.

[3] 趙春艷，王婷婷，邰麗梅，等. 鵝膏菌肽類毒素的研究進展[J].中國食用菌，2014，33（4）：9-11，13.

[4] 陳作紅，胡勁松，張志光，等. 我國28種鵝膏菌主要肽類毒素的檢測分析[J].菌物系統，2003，22（4）：565-573.

[5] 杜秀菊，杜秀云.毒蕈毒素及其應用[J].安徽農業科學，2010，38（13）：7172-7174.

[6] 劉陽，欒杰，林佶. 超高效液相色譜-串聯質譜法快速測定云南野生致命鵝膏菌中的毒傘肽和毒肽毒素[J].食品安全質量檢測學報，2017，8（10）：3756-3761.

[7] 柳潔，丁文婕，何碧英，等. 超高效液相色譜-電噴霧離子化-四級桿飛行時間串聯質譜指紋圖譜檢測毒蕈中4種鵝膏肽類毒素[J].分析化學，2013，41（4）：500-508.

[8] 劉思潔，方赤光. 蕈菌毒素檢測技術研究進展[J].食品安全質量檢測學報，2017，8（3）：754-760.

[9] 包海鷹，圖力古爾，李玉.7種鵝膏菌屬真菌肽類毒素的HPLC分析（英文）[J].菌物研究，2005，3（1）：13-16.

[10] 周貽兵，李磊，吳玉田，等.超高效液相色譜—串聯質譜法測定野生蘑菇中的3種鵝膏毒肽[J].現代預防醫學，2018，45（22）：4144-4147.

[11] 雒婉霞，王冉冉，王慶國，等.超高效液相色譜串聯質譜法檢測毒蕈中5種鵝膏多肽類毒素[J].疾病預防控制通報，2018，33（5）：84-87.

[12] 曹福祥，張志光，梁宋平.反相高效液相色譜法分離純化α-鵝膏毒肽[J].分析化學，2003，31（5）：562-565.