液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定三文魚(yú)中生物胺的不確定度分析

鄭越男 曹進(jìn) 孫珊珊 郭亞輝 羅嬌依 錢(qián)和

摘要 [目的]評(píng)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定三文魚(yú)中生物胺的不確定度。[方法]樣品經(jīng)過(guò)5%三氯乙酸提取、正己烷除脂、丹磺酰氯丙酮溶液衍生化后，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析三文魚(yú)中9種生物胺的含量，對(duì)方法相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度、標(biāo)準(zhǔn)不確定度、擴(kuò)展不確定度進(jìn)行評(píng)估。[結(jié)果]色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、酪胺、組胺、精胺、亞精胺、去甲基腎上腺素的平均值分別為4.30、5.59、5.72、6.21、4.85、5.48、7.18、6.79、4.77 mg/kg，擴(kuò)展不確定度分別為0.46、0.56、0.48、0.54、0.42、0.50、0.64、0.55、0.41 mg/kg（k=2）。[結(jié)論]標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制、稀釋以及標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性擬合對(duì)不確定度的貢獻(xiàn)值最大，建議選用精度好的量器，規(guī)范試驗(yàn)操作與前處理步驟。

關(guān)鍵詞 三文魚(yú);生物胺;液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;不確定度

中圖分類(lèi)號(hào) TS254.7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2021）17-0189-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.17.050

Abstract [Objective]To evaluate the uncertainty of determination of biogenic amines in salmon by liquid chromatography tandem mass spectrometry.[Method]The samples were extracted with 5% trichloroacetic acid， defatted with n-hexane and derivatized with dansyl chloroacetone solution. The contents of 9 biogenic amines in salmon were analyzed by LC-MS/MS.The relative standard uncertainty， standard uncertainty and expanded uncertainty of the method were evaluated.[Result]The average values of tryptamine， β - phenylethylamine， putrescine， cadaverine， tyramine， histamine， spermine， spermidine and norepinephrine were 4.30， 5.59， 5.72， 6.21， 4.85， 5.48， 7.18， 6.79 and 4.77 mg/kg respectively， and the expanded uncertainty was 0.46， 0.56， 0.48， 0.54， 0.42， 0.50， 0.64， 0.55and 0.41 mg/kg respectively （k=2）.[Conclusion]The preparation and dilution of standard stock solution and the linear fitting of standard curve have the greatest contribution to the uncertainty. It is suggested to select a measuring instrument with good accuracy and standardize the experimental operation and pretreatment steps.

Key words Salmon;Biogenic amine;Liquid chromatography tandem mass spectrometry;Uncertainty

三文魚(yú)是鮭科魚(yú)，主要分布在大西洋、太平洋和歐洲北極的海岸[1]。三文魚(yú)味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，不飽和脂肪酸（DHA、EPA、DPA）、蛋白質(zhì)及維生素等含量豐富[2]，有助于兒童智力發(fā)育、預(yù)防心血管疾病、降低癌癥發(fā)病率等[3]。我國(guó)冰鮮三文魚(yú)進(jìn)口量逐年增加，三文魚(yú)消費(fèi)市場(chǎng)龐大[4]。但是在貯存運(yùn)輸過(guò)程中，三文魚(yú)肌肉組織在微生物的作用下，極易發(fā)生蛋白質(zhì)的分解、腐敗變質(zhì)，產(chǎn)生生物胺等有毒代謝物[5]。生物胺是極性或半極性化合物的氮化有機(jī)堿，根據(jù)其結(jié)構(gòu)差異，可以分為3類(lèi)：脂肪族生物胺（如腐胺、尸胺、亞精胺、精胺、胍基丁胺等[6-7]）、芳香族生物胺（如酪胺、苯乙胺、苯甲胺等[8]）、雜環(huán)胺（如組胺、色胺、5-羥色胺等[9]）。

目前多種方法用于測(cè)定食品中的生物胺，如液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜[10]、高效液相色譜[11]、薄層色譜[12]、毛細(xì)管電泳[13]、氣相色譜、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜[14]、生物傳感器[15]和ELISA[16]等。其中液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法可對(duì)食品基質(zhì)中的生物胺快速準(zhǔn)確地定量分析。Nalazek-Rudnicka等[17]基于LC-MS/MS分析啤酒樣品中測(cè)定生物胺的差異，方法的檢出限和定量限分別是0.54～4.30、1.60～13.00 ng/mL，該方法靈敏度高、特異性好。Ochi[18]通過(guò)反相液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定咸鯖魚(yú)中的腐胺、色胺、酪胺、組胺、β-苯乙胺、精胺、亞精胺、尸胺，8種分析物的平均回收率均在87%～118%，對(duì)生物胺快速準(zhǔn)確進(jìn)行定量分析。Gosetti等[19]建立了一種LC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定尿液中16種生物胺，方法的檢出限和定量限分別是0.3～6.6、1.0～21.9 μg/L，平均回收率在72.9%～100.0%。

測(cè)量不確定度是說(shuō)明測(cè)量結(jié)果質(zhì)量的參數(shù)，用來(lái)表征合理、賦予被測(cè)量數(shù)值分散性[20]，用于評(píng)價(jià)測(cè)量結(jié)果的可信性、有效性、科學(xué)性，代表實(shí)驗(yàn)室測(cè)量水平[21]。但是目前評(píng)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定三文魚(yú)中生物胺的不確定度的報(bào)道較少。余曉薇等[22]通過(guò)高效液相色譜法對(duì)魚(yú)和蝦中的組胺含量進(jìn)行測(cè)定，建立組胺不確定度分析方法。胡禮淵等[23]對(duì)GB/T 20768—2006《魚(yú)和蝦有毒生物胺的測(cè)定原理》進(jìn)行不確定度評(píng)價(jià)，建立水產(chǎn)品中組胺含量不確定度評(píng)定方法。

筆者根據(jù)《測(cè)量不確定度標(biāo)示指南》和JJF 1059.1—2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》，對(duì)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定三文魚(yú)中生物胺的不確定度進(jìn)行分析，以期為三文魚(yú)中生物胺準(zhǔn)確測(cè)定提供依據(jù)，也為實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑。組胺（His）、精胺（Spe）、亞精胺（Spd）、尸胺（Cad）、腐胺（Put）、酪胺（Tyr）、色胺（Trp）均購(gòu)自Bepure公司;β-苯乙胺（Phe）、去甲基腎上腺素（Ne）標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自上海吉爾生化有限公司;丹磺酰氯（LC-MS級(jí)）購(gòu)自Sigma-Aldrich公司;乙腈（LC-MS級(jí)）、甲醇（HPLC級(jí)）、正己烷（HPLC級(jí)）均購(gòu)自Thermo fisher公司;高氯酸（分析純）、三氯乙酸（分析純）、氫氧化鈉（分析純）、碳酸氫鈉（分析純）、氨水（分析純）、鹽酸（分析純）均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器。UPLC-Xevo TQ-S超高效液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀，購(gòu)自美國(guó)Waters公司;ACQUITY UPLC HSST3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）色譜柱，購(gòu)自美國(guó)Waters公司;ZWF-110X30恒溫水浴搖床，購(gòu)自上海智城分析儀器制造有限公司;CF16RX Ⅱ離心機(jī)，購(gòu)自日本HITACHI公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。

1.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制。稱(chēng)取色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺標(biāo)準(zhǔn)品適量，用0.1 mol/L HCl配制成質(zhì)量濃度各為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于-20 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆茫４嫫跒?個(gè)月。

1.2.1.2 混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制。臨用前配制。取“1.2.1.1”儲(chǔ)備液1 mL，用0.1 mol/L HCl稀釋至100 mL，得到10 μg/mL的中間液，取標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液0、10、50、100、500、1 000、2 000 μL用0.1 mol/L HCl定容至10 mL，得到濃度為0、0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、2.00 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 樣品制備。

1.2.2.1 樣品提取。準(zhǔn)確稱(chēng)取5.0 g代表性均質(zhì)化樣品置于50 mL離心管中，加入15 mL 5%三氯乙酸溶液，渦旋1 min，超聲10 min，10 ℃下8 000 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中。殘?jiān)屑尤?0 mL 5%三氯乙酸溶液，渦旋1 min，超聲10 min，10 ℃下8 000 r/min離心5 min，合并上清液于上述離心管，待凈化。

1.2.2.2 樣品凈化。向上述試樣提取液中加入20 mL正己烷，渦旋振蕩5 min，10 ℃下8 000 r/min離心5 min，棄去上層有機(jī)相，下層試樣溶液加入20 mL正己烷再除脂一次，下層試樣溶液轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶用5%三氯乙酸溶液定容至刻度，待衍生。

1.2.2.3 樣品衍生。分別移取上述提取液和生物胺標(biāo)準(zhǔn)系列溶液各0.1 mL，置于2 mL離心管中，依次加入100 μL 飽和碳酸氫鈉溶液、20 μL 1 mol/L氫氧化鈉溶液和0.1 mL丹酰氯溶液（10 mg溶于1 mL丙酮溶液），蓋塞封口，60 ℃避光反應(yīng)25 min。反應(yīng)完畢后，加入10 μL氨水，60 ℃避光反應(yīng)15 min終止反應(yīng)，氮?dú)獯蹈珊笥靡译娑ㄈ葜? mL，過(guò)0.2 μm 聚丙烯濾膜（GHP）濾膜后，待液質(zhì)聯(lián)用儀測(cè)定。

1.2.3 色譜條件。色譜柱為Waters ACQUITY UPLC BEH Shield RP18柱（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）;流動(dòng)相A相為含0.1%甲酸的50%乙腈水溶液，B相為乙腈;柱溫30 ℃;流速0.3 mL/min，進(jìn)樣量5 μL;流動(dòng)相梯度見(jiàn)表1。

1.2.4 質(zhì)譜條件。掃描方式為電噴霧正離子（ESI+）掃描;檢測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）;毛細(xì)管電壓3.0 kV;離子源溫度120 ℃;脫溶劑氣流量1 000 L/h，脫溶劑氣溫度500 ℃，錐形氣體流速150 L/h。質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)見(jiàn)表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度的識(shí)別和來(lái)源

依據(jù)測(cè)定步驟，對(duì)三文魚(yú)中生物胺測(cè)定結(jié)果的不確定度的來(lái)源分析見(jiàn)圖1。

2.2 不確定度的分析

2.2.1 被測(cè)定物質(zhì)量濃度u（C）。標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制、稀釋以及標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性擬合是影響被測(cè)定物質(zhì)量濃度（C）帶來(lái)的不確定度的主要過(guò)程。

2.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制過(guò)程引入的不確定度u（C1）。

（1）根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)所提供的標(biāo)品純度p和純度誤差，按均勻分布考慮，由純度引入的不確定度和相對(duì)不確定度分別為u（p）=純度誤差/3、urel（p）=u（p）p，見(jiàn)表3。

（2）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱(chēng)量引入的不確定度由天平的最大允許誤差帶來(lái)，按均勻分布考慮u（m1）=0.013=0.005 77 mg、urel（m1）=u（m1）m1，見(jiàn)表4。

（3）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液定容體積引入的不確定度u（Vv）主要來(lái)源于容量允差和溫度的影響。配制標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液用到1次10 mL A級(jí)容量瓶。20 ℃ 時(shí)10 mL A級(jí)容量瓶容量允差為±0.02 mL，按三角形分布考慮，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：u（V1）=n×容量允差/6=1×0.02/6=0.008 16 mL;urel（V1）=u（V1）V標(biāo)=8.16×10-4。試驗(yàn)溫度為（20±5）℃，20 ℃時(shí)水體積膨脹系數(shù)為0.207×10-4 ?℃-1，濃鹽酸（33%）體積膨脹系數(shù)為0.455×10-4℃-1，0.1 mol/L鹽酸溶液中濃鹽酸與水的體積比8.6∶991.14，則0.1 mol/L鹽酸溶液平均體積膨脹系數(shù)為0.212×10-4 ℃-1，按溫度波動(dòng)為均勻分布，k=3，10 mL A級(jí)容量瓶由溫度引起的體積不確定度為：u（VT1）=α×ΔT×V標(biāo)×n3=0.006 12 mL;urel（VT1）=u（VT1）V標(biāo)=6.12×10-4。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液定容體積引入的不確定度為：

2.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液稀釋過(guò)程引入的不確定度u（C2）。該過(guò)程為取1 mL儲(chǔ)備液稀釋至100 mL得到10 μg/mL中間液，按均勻分布處理，玻璃器具和溫度波動(dòng)引起的不確定度見(jiàn)表6，則

2.2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度u（C3）。配制標(biāo)準(zhǔn)系列曲線溶液，濃度（以色胺為例，其余8種生物胺與色胺的處理步驟相同）分別為0.962、4.810、9.620、24.050、48.100、96.200 ng/mL，重復(fù)測(cè)定2次，以濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。向空白樣品中加入一定含量的色胺得到陽(yáng)性樣品濃度為C0，按樣品測(cè)定步驟處理后重復(fù)測(cè)定3次，其結(jié)果見(jiàn)表7。標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度的計(jì)算公式為：

綜合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制、稀釋、標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度，被測(cè)定物質(zhì)質(zhì)量濃度引入不確定度為：

2.2.2 測(cè)量重復(fù)性產(chǎn)生的不確定度u（）。測(cè)定生物胺的加標(biāo)回收率，平行測(cè)定6次，計(jì)算平均含量、標(biāo)準(zhǔn)偏差 S（），并計(jì)算回收率引入的不確定度和相對(duì)不確定度：u（）=S（）/6、urel（）=u（）/，具體見(jiàn)表9。

2.2.3 回收率產(chǎn)生的不確定度u（R）。根據(jù)測(cè)定回收率，計(jì)算平均回收率、標(biāo)準(zhǔn)偏差 S（R），并計(jì)算回收率引入的不確定度和相對(duì)不確定度：u（R）=S（R）/6、urel（R）=u（R）/R，具體見(jiàn)表10。用顯著性檢測(cè)來(lái)確定平均回收率是否與1.0有顯著性差異。檢測(cè)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)T=|1-|uR，設(shè)置信水平為95%，查表得t95（6）=2.45，9種生物胺的T值均大于t95（6），說(shuō)明差異性顯著，u（R）可以用于結(jié)果校正。

2.2.4 體積量取產(chǎn)生的不確定度u（V）。

2.2.4.1 溶劑體積量取引入的不確定度u（V溶劑）。樣品經(jīng)衍生后，氮?dú)獯蹈桑? mL乙腈定量引入u（V溶劑），按均勻分布，1 mL移液器容量帶來(lái)的不確定度為u（Vv1）=0.01/3=0.005 77 mL、urel（Vv1）=u（Vv1）V乙腈=0.005 771=0.005 77。溫度波動(dòng)引起的乙腈的體積變化帶來(lái)的不確定度按均勻分布計(jì)算得u（VT2）=α（乙腈）×5×13 =1.37×10-3×5×13=0.003 95 mL、urel（VT2）=u（VT2）V乙腈=0.003 95。溶劑體積量取引入的不確定度u（V溶劑）=u（Vv1）2+u（VT2）2=0.006 995 mL，溶劑體積量取引入的相對(duì)不確定度urel（V溶劑）=urel（Vv1）2+urel（VT2）2=0.006 995。

2.2.4.2 儀器進(jìn)樣體積引入的不確定度u（V儀器）。u（V儀器）=進(jìn)樣針容積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差/3=0.01/3=0.005 77 μL、urel（V儀器）=u（V儀器）進(jìn)樣體積=0.005 775=0.001 15;

體積量取產(chǎn)生的不確定度：u（V）=u（V溶劑）2+u（V儀器）2=0.009 07、

urel（V）=urel（V溶劑）2+urel（V儀器）2=0.007 04。

2.2.5 樣品稱(chēng)量引起的不確定度u（m）。稱(chēng)5.0 g樣品，天平最大允許誤差為±0.1 mg，假設(shè)均勻分布，u（m）=0.1/3=0.057 7 mg、urel（m）=u（m）/m=0.057 7×10-3/5.0=1.154×10-5。

2.3 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度的合成

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定三文魚(yú)中生物胺的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（X）及合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度u（X）為

2.4 擴(kuò)展不確定度

根據(jù) JJF 1059.1—2012，U=u（X）×k，k為包含因子，取p=95%的置信概率，包含因子k=2，基于UPLC-MS/MS的柱前衍生法測(cè)定三文魚(yú)中生物胺含量的結(jié)果見(jiàn)表12。

3 結(jié)論

該試驗(yàn)評(píng)價(jià)了三文魚(yú)中生物胺的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的不確定度，色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、酪胺、組胺、精胺、亞精胺、去甲基腎上腺素的含量分別為4.30±0.46、5.59±0.56、5.72±0.48、6.21±0.54、4.85±0.42、5.48±0.50、7.18±0.64、6.79±0.55、4.77±0.41 mg/kg。結(jié)果表明，試驗(yàn)操作步驟中會(huì)多方引入不確定度，分析發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制、稀釋以及標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性擬合對(duì)不確定度的貢獻(xiàn)值最大，回收率次之。在試驗(yàn)過(guò)程中，操作人員熟練水平的提升、儀器的及時(shí)維護(hù)、平行樣本測(cè)定次數(shù)的增加等方法可減小測(cè)量結(jié)果的不確定度。

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