外周血環狀RNA DLGAP4與類風濕關節炎合并心力衰竭的關系

高愛紅 田偉

(1.陜西省核工業二一五醫院心血管內科，陜西 咸陽 712000； 2.陜西省核工業二一五醫院病理科，陜西 咸陽 712000)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一類以持續性滑膜炎、全身性炎癥及自身出現抗體為特征的結締組織病[1]，在中國的發病率為0.3%～0.4%，好發于20～45歲，發展至晚期可導致關節強直和畸形，極大地影響患者的生活質量[2]。不僅如此，RA通常還會累及心血管系統，增加心血管疾病患病風險。有研究顯示，RA患者心血管死亡率是一般人群的1.5倍，其中心力衰竭(heart failure，HF)是顯著的致死因素[3]。HF作為一類心臟結構或功能受損而導致心室充盈和/或射血功能受損的綜合征，是多種心血管疾病的終末階段[4]，目前關于RA合并HF的有關研究較少。環狀RNA(circular RNA，circRNA)是一類特殊的非編碼RNA，由前體RNA可變剪接產生的一類不具有游離的5’端帽子和3’端poly(A)尾巴，以共價鍵形成環形結構的非編碼RNA分子，且不易被核酸外切酶RNaseR降解[5]。隨著研究的不斷深入發現，circRNA能通過與血管動脈粥樣性疾病[6]、癌癥[7]及自身免疫性疾病[8]等相關聯的微小RNA(miRNA)相互作用進而調控疾病的發生和發展過程，提示circRNA及其相互作用的miRNA可能成為一類新的生物標志物或治療靶點。有研究發現其能通過靶向負調控miR-143表達而改善缺血性腦卒中的損傷[9]。因此本研究通過檢測RA合并HF患者、單純RA患者及健康人外周血中circDLGAP4和miR-143水平，來分析circDLGAP4表達水平與RA合并HF的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取陜西省核工業二一五醫院2017年8月—2019年8月期間收治的RA患者42例為研究對象。男性11例，女性31例，年齡25～67歲，平均(38.9±10.8)歲。均符合美國風濕病學會修訂的RA分類標準[10]，HF診斷標準參考《美國心衰診斷及治療指南》[11]，并符合紐約心臟病學會心功能分級Ⅱ～Ⅲ級。排除標準：(1)合并系統性急慢性感染或炎癥性疾病；(2)合并惡性腫瘤；(3)合并其他自身免疫性疾病；(4)合并嚴重心、肝、腎功能不全者。另選取同期進行體檢的健康人30例為對照組，男性10例，女性20例，年齡23～70歲，平均(39.5±9.1)歲。所有入組對象均知情并簽署同意書。本研究經醫院倫理委員會審核批準。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集

RA患者于入院次日清晨(對照組于體檢時)用EDTA-K2抗凝管采集外周血3 mL，低溫條件下3 000 r/min離心10 min后收集上清，分為2份，1份保存于-20 ℃用于腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素-6(IL-6)的檢測，另1份保存于-80 ℃用于RNA表達檢測。

1.2.2 TNF-α和IL-6水平檢測

利用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測外周血中TNF-α和IL-6水平，試劑盒由上海廣銳生物科技有限公司提供，檢測過程嚴格按照試劑盒操作說明進行。

1.2.3 circDLGAP4和miR-143相對表達水平檢測

根據RNA提取試劑盒相關操作提取外周血上清中總RNA，凝膠電泳檢測RNA完整后按照反轉錄試劑盒說明書進行cDNA的合成，反轉錄體系(10 μL)：2×miRNA反應混合液5 μL，0.1%BSA 1 μL，miRNA PrimeScript?RT酶混合物1 μL，總RNA 0.5 μL，去RNA酶ddH2O 2.5 μL；反應條件設置：37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 30 min。合成cDNA后，按照實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)試劑盒說明書檢測目的基因的相對表達量，PCR體系10 μL：SYBR?Prmix Ex TapⅡ(2×)5 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，ROX Reference DyeⅡ(50×)0.2 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3 μL。詳細操作見試劑盒說明書。PCR反應參數設置：50 ℃激活聚合酶5 min，95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火和延伸34 s，反應進行40個循環。溶解曲線繪制：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，85 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，每個樣孔設置3個復孔。circDLGAP4上游引物：5’-CGAGACGGCTACTGGTTCCT-3’，下游引物：5’-GGTGGCGGGGTCTTCTTATAC-3’；miR-143上游引物：5’-GGTGCAGTGCTGCATCTCTGGT-3’，下游引物：5’-CAGAGATGCAGCACTGCACCTT-3’；內參基因GAPDH上游引物：5’-TGTTGCCATCAATGACCCCTT-3’，下游引物：5’-CTCCACGACGTACTCAGCG-3’，引物委托上海生物信息技術研究中心合成。用2-△△Ct法計算表達量，重復實驗3次。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 RA患者和對照組患者的實驗室檢測指標比較

RA組患者外周血中TNF-α和IL-6水平高于對照組，RA+HF組患者的TNF-α、IL-6水平高于RA組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 外周血中TNF-α和IL-6水平比較

2.2 RA患者和對照組患者外周血中circDLGAP4和miR-143表達水平比較

RA組患者外周血中miR-143水平高于對照組，circDLGAP4表達水平低于對照組，RA+HF組患者的miR-143水平高于RA組，circDLGAP4表達水平低于RA組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

注：a：與對照組比較，P<0.05；b：與RA組比較，P<0.05。圖1 外周血中circDLGAP4和miR-143表達水平比較

2.3 circDLGAP4表達水平與TNF-α、IL-6和miR-143水平的相關性分析

Spearman相關分析結果顯示：circDLGAP4表達水平與TNF-α、IL-6和miR-143均呈負相關(r=-0.520 7、-0.432 7和-0.756 7，P均<0.05)。見表2。

表2 circDLGAP4表達水平與TNF-α、IL-6、miR-143水平的相關性分析

2.4 circDLGAP4診斷RA合并HF的ROC分析

ROC結果顯示：circDLGAP4診斷RA合并HF的AUC為0.772，95%CI為0.621～0.923，截斷值為0.67時的敏感度為83.3%，特異度為73.3%。見圖2，表3。

表3 circDLGAP4診斷RA合并HF的效能

圖2 circDLGAP4診斷RA合并HF的ROC曲線

3 討論

RA作為一種慢性自發性自身免疫疾病，其發病機制尚未完全闡明，但目前研究表示，RA是受遺傳因素和環境因素共同作用、打破免疫系統平衡而導致的一類疾病[12]。RA患者的心血管損傷極為常見，其中HF、缺血性心臟病與RA心血管高病死率關系密切，與普通人相比RA發生HF的概率大約是其2倍[13]，但目前RA合并HF的病因及機制尚未完全闡明。由于HF的診斷多以臨床癥狀或Framingham HF標準來進行，但RA患者通常伴隨有肺部疾病或全身性疾病，而一些非特異性的水腫及呼吸困難等會被誤診為HF，心臟彩超和腦利尿鈉肽在RA合并HF的診斷有較高參考價值，但檢測較為麻煩[14-15]。因此尋找早期診斷及特異性高的血清分子標志物對RA合并HF患者的診斷及防治具有積極意義。circRNA在早期研究中被認為是一類剪接副產物或錯誤剪接而形成的一類低豐度RNA分子，但隨著高通量測序技術和生物信息學的快速發展，發現circRNA與人類基因表達關系密切，并且具有廣泛、高度穩定、時序和疾病特異性等生物學特征，提示其可能具有成為生物標志物或治療靶點的潛在價值[16]。近年來有大量研究顯示RA患者外周血單核細胞中circRNA表達異常[17]，例如Zheng等[18]利用微陣列芯片檢測技術，發現在RA患者中，有255個circRNA表達顯著上調，329個circRNA表達顯著下調，同時驗證了circRNA可能通過與下游靶基因參與到RA的氧化應激以及炎癥反應，進而促進RA病情發展。circDLGAP4是由Discs大同源物關聯蛋白家族DLGAP4基因8、9、10外顯子反向剪接而成。本研究結果顯示，RA組患者外周血中miR-143水平明顯升高，而circDLGAP4水平顯著降低，合并HF患者的外周血中miR-143水平以及circDLGAP4水平變化更顯著，提示下調表達的circDLGAP4可能與RA合并HF密切相關。對外周血中炎性細胞因子TNF-α和IL-6水平檢測發現，RA合并HF患者的TNF-α和IL-6水平顯著高于單純RA患者，可能是因為高水平的TNF-α和IL-6能誘導內皮功能障礙，介導炎癥性血管損傷，并保持促炎癥狀態，影響心肌功能從而增加HF發生風險。Yang等[19]研究表明，RA患者滑膜組織中miR-143表達水平顯著升高，通過抑制miR-143表達能降低TNF-α處理刺激而導致Ras-MAPK信號通路激活。本研究初步推測circDLGAP4可能通過靶向負調控miR-143表達，調控下游炎癥信號通路相關基因蛋白的表達，進而抑制RA引起的慢性炎癥反應，降低HF發生的風險。Spearman相關性分析結果也證實了circDLGAP4表達水平與TNF-α、IL-6和miR-143均呈負相關，提示circDLGAP4降低可能與RA并發HF相關。為了進一步驗證circDLGAP4診斷RA并發HF的價值，本研究采取了ROC分析，結果顯示circDLGAP4診斷RA并發HF的AUC為0.772，具有一定的診斷效能，提示其具有成為RA并發HF分子標志物的潛力。

綜上所述，本研究初步探索了外周血circDLGAP4表達水平與RA合并HF的關系，推測其可能通過靶向負調控miR-143而抑制體內炎癥反應從而減少RA合并HF的發生風險，但本研究只對外周血中circDLGAP4表達水平進行了分析，在滑膜組織中circDLGAP4表達水平與RA合并HF的關系是否與外周血中表達水平一致，還需進一步研究證實。